利用CMV啟動子構(gòu)建PRRSV感染性克隆的研究

徐彥召，王　青，胡建和，余　娟，陳仕均

(河南科技學院 動物科學學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

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利用CMV啟動子構(gòu)建PRRSV感染性克隆的研究

徐彥召，王青，胡建和，余娟，陳仕均

(河南科技學院 動物科學學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

[摘要]【目的】 建立一種利用CMV啟動子獲得拯救豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的方法，為進一步研究豬繁殖與呼吸綜合征病毒提供操作平臺?！痉椒ā?根據(jù)PRRSV的基因序列特征和CMV啟動子的序列特征，對pBluescprict Ⅱ SK(+)載體進行多克隆序列改造；設計特異性引物，分6段擴增、組裝出PRRSV的全長cDNA并擴增CMV真核啟動子序列；采用酶切、連接、轉(zhuǎn)化等方法將連接成功病毒的全長cDNA置于CMV真核啟動子序列的下游，獲得含有CMV啟動子和豬繁殖與呼吸綜合征病毒CH-1A株全長cDNA克隆的重組質(zhì)粒pSK-CH-1A；再將重組質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染MARC-145宿主細胞，得到豬繁殖與呼吸綜合征病毒CH-1A株病毒的拯救病毒?！窘Y(jié)果】 成功獲得了19 112 bp含CH-1A全長cDNA的pSK-CH-1A載體，將其直接轉(zhuǎn)染MARC-145宿主細胞后，經(jīng)細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)錄合成病毒基因組RNA，獲得了拯救病毒(rCH-1A)；病毒生長特性試驗結(jié)果顯示，拯救病毒與親本病毒在MARC-145細胞上具有相似的增殖特性，且拯救病毒序列含有不同于親本病毒的分子標記MluⅠ酶切位點?！窘Y(jié)論】 建立了一種方法簡單，操作方便，節(jié)約時間和成本的PRRSV感染性cDNA克隆的體外拯救方法。

[關(guān)鍵詞]豬繁殖與呼吸綜合征病毒；CMV啟動子；感染性克隆

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是目前危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病病原之一，該病毒屬于套式病毒目(Nidovirale)，動脈炎病毒科(Arteriviridae)，動脈炎病毒屬(Arterivirus)。研究者通過對PRRSV全基因組序列分析，將其分成2種基因型，即歐洲型(genotype Ⅰ)和美洲型(genotypeⅡ)，我國的流行毒株(包括高致病性PRRSV)為美洲型[1-2]。這2種基因型PRRSV都能夠引起以母豬的繁殖障礙(如：流產(chǎn)、早產(chǎn)和死胎等)和各年齡段豬的呼吸道癥狀為主要特征的臨床疾病。2006年，我國南方豬群中暴發(fā)了以發(fā)病急、傳播快、高發(fā)病率和死亡率等為特征的高致病性豬繁殖與呼吸綜 合征(High pathogenic PRRS，HP-PRRS)，使得PRRSV成為近年來研究的熱點[3-5]。PRRSV基因組結(jié)構(gòu)與同屬的其他動脈炎病毒類似，屬于單股正鏈RNA病毒，基因組依次為5′-(cap)UTR-ORF1a-ORF1b-ORF2-7-UTR-poly(A)-3′[6-7]。

科研工作者要進行病毒(尤其是RNA病毒)基因組結(jié)構(gòu)和功能、病毒與宿主的相互關(guān)系、病毒毒力增強機制等方面的研究，首先需要構(gòu)建該病毒反向遺傳學操作平臺，即得到該病毒的感染性全長cDNA克隆。在PRRSV感染性克隆構(gòu)建過程中，早期研究主要采取將含有PRRSV基因組全長cDNA的克隆置于原核轉(zhuǎn)錄啟動子(如：噬菌體T7、SP6啟動子)下建立病毒的拯救體系，這樣的設計在操作上存在很多局限性[8-12]。為此，本試驗將PPRSV基因組全長cDNA置于真核啟動子CMV下，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pSK-CH-1A，將其直接轉(zhuǎn)染MARC-145細胞，通過宿主細胞自身的轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出PRRSV全基因組RNA，進而翻譯出病毒所需的全部蛋白，最終拯救出病毒，以期縮短病毒拯救的時間，同時降低病毒拯救的成本。

1材料與方法

1.1材料

病毒株、細胞及載體：PRRSV CH-1A毒株、MARC-145細胞、pBluescriptⅡSK(+)和pEGFP-C3真核表達載體以及大腸桿菌DH5α，均由河南科技學院預防獸醫(yī)學實驗室保存。

主要試劑：RNA提取試劑盒為QIAGEN公司(美國)產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝DNA回收試劑盒購自OMEGA公司；PfuUltraⅡ Fusion HS DNA Polymerase購自Stratagene公司(美國)；SupersciptⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶、抗鼠熒光抗體和脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑為Invitrogen公司(美國)產(chǎn)品；T4 DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶PacⅠ和SbfⅠ、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、rTaq酶、dNTP、DL-2000 DNA Marker和DL-15000 DNA Marker均為TaKaRa公司(中國)產(chǎn)品；胎牛血清、高糖的DMEM培養(yǎng)基為GIBCO公司(美國)產(chǎn)品；抗PRRSV N 蛋白抗體為IDEXX公司PRRSV抗體檢測試劑盒中陽性對照樣品，其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2pBluescript Ⅱ SK(+)載體的改造

運用分子生物學軟件DNAstar對GenBank中PRRSV CH-1A株全基因組序列(GenBank登錄號：AY032626)和CMV真核啟動子序列(GenBank登錄號：U57607)進行分析，對pBluescriptⅡ SK(+)的多克隆位點區(qū)(MCS)進行改造，改造后的MCS中酶切位點的順序為XhoⅠ-PacⅠ-CMV-SbfⅠ-AfeⅠ-AflⅡ-NheⅠ-AscⅠ-MluⅠ-SwaⅠ-NotⅠ。將改造好的載體送上海生工生物工程有限公司進行測序分析，陽性載體命名為pSK-MSC。

1.3CMV真核啟動子序列的克隆及pSK-CMV載體的構(gòu)建

取上述PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定，并純化回收。將回收后的CMV啟動子序列和pSK-MSC載體分別用限制性內(nèi)切酶PacⅠ和SbfⅠ進行雙酶切，分別回收目的片段，然后將二者用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌感受肽DH5α，挑取單菌落，送往上海生工生物工程有限公司進行測序驗證。將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pSK-CMV。

1.4PRRSV全基因組序列引物設計與合成

為了獲得根據(jù)CH-1A株P(guān)RRSV全基因組cDNA序列，本研究根據(jù)GenBank中PRRSV全基因組序列，用Primer 5.0軟件設計了6對涵蓋PRRSV全基因組序列(片段A-F)的引物，均由上海英駿生物工程公司合成，引物序列見表1。

表 1　CH-1A株P(guān)RRSV全基因組cDNA片段擴增引物Table 1　Oligonucleotide primers used to amplify whole genome cDNA of PRRSV

注：引物Ch-1-UP和Ch-6-DP下劃線標記的序列分別為SbfⅠ、SwaⅠ和NotⅠ酶切位點序列；引物Ch-5-DP和Ch-6-UP方框中的堿基為突變后產(chǎn)生MluⅠ酶切位點的堿基，下劃線標記的序列為突變后產(chǎn)生的MluⅠ酶切位點序列。

Note：The underlined sequences Ch-1-UP and Ch-6-DP are cleavage sites ofSbfⅠ,SwaⅠ,andNotⅠ.The underlined sequences Ch-5-DP and Ch-6-UP are cleavage sites ofMluⅠ,mutant sites are shown in box.

1.5PRRSV CH-1A株全長cDNA克隆

1.5.1cDNA分段擴增將CH-1A株接種于MARC-145細胞，待80% MARC-145細胞發(fā)生病變致脫落時，收獲細胞及細胞培養(yǎng)液，并將其凍融3次后，12 000 r/min 離心3 min，去除細胞碎片，取上清液備用。按照RNA提取試劑盒操作說明書提取上清液中CH-1A株總RNA。

參照Superscipt Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)品說明書，以每個片段下游引物(表1)為反轉(zhuǎn)錄引物，合成第一鏈cDNA。PCR擴增參照Pfu DNA聚合酶產(chǎn)品說明進行。每個PCR反應體系為50 μL，其中包括10×pfx擴增緩沖液5 μL，10 mmol/L dNTP混合物1.5 μL，50 mmol/L MgSO41 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.5 μL，cDNA 2 μL，補充滅菌水至50 μL。反應條件為:94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，退火(退火溫度見表1) 30 s，72 ℃ 2.5 min，循環(huán)30次；最后于72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.5.2全長cDNA連接將1.5.1節(jié)擴增得到的各片段PCR產(chǎn)物按膠回收試劑盒操作說明進行純化，按圖1所示的酶切位點進行酶切，先分別連入pSK-CMV載體，得到的重組質(zhì)粒命名為pSK-A(B/C/D/E/F)，再按圖1所示流程將各個片段通過相應的酶切位點逐一連接，最終獲得含有PRRSV CH-1A株全長基因組cDNA的pSK-CH-1A質(zhì)粒。全長cDNA組裝過程中所用的連接酶均為T4 DNA連接酶，16 ℃過夜連接。連接產(chǎn)物均轉(zhuǎn)化E.coliDH5α細胞，挑取單克隆，搖菌并提取質(zhì)粒DNA，進行PacⅠ和NheⅠ雙酶切以及MluⅠ單酶切，產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析。將酶切后與預期長度相符泳帶對應的質(zhì)粒送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.6拯救病毒 rCH-1A的構(gòu)建與體外傳代

采用去內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒提取含有PRRSV CH-1A株全長基因組序列的pSK-CH-1A載體，根據(jù)脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，在MARC-145細胞融合度為70%～80%時進行轉(zhuǎn)染操作。在轉(zhuǎn)染后約60 h收取轉(zhuǎn)染細胞，凍融3次，12 000 r/min 離心2 min，去除細胞碎片，上清液即為獲得拯救病毒(rCH-1A)的病毒液。

將rCH-1A病毒液接種于MARC-145細胞傳代，具體操作如下：在感染前一天，將狀態(tài)良好的MARC-145細胞接種于細胞瓶中，待細胞融合度達到80%～90%(約需12 h)進行病毒的接種傳代。將第2代拯救病毒rCH-1A接種到MARC-145細胞，每天觀察細胞病變(CPE)情況，試驗同時設感染親本病毒CH-1A和空白的MARC-145細胞為對照。

圖 1　PRRSV CH-1A株基因組全長cDNA的組裝Fig.1　Assembly of the full-length cDNA clone of PRRSV strain CH-1A

1.7拯救病毒rCH-1A的鑒定

1.7.1拯救病毒分子標記的檢測為了區(qū)別拯救病毒rCH-1A和親本病毒CH-1A，在克隆CH-1A株P(guān)RRSV cDNA時，通過基因同義突變的方式在其基因組序列中引入了新的MluⅠ酶切位點，故可據(jù)此來鑒別rCH-1A和CH-1A。取3代拯救病毒rCH-1A，提取其RNA，以之為模板，對突變的MluⅠ 酶切位點周圍序列進行RT-PCR擴增(引物F14436:5′-GCGTTTTCCATTACCTATAC-3′和R14868:5′-CCTGTTTAACAGCTTTTCTG-3′，由上海英駿生物工程公司合成)。RT-PCR反應的體系和程序參見1.5.1節(jié)進行?；厥誖T-PCR擴增產(chǎn)物進行MluⅠ酶切，取10 μL酶切反應產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。試驗同時設親本病毒CH-1A作為陽性對照，空白的MARC-145細胞作為陰性對照。

1.7.2拯救病毒rCH-1A的間接免疫熒光檢測將拯救病毒rCH-1A接種到鋪滿單層的MARC-145 細胞，按常規(guī)步驟進行間接免疫熒光試驗(IFA)檢測。IFA檢測用PRRSV N蛋白抗體進行鑒別。試驗同時設親本病毒CH-1A作為陽性對照，空白的MARC-145細胞作為陰性對照。

1.7.3拯救病毒rCH-1A半數(shù)細胞感染量(TCID50)測定拯救病毒TCID50采用96孔組織培養(yǎng)板法測定。將拯救病毒rCH-1A接種MARC-145細胞，每隔12 h觀察感染病毒后的細胞生長狀態(tài)，并記錄培養(yǎng)板中出現(xiàn)CPE的孔數(shù)，感染病毒細胞停止出現(xiàn)CPE時即終止觀察。病毒TCID50的測定結(jié)果按Reed-Muench法[9]計算。同時檢測親本病毒CH-1A的TCID50。

1.7.4拯救病毒rCH-1A多步生長曲線測定以100×TCID50病毒感染劑量,將第5代rCH-1A感染MARC-145細胞，并在病毒感染后的不同時間點12，24，36，48，60，72，84和96 h收集300 μL細胞上清液進行病毒滴度測定。病毒滴度參考缺失拯救病毒細胞的半數(shù)細胞感染量(TCID50)測定。最后以感染后時間為橫坐標，以該時間測得病毒TCID50為縱坐標繪制出該病毒的多步生長曲線。同時測定其親本病毒CH-1A的多步生長曲線，比較拯救病毒與其親本病毒在MARC-145細胞上的生長特性差異。

2結(jié)果與分析

2.1pBluescript Ⅱ SK(+)載體的改造及pSK-CMV載體的鑒定

對改造后的pBluescriptⅡ SK(+)載體進行測序，與預期結(jié)果一致，圖2為改造后多克隆位點的測序結(jié)果?？寺〕鯟MV啟動子序列，將其和pSK-MSC連接，測序驗證正確，將其命名為pSK-CMV。

圖 2　pSK-MSC多克隆位點的測序結(jié)果Fig.2　Sequencing of multiple cloning sites of pSK-MSC plasmid

2.2PRRSV CH-1A株全基因組分段擴增

PRRSV CH-1A株全基因組的分段擴增結(jié)果見圖3。由圖3可知，經(jīng)RT-PCR擴增，獲得了PRRSV CH-1A株全基因組6個片段，各片段長度分別為2 227 bp(片段A)、4 549 bp(片段B)、1 242 bp(片段C)、4 363 bp(片段D)、2 853 bp(片段E)和674 bp(片段F)，均與預期結(jié)果相符。

2.3PRRSV CH-1A株全長cDNA的組裝

對pSK-CH-1A質(zhì)粒進行限制性內(nèi)切酶PacⅠ和NheⅠ雙酶切鑒定以及MluⅠ單酶切鑒定，結(jié)果雙酶切獲得了8 521 bp和10 691 bp的片段，單酶切獲得了19 112 bp的片段(圖4)，說明成功構(gòu)建了PRRSV CH-1A株全長cDNA克隆，且該cDNA克隆具有突變的MluⅠ酶切位點。

圖 3　PRRSV CH-1A株全基因組的分段擴增結(jié)果 M.DNA Marker;1～6.分別代表病毒基因組片段A～FFig.3　Segmented amplification of PRRSV genome of CH-1A strain M.DNA Marker;1-6.Represent virus genome segment A-F,respectively 圖 4　pSK-CH-1A質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果 M.DNA Marker;1.pSK-CH-1A質(zhì)粒PacⅠ和 NheⅠ雙酶切 結(jié)果；2.pSK-CH-1A質(zhì)粒的MluⅠ單酶切結(jié)果Fig.4　Restriction enzyme digestion results of recombinant plasmid pSK-CH-1A M.DNA Marker;1.pSK-CH-1A plasmid double digested by PacⅠandNheⅠ;2.pSK-CH-1A plasmid digested by MluⅠ

2.4拯救病毒rCH-1A致細胞病變能力的檢測

將第2代拯救病毒rCH-1A接種到MARC-145細胞，觀察CPE出現(xiàn)情況，結(jié)果(圖5)顯示，拯救病毒 rCH-1A感染MARC-145細胞36～48 h后，細胞出現(xiàn)聚堆、變圓，甚至脫落等CPE現(xiàn)象，與其親本病毒CH-1A產(chǎn)生的CPE一致。

2.5拯救病毒rCH-1A分子標記基因的MluⅠ酶切鑒定

結(jié)果(圖6)顯示，親本病毒CH-1A的RT-PCR擴增產(chǎn)物不能被MluⅠ識別，拯救病毒rCH-1A的RT-PCR擴增產(chǎn)物能被MluⅠ消化成2段，未感染病毒的空白MARC-145細胞沒有出現(xiàn)條帶。

2.6拯救病毒rCH-1A的IFA分析

IFA檢測結(jié)果(圖7)表明，抗PRRSV N 蛋白單克隆抗體均能和親本病毒CH-1A、拯救病毒rCH-1A感染后的MARC-145細胞發(fā)生特異性反應(可觀察到特異性熒光)，而空白MARC-145細胞不能與抗PRRSV N蛋白抗體發(fā)生特異性反應。

圖 7拯救病毒rCH-1A的IFA檢測結(jié)果

A.IFA檢測親本病毒CH-1A；B.IFA檢測拯救病毒rCH-1A；C.陰性對照

Fig.7Identification of rescued virus in MARC-145 cells by IFA test

A.IFA test of parental CH-1A PRRSV；B.IFA test of rCH-1A PRRSV；C.Negative control

2.7拯救病毒rCH-1A的TCID50測定

檢測結(jié)果顯示：CH-1A TCID50為10-5.47/mL， rCH-1A TCID50為10-6/mL，可見拯救病毒和其親本病毒的TCID50基本一致。

2.8拯救病毒rCH-1A的多步生長曲線分析

由圖8可知，拯救病毒rCH-1A與其親本病毒CH-1A在MARC-145細胞的生長特性基本一致。

圖 8　拯救病毒rCH-1A與其親本病毒 CH-1A的多步生長曲線比較Fig.8　Viral growth of rCH-1A and CH-1A

3討論

RNA病毒感染性克隆是指通過體外構(gòu)建出病毒的cDNA(互補DNA)分子克隆，進而在DNA分子水平上對病毒基因組進行人工操作，再通過轉(zhuǎn)染易感細胞在體外拯救出具有感染性病毒粒子。通過構(gòu)建RNA病毒感染性克隆的構(gòu)建，研究者就可以直接精確地改造病毒基因的精細結(jié)構(gòu)，從而確定這些變化對表型性狀的直接影響。對RNA病毒而言，這樣的操作可以使原來對RNA的操作轉(zhuǎn)變?yōu)閷NA的操作，完全克服RNA體外不穩(wěn)定、易降解等缺點。通過構(gòu)建病毒的反向遺傳操作平臺，研究者可以開展針對病毒基因組表達調(diào)控機制、病毒致病的分子機理等研究，還可以通過對病毒基因組結(jié)構(gòu)的研究得到減毒毒株或開發(fā)新型基因標記的疫苗。截止到目前，大多數(shù)病毒的反向遺傳操作平臺已經(jīng)構(gòu)建成功，并利用建立的反向遺傳操作系統(tǒng)開展了很多相關(guān)的研究，取得很多研究成果[13]。

PRRSV作為目前危害養(yǎng)豬業(yè)比較嚴重的RNA病毒中重要的一員，對其深入研究在很大程度上依賴于病毒感染性cDNA的構(gòu)建。1998年Meulenberg等[14]建立了第一個歐洲型LV株P(guān)RRSV的反向遺傳學操作平臺；2003年，美洲型代表株VR-2332的PRRSV反向遺傳學技術(shù)平臺也成功建立[15]。隨后國內(nèi)外陸續(xù)有不同來源的PRRSV反向遺傳技術(shù)平臺被成功建立[16]。PRRSV反向遺傳操作系統(tǒng)經(jīng)典的構(gòu)建策略是：首先將PRRSV全基因組通過反轉(zhuǎn)錄PCR的方法分段得到病毒cDNA，然后將獲得的各個基因片段克隆到合適的載體中，再通過合適的酶切位點將各個基因片段在體外連接裝配出含有PRRSV 全基因組的克隆載體，并通過大腸桿菌擴增該陽性克隆。其次，將克隆得到的含PRRSV基因組全長cDNA的克隆載體置于強的轉(zhuǎn)錄啟動子(如：噬菌體T7、SP6啟動子)下，以便于在體外獲得PRRSV基因組RNA。再次，通過體外轉(zhuǎn)錄獲得PRRSV基因組RNA，并通過轉(zhuǎn)染BHK-21細胞或MARC-145細胞進行病毒的拯救。目前，PRRSV反向遺傳操作平臺的建立大多采用這種方法。該方法需要體外轉(zhuǎn)錄才能得到病毒的全基因組RNA。由于體外RNA的不穩(wěn)定性和體外RNA聚合酶保證度等問題，采用此方法有可能造成試驗的失敗或者得出與試驗設計不一致的結(jié)果[12,17]。因此研究者在探索能否使用細胞體內(nèi)的RNA酶系統(tǒng)，直接在細胞內(nèi)部獲得病毒的基因組RNA，進而克服上述操作的缺點[17-18]。本研究首先對目標克隆載體進行改造，使目標載體獲得RNA聚合酶驅(qū)動的CMV強啟動子以及相關(guān)轉(zhuǎn)錄元件序列，進而將PRRSV全基因組置于改造好的框架載體，通過真核轉(zhuǎn)染的方式使PRRSV全基因組靶細胞依靠載體中的CMV強啟動子以及轉(zhuǎn)錄相關(guān)元件序列獲得病毒的全基因組RNA，進而完成病毒的拯救過程。用此框架載體構(gòu)建感染性克隆，只需要轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒就可以啟動轉(zhuǎn)錄，操作簡單方便，同時節(jié)省時間和成本，提高了病毒拯救的效率。

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DOI：網(wǎng)絡出版時間:2016-06-0816:2110.13207/j.cnki.jnwafu.2016.07.008

[收稿日期]2014-11-01

[基金項目]國家自然科學基金項目(31402208)；河南省科技攻關(guān)項目(162102110037)

[作者簡介]徐彥召(1984-)，男，河南許昌人，講師，博士，主要從事分子病原學與免疫學研究。

[中圖分類號]S852.659.6

[文獻標志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)07-0050-07

Construction of infectious clone of porcine reproductive and respiratory syndrome virus using CMV promoter

XU Yanzhao,WANG Qing,HU Jianhe,YU Juan,CHEN Shijun

(DepartmentofAnimalScience,HenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang,Henan453003,China)

Abstract:【Objective】 A method to rescue porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) using CMV promoter was established to provide operation platform to future study on PRRSV. 【Method】 According to the sequence characteristics of PRRSV and CMV promoter,multiple cloning sequences of pBluescprict Ⅱ SK(+) were modification.Virus full-length cDNA and CMV eukaryotic promoter sequences were then amplified by six pairs of specific designed primers.Enzyme digestion,connection,and transformation were used to recombinant plasmid pSK-CH-1A,which contained CMV promoter and virus full-length cDNA downstream.Then,the recombinant plasmid was transfected into the host cell MARC-145 to obtain rescue virus for CH-1A strain of PRRSV.【Result】 The transcription of viral genomic RNA was synthesized and the infectious virus was rescued after the full-length cDNA clone of pSK-CH-1A containing 19 112 bp was directly transfected into MARC-145 cells.The virus growth characteristics test showed that the rescued virus was similar to parental virus in MARC-145 cells and it could be distinguished from the parental by the mutant genetic marker of MluⅠ enzyme site.【Conclusion】 A simple,convenient,time-saving and low-cost method for constructing infectious cDNA clone of PRRSV was established.

Key words:porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV);CMV promoter;infectious clone

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