新城疫病毒HN蛋白酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建及鑒定

胡湘云，高小龍，付向晶，王燕平，劉丹丹，常旭東，劉　蓬，杜恩岐，王興龍，黨如意，楊增岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌712100)

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新城疫病毒HN蛋白酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建及鑒定

胡湘云，高小龍，付向晶，王燕平，劉丹丹，常旭東，劉蓬，杜恩岐，王興龍，黨如意，楊增岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌712100)

[摘要]【目的】 應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)構(gòu)建新城疫病毒的血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)蛋白線性中和表位區(qū)的誘餌載體pGBKT7-HN-neu，為篩選靶向新城疫病毒HN蛋白的中和性納米抗體奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?合成HN蛋白的線性中和表位區(qū)HN-neu，將其克隆至酵母雙雜交系統(tǒng)誘餌載體pGBKT7中，構(gòu)建誘餌載體pGBKT7-HN-neu，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證正確后，將pGBKT7-HN-neu轉(zhuǎn)化酵母菌Y2H Gold，檢測(cè)其在酵母細(xì)胞中的毒性和自激活作用?！窘Y(jié)果】 成功合成了HN-neu，構(gòu)建的pGBKT7-HN-neu在酵母細(xì)胞Y2H Gold中無毒性和自激活能力?！窘Y(jié)論】 成功構(gòu)建了誘餌載體pGBKT7-HN-neu。

[關(guān)鍵詞]新城疫病毒；HN蛋白；酵母雙雜交系統(tǒng)；誘餌載體

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一種禽類急性、高度接觸性、致死性傳染病，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一[1]。NDV 屬于副粘病毒科禽腮腺炎病毒屬，為單股負(fù)鏈 RNA 病毒[2]。NDV基因組包含 6個(gè)開放閱讀框架(ORF)，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)和大蛋白(L)，其編碼基因排列順序是 3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，其中HN是位于NDV病毒粒子表面囊膜上的一種纖突蛋白，是病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的必需成分之一[3]。HN具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶2種活性，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體，在機(jī)體抗感染免疫中起著重要作用，尤其是其中和表位是免疫保護(hù)作用的核心靶點(diǎn)，是研究和控制新城疫的最佳切入點(diǎn)[4]。相關(guān)研究顯示，新城疫病毒HN結(jié)構(gòu)蛋白的一個(gè)潛在線性中和表位區(qū)為346-353aa(DEQDYQIR)[5-8]，其氨基酸序列在一級(jí)結(jié)構(gòu)上是連續(xù)的，可以在體外模擬。

近年來，隨著基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，一種新型抗體——重鏈抗體重鏈可變區(qū)(Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody,VHH)的出現(xiàn)逐漸引起科研工作者的關(guān)注[9]，其抗原結(jié)合位點(diǎn)僅由重鏈的可變區(qū)VHH單結(jié)構(gòu)域形成，且高度僅為4.8 nm左右，直徑僅為2.2 nm左右，故又被稱為納米抗體(Nanobodies,Nbs)。由于納米抗體的單域性質(zhì)使其較普通抗體具有一些獨(dú)特的性質(zhì)，如易于表達(dá)、高水溶性和穩(wěn)定性、能識(shí)別獨(dú)特的構(gòu)造表位、具有較高的親和力、免疫原性低等，因此成為抗體研究的熱點(diǎn)[10]。目前主要利用噬菌體表面展示技術(shù)、酵母雙雜交技術(shù)和核糖體展示技術(shù)進(jìn)行納米抗體的研究。酵母雙雜交技術(shù)作為驗(yàn)證蛋白互作的主流技術(shù)，也可用來鑒定抗原抗體的反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)已成功構(gòu)建雙峰駝免疫酵母雙雜交納米抗體文庫，并篩選出靶向圓環(huán)病毒的納米抗體[11]。

本研究以新城疫病毒HN蛋白的線性中和表位區(qū)為研究對(duì)象，將其與酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)重組在一起構(gòu)建酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-HN-neu，并對(duì)構(gòu)建的誘餌載體進(jìn)行毒性和自激活活性檢測(cè)，以期從新城疫酵母雙雜交納米抗體文庫中篩選靶向HN蛋白的納米抗體。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑SD/-Trp、DDO(-Trp-Leu)、QDO(-Trp-Leu-His-Ade)選擇性培養(yǎng)基、YPDA培養(yǎng)基、50% PEG 3350、10×TE、10×LiAC、9 g/L NaCl溶液、Yeastmaker Carrier DNA、3 mol/L醋酸鈉溶液、X-α-Gal及Aureobasidin A等試劑均購自Clontech；二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma；瓊脂糖購自Invitrogen；EcoRⅠ、SalⅠ核酸限制性內(nèi)切酶購自Fermentas；2K plus DNA Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA；凝膠回收試劑盒購自TIANGEN。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.2菌株、毒株、載體及文庫Y2H Gold酵母菌及pGADT7-T、pGBKT7、pGBKT7-Lam、pGBKT7-53載體均購自Clontech公司。DH5α感受態(tài)細(xì)胞、雙峰駝新城疫病毒酵母雙雜交納米抗體文庫均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建與保存。

1.2方法

1.2.1線性中和表位區(qū)的合成根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的NDV LaSota株 HN基因序列，并參考文獻(xiàn)[5-8]報(bào)道的HN潛在線性中和表位(epitope)的氨基酸序列(DEQDYQIR)，設(shè)計(jì)一段由linker(GGGS)串聯(lián)的線性中和表位片段，命名為HN-neu，在該片段首端、末端分別引入EcoRⅠ、SalⅠ 酶切位點(diǎn)，片段序列為：5′-GAATTCGGTGGTGGTTCCGATGA ACAGGATTACCAAATCC-GTGGTGGTGGTTCCGATGAACAGGATTACC-AAATCCGTGGTGGTGGTTCCGATGAACAGG-ATTACCAAATCCGTTAAGTCGAC-3′，5′和3′端下劃線部分分別為EcoRⅠ、SalⅠ酶切位點(diǎn)。片段由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2誘餌載體pGBKT7-HN-neu的構(gòu)建將合成的帶中和表位區(qū)的質(zhì)粒HN-neu和pGBKT7載體分別用EcoRⅠ、SalⅠ進(jìn)行雙酶切，用膠回收試劑盒回收切出的目的條帶，用 T4連接酶于16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物使用YC法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于LB固體平板(含100 mg/mL卡那霉素)培養(yǎng)，直到有菌落出現(xiàn)，挑單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(含100 mg/mL卡那霉素)中，于37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，按質(zhì)粒提取試劑盒操作步驟說明提取質(zhì)粒，進(jìn)行EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定，將鑒定呈陽性的質(zhì)粒送南京金斯瑞公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒即為誘餌載體，命名為pGBKT7-HN-neu。

1.2.3誘餌載體對(duì)Y2H Gold 酵母菌的轉(zhuǎn)化用PEG/LiAC方法制備酵母感受態(tài)細(xì)胞，將凍存的Y2H Gold酵母菌劃線接種至YPDA平板，于30 ℃倒置培養(yǎng)3 d，挑取直徑為2～3 mm的單菌落于3 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)8～12 d，取20 μL接種于50 mL YPDA培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，30 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)16～20 h。當(dāng)OD600為0.15～0.30時(shí)，700g離心5 min，棄上清，沉淀重懸于100 mL YPDA中，30 ℃孵化3～5 h直到OD600為0.40～0.50。 將上述100 mL培養(yǎng)液分裝至2個(gè)50 mL無菌錐形瓶，室溫700g離心5 min，棄上清，每管用30 mL滅菌蒸餾水重懸，室溫700g離心5 min，棄上清，每管用1.5 mL 1.1×TE/LiAC重懸，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液到2個(gè)1.5 mL EP管中，12 000 r/min離心15 s，棄去上清，每管用600 μL 1×TE/LiAC重懸細(xì)胞，即得酵母感受態(tài)細(xì)胞。

將100 ng誘餌載體pGBKT7-HN-neu、5 μL Yeastmaker Carrier DNA(10 μg/μL，沸水加熱10 min后置于冰上備用)、50 μL酵母感受態(tài)細(xì)胞和500 μL PEG/LiAC溶液混合在一起，同時(shí)設(shè)空載體pGBKT7對(duì)照?；旌虾鬁u旋振蕩10 s，30 ℃培養(yǎng)箱中孵育45 min，每隔15 min混勻1次，加入160 μL DMSO混勻，42 ℃熱激20 min，每隔10 min混勻1次，室溫700g離心5 min，棄去上清，收集菌體。用100 μL 0.9%氯化鈉溶液重懸菌體，涂布SD/-Trp營養(yǎng)選擇性固體平板，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d。

1.2.4誘餌載體的自激活作用檢測(cè)吸取100 μL上述轉(zhuǎn)化pGBKT7-HN-neu的Y2H Gold酵母菌液3份，分別均勻涂布SD/-Trp平板、SD/-Trp/X-α-Gal 平板和SD/-Trp/AbA/X-α-Gal平板，30 ℃培養(yǎng)3～5 d。觀察酵母菌生長情況，直到有菌落長出，檢測(cè)誘餌蛋白是否具有自激活作用。試驗(yàn)同時(shí)設(shè)空載體pGBKT7對(duì)照(培養(yǎng)基為SD/-Trp)、陽性載體pGBKT7-53+pGADT7-T對(duì)照(培養(yǎng)基為DDO/-Trp-Leu/AbA/X-α-Gal)和陰性載體pGBKT7-lam+pGADT7-T對(duì)照(培養(yǎng)基為DDO/-Trp-Leu/AbA/X-α-Gal)。

1.2.5誘餌載體的毒性檢測(cè)從SD/-Trp平板上分別挑取已轉(zhuǎn)化成功的pGBKT7-HN-neu和空載體pGBKT7的Y2H Gold單克隆接種于5 mL SD/-Trp(含50 μg/mL卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，30 ℃下220 r/min振蕩培養(yǎng)16～20 h，分別于0，4，8，12，16和20 h取樣，用紫外光分光光度計(jì)測(cè)其在600 nm波長下的吸光度(OD600)值，檢驗(yàn)誘餌蛋白是否有毒性。若OD600<0.8，說明重組誘餌載體pGBKT7-HN-neu對(duì)Y2H Gold酵母細(xì)胞可能有毒性，反之則沒有毒性。

2結(jié)果與分析

2.1誘餌質(zhì)粒pGBKT7-HN-neu的鑒定

重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-HN-neu用EcoRⅠ 和SalⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，得到123 bp的目的條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果一致。DNA序列分析結(jié)果與設(shè)計(jì)的序列完全一致，表明誘餌重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖 1　誘餌載體pGBKT7-HN-neu的酶切鑒定 M.2K plus DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1. 誘餌載體pGBKT7-HN-neu 酶切產(chǎn)物Fig.1　Identification of pGBKT7-HN-neu by restriction enzyme digestion M.2K plus DNA Marker;1.Product from pGBKT7-HN-neu digested with EcoRⅠ and SalⅠ

2.2誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Y2H Gold 酵母菌

將轉(zhuǎn)有pGBKT7-HN-neu誘餌質(zhì)粒的Y2H Gold菌涂布于SD/-Trp營養(yǎng)選擇性固體平板，3～5 d后有白色菌落生長，說明誘餌質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)化到Y(jié)2H Gold酵母中。

2.3誘餌載體的自激活作用

誘餌載體的自激活作用檢測(cè)結(jié)果見表1。由表1可知，轉(zhuǎn)化pGBKT7-HN-neu的Y2H Gold在SD/-Trp平板和SD/-Trp/X-α-Gal 平板上長出白色菌落，在SD/-Trp/AbA/X-α-Gal平板上無菌落生長；空載體pGBKT7對(duì)照平板上長出白色菌落，陽性載體pGBKT7-53+pGADT7-T對(duì)照平板上長出藍(lán)色菌落，而陰性載體pGBKT7-lam+pGADT7-T對(duì)照平板無菌落生長，對(duì)照組結(jié)果成立。上述結(jié)果表明，誘餌質(zhì)粒pGBKT7-HN-neu在Y2H Gold酵母細(xì)胞中對(duì)報(bào)告基因Ade、His、Leu和LacZ無自激活活性，可用于后續(xù)酵母雙雜交的篩選試驗(yàn)。

表 1　誘餌載體pGBKT7-HN-neu對(duì)報(bào)告基因的自激活檢測(cè)Table 1　Autoactivity test of bait vector pGBKT7-HN-neu to the reporter genes

2.4誘餌載體的毒性檢測(cè)

由圖2可知，誘餌載體pGBKT7-HN-neu和空載體pGBKT7處理的OD600值相近，振蕩培養(yǎng)16 h時(shí)，誘餌載體pGBKT7-HN-neu和空載體pGBKT7處理的OD600分別為1.303和1.357，均大于0.8。結(jié)果表明，誘餌載體pGBKT7-HN-neu表達(dá)的DNA-BD融合蛋白對(duì)酵母菌Y2H Gold的生長無毒性。

圖 2　誘餌載體pGBKT7-HN-neu對(duì)酵母細(xì)胞 Y2H Gold的毒性檢測(cè)Fig.2　Toxicity of pGBKT7-HN-neu to Y2H Gold yeast cell

3討論

新城疫病毒的血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)蛋白在病毒侵染過程中能識(shí)別細(xì)胞受體并介導(dǎo)病毒吸附細(xì)胞膜，此外，它還參與影響病毒毒力[12]。HN蛋白是NDV的重要保護(hù)性抗原，試驗(yàn)證明其單克隆抗體能中和NDV的感染[13]。由于單克隆抗體制備過程對(duì)技術(shù)人員的細(xì)胞操作技術(shù)要求高，且在實(shí)際生產(chǎn)中大量高濃度抗體的制備難度大、成本高。近年來，隨著基因工程技術(shù)發(fā)展，相繼開展了NDV新型基因工程抗體的研究。王斌等[14]通過構(gòu)建HN-scFV原核表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)獲得具有生物活性的HN蛋白單鏈抗體。但目前尚未見到關(guān)于HN蛋白中和性基因工程抗體的報(bào)道。納米抗體是基于駱駝體內(nèi)天然存在的重鏈抗體獲得的具有親本抗體抗原結(jié)合活性的一種基因工程抗體；由于VHH分子量小、穩(wěn)定、易制備、免疫原性小以及能識(shí)別獨(dú)特的表位等優(yōu)點(diǎn)，使其在抗病毒中的研究成為熱點(diǎn)，如VHH已用于人類免疫缺陷病毒等多種病毒性疾病的診斷和治療[15]，因此，研制靶向NDV HN蛋白的中和性納米抗體為今后控制和治療新城疫提供了一個(gè)嶄新的方向。

酵母雙雜交技術(shù)是建立在真核表達(dá)基礎(chǔ)上驗(yàn)證蛋白互作的一個(gè)有力工具，也可用于目標(biāo)蛋白抗體的篩選。相對(duì)于噬菌體展示技術(shù)，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選特定抗原的VHH時(shí)，在篩選過程中，抗原不需要表達(dá)和純化，可在核酸水平操作。本試驗(yàn)直接選取HN蛋白的潛在線性中和表位(DEQDYQ-IR)作為抗原，通過酶切連接構(gòu)建用于酵母雙雜交篩選的誘餌載體pGBKT7-HN-neu。通過將轉(zhuǎn)化誘餌載體的酵母細(xì)胞在不同營養(yǎng)缺陷型平板上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其生長情況和顏色變化，在SD/-Trp和SD/-Trp/X-α-Gal平板上為白色菌落，在SD/-Trp/AbA/X-α-Gal平板上無菌落生長，直觀地判斷誘餌載體對(duì)報(bào)告基因無自激活作用，從而排除假陽性。同時(shí)轉(zhuǎn)化誘餌載體的酵母細(xì)胞在SD/-Trp液體培養(yǎng)基中能大量增殖，OD600值大于0.8，說明表達(dá)的誘餌蛋白對(duì)酵母菌無毒性作用。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究成功構(gòu)建了HN蛋白的誘餌載體pGBKT7-HN-neu，且所構(gòu)建的誘餌載體在酵母系統(tǒng)中無自激活和毒性作用，為利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選靶向NDV HN蛋白的中和性納米抗體奠定了基礎(chǔ)。

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DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-06-0816:2110.13207/j.cnki.jnwafu.2016.07.007

[收稿日期]2014-11-26

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272578)

[作者簡(jiǎn)介]胡湘云(1990-)，女，廣西南寧人，在讀碩士，主要從事動(dòng)物傳染病學(xué)及基因工程抗體研究。 E-mail：821995274@163.com [通信作者]楊增岐(1964-)，男，陜西岐山人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物傳染病學(xué)研究。E-mail：yzq8162@163.com

[中圖分類號(hào)]S852.65

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)07-0045-05

Construction and identification of HN bait vector of newcastle disease virus in yeast two-hybrid system

HU Xiangyun,GAO Xiaolong, FU Xiangjing,WANG Yanping,LIU Dandan,CHANG Xudong,LIU Peng,DU Enqi,WANG Xinglong,DANG Ruyi,YANG Zengqi

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 The recombinant bait vector pGBKT7-HN-neu was constructed by yeast two-hybrid system to select variable domain of heavy chain antibody(VHH)against newcastle disease virus (NDV) HN protein.【Method】 The neutralizing epitope of NDV HN protein was synthetized and cloned into bait vector pGBKT7 of yeast two-hybrid system. After being verified by enzyme digestion and sequencing,pGBKT7-HN-neu was transformed into yeast cells Y2H Gold.Then,self-activation and toxic action of the bait vector pGBKT7-HN-neu were tested. 【Result】 HN-neu was successfully synthetized and the recombination bait vector pGBKT7-HN-neu was proven to be no self-activation and not toxic to the host yeast cell.【Conclusion】 The bait vector pGBKT7-HN-neu was successfully constructed.

Key words:newcastle disease virus (NDV);hemagglutinin-neuraminidase (HN);yeast two-hybrid system;bait vector

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160608.1621.014.html