超聲波輔助酒精發(fā)酵技術(shù)

王振斌，劉鳳葉，馬海樂，王　林，張存勝，閆景坤，劉加友

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

超聲波輔助酒精發(fā)酵技術(shù)

王振斌，劉鳳葉，馬海樂，王林，張存勝，閆景坤，劉加友

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

摘要：為了促進(jìn)釀酒工藝的發(fā)展，探討超聲波促進(jìn)酵母酒精發(fā)酵的機(jī)理，在對超聲波處理前后的酵母菌數(shù)量、發(fā)酵液殘?zhí)橇?、酒精產(chǎn)生量和發(fā)酵液黏度研究的基礎(chǔ)上，利用掃描電鏡和核磁共振技術(shù)對超聲波處理前后的酵母菌表征和水分子團(tuán)簇進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明，對照組酵母菌落數(shù)和酒精含量分別在42 h和90 h達(dá)到最大值2.65×108cfu/mL和4.5 g/L，發(fā)酵液黏度逐漸降低，酵母細(xì)胞表面形體飽滿，無大的凹陷，發(fā)酵末期水分子團(tuán)17O半峰寬為85.39 Hz。超聲組相比對照組菌落總數(shù)提前18 h達(dá)到最大值2.75×108cfu/mL，還原糖消耗速率和酒精產(chǎn)生速率顯著加快，發(fā)酵液黏度明顯低于對照組，酵母細(xì)胞形體表面粗糙，出現(xiàn)一定程度的凹陷，發(fā)酵末期水分子團(tuán)17O半峰寬為54.32 Hz。本研究為超聲波處理技術(shù)在生物發(fā)酵工藝方面的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：酒精發(fā)酵； 超聲波處理； 發(fā)酵速度； 機(jī)理

酒文化源遠(yuǎn)流長，酒類飲品在我們的生活中扮演著非常重要的角色，需要貯存一定的時(shí)間，才能很好地提升品質(zhì)?，F(xiàn)在釀酒工藝日漸成熟，發(fā)酵法釀造乙醇有悠久的歷史，但傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)效率低、成本過高［1］，已難以滿足現(xiàn)代生物發(fā)酵工程的需要，迫使人們不斷利用相關(guān)學(xué)科最新的科研成果來改進(jìn)發(fā)酵工藝。現(xiàn)在應(yīng)用比較多的有一些化學(xué)方法［2-4］。迄今，一些物理量如光、電、熱、電磁等對發(fā)酵過程生物學(xué)特性（如酶的活性等）的影響，人們已進(jìn)行了一定的研究且取得了不少成果。

近年來，由于超聲波處理設(shè)備的普及和發(fā)展，超聲波對發(fā)酵過程的影響正引起研究者強(qiáng)烈的興趣和高度的重視，目前已廣泛應(yīng)用于電子、機(jī)械、輕工等行業(yè)［6-7］。近年來在生物領(lǐng)域的應(yīng)用愈來愈受到重視［8］，合適強(qiáng)度的超聲波作用于發(fā)酵液，可改善生物反應(yīng)條件［9］。在超聲波作用下，超聲空化，機(jī)械作用改變了膜上脂雙分子層結(jié)構(gòu)而使微生物細(xì)胞膜電位發(fā)生改變，激活Ca+、K+等離子通道，膜兩側(cè)物質(zhì)滲透速度即膜的通透性增加，促進(jìn)對底物的利用和體內(nèi)代謝物的轉(zhuǎn)移，進(jìn)而促進(jìn)了細(xì)胞的生長并縮短細(xì)胞生長的遲滯時(shí)間［10-11］。低強(qiáng)度超聲波加載于微生物發(fā)酵過程中，可以加速微生物細(xì)胞的生長，同時(shí)可以促進(jìn)有益代謝產(chǎn)物的合成。

本研究將超聲波技術(shù)應(yīng)用在鎮(zhèn)江香醋的傳統(tǒng)釀造的酒精發(fā)酵過程中，以低強(qiáng)度超聲波提高發(fā)酵效率、縮短發(fā)酵時(shí)間，并從不同方面進(jìn)一步的了解促進(jìn)的機(jī)理，為鎮(zhèn)江香醋釀造技術(shù)的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料及儀器

菌種：釀酒酵母。

種子培養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)基，115℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖50 g，酵母膏5 g，蛋白胨5 g，CaC120.06 g，KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.06 g，于115℃下滅菌30 min［5］。

儀器設(shè)備：CY-5D超聲波微生物生長促進(jìn)儀；752N紫外可見分光光度計(jì)；Stemi 30電子顯微鏡；7890AGC氣相色譜；YXQ-LS-50S高壓滅菌鍋；HYL-C多功能搖床；NMR-500核磁共振譜儀；NDJ-79黏度計(jì)；S-3400N鎢燈絲掃描電子顯微鏡。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種發(fā)酵

將發(fā)酵液分裝至6個(gè)500 mL三角瓶中，精確量取20 mL菌液于發(fā)酵瓶，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵初期每隔4 h取樣1次，發(fā)酵末期每隔10 h取樣1次。

1.2.2超聲波輔助酒精發(fā)酵

發(fā)酵7 h結(jié)束后，取其中3個(gè)三角瓶進(jìn)行超聲波處理，處理的條件是超聲頻率20 KHz，超聲功率密度50 W/L，超聲時(shí)間1 h，工作10 s，間歇2 s。

1.3檢測方法

1.3.1酵母菌數(shù)目的測定

使用血球計(jì)數(shù)法結(jié)合美蘭染色法來確定酵母菌活菌的數(shù)量［12］。

1.3.2發(fā)酵液中殘?zhí)呛繙y定

采用DNS［13］法（3，5-二硝基水楊酸法）測定。取5 mL發(fā)酵液，于5000 r/min離心機(jī)中離心10 min，取上清液于540 nm處測其吸光值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y= 0.4824X+0.0123，R2=0.9978。對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出相應(yīng)含量。DNS比色法測定葡萄糖質(zhì)量濃度即為殘?zhí)呛俊?/p>

1.3.3發(fā)酵液中酒精含量測定

采用氣相色譜法［14］測定發(fā)酵液酒精含量。取2 mL發(fā)酵液，經(jīng)0.45 nm濾膜過濾處理，與甲酸1∶1混合，使用氣相色譜儀進(jìn)行測定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y= 17309.0517X+7400.0464，R2=0.9993。

1.3.4發(fā)酵液黏度測定

取發(fā)酵前、中、后、末期的發(fā)酵液于5000 r/min離心機(jī)中離心10 min，取上清液使用NDJ-8S型號的旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)測定黏度。

1.3.5發(fā)酵液水分子團(tuán)17O半峰寬

本研究利用17O-NMR半峰寬研究超聲波處理方法對水分子團(tuán)簇的影響，取發(fā)酵前、中、末期發(fā)酵液于5000 r/min的離心機(jī)中離心10 min，除掉底部沉淀物，將離心后的上清液經(jīng)過30～50 μm的定性濾紙進(jìn)行過濾處理得到濾液，采用NMR測定發(fā)酵液水分子團(tuán)17O半峰寬。

1.3.6酵母細(xì)胞表面的掃描電鏡分析

取超聲波處理完成后的發(fā)酵液于5000 r/min的離心機(jī)中離心10 min，獲得底部菌體，并按以下步驟進(jìn)行處理：

菌體→PBS清洗3次→2.5%戊二醛，4℃固定4 h→PBS清洗3次→乙醇梯度脫水（30%，50%，70%，80%，90%）1次→在15 min/次，5000 r/min，4℃下離心5 min，100%乙醇脫水2次→乙酸異戊二酯置換2次（1-醇∶酯= 1∶1，2-醇∶酯=1∶1）→樣品在超凈臺吹干，進(jìn)行SEM觀察。

PBS：NaCl：5.0 g，Na2HPO4：2.9 g，KCl：0.2 g，KH2PO4：0.2 g。

干燥后的樣品在高度真空條件下進(jìn)行黃金鍍層［15］，然后采用S-3400N型號的掃描電鏡進(jìn)行觀察。

2　結(jié)果與分析

2.1超聲波對酵母菌數(shù)目的影響

觀察超聲組培養(yǎng)液發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵8 h后超聲組三角瓶的底部出現(xiàn)少許沉淀，經(jīng)鏡檢發(fā)現(xiàn)是酵母菌的菌體沉淀。通過圖1可以發(fā)現(xiàn)剛接入的菌體處于遲滯期，發(fā)酵不活躍，此時(shí)超聲組會略微落后于對照組。

對發(fā)酵過程酵母活菌數(shù)檢測可以看出（圖1），超聲組在發(fā)酵24 h后可達(dá)到最大活菌數(shù)量，為2.75×108cfu/mL，相比對照組提前18 h達(dá)到最大活菌數(shù)，兩組發(fā)酵液中的活菌數(shù)均在之后30 h內(nèi)急速下降，直到發(fā)酵后期，兩組活菌數(shù)量基本不再變化。這一變化趨勢與糖含量的變化趨勢相吻合。證明在發(fā)酵底物一樣的情況下，低功率超聲波處理可以促進(jìn)細(xì)胞快速生長，但對細(xì)胞最終數(shù)目沒有較大影響。此研究結(jié)果與高大維等［16］研究結(jié)果相一致，用頻率為32.5 KHz，功率為30 W的超聲輻照啤酒酵母后，細(xì)胞的對數(shù)生長期延長，細(xì)胞生長速率提高，對細(xì)胞生長有一定促進(jìn)作用。這可能是由于超聲波在一定程度上可以改變細(xì)胞膜的通透性，加速胞內(nèi)物質(zhì)的流出和胞外物質(zhì)的流入，從而促進(jìn)細(xì)胞快速生長。

2.2超聲波對發(fā)酵液殘?zhí)橇康挠绊?/p>

酵母發(fā)酵過程中利用糖類產(chǎn)生二氧化碳和酒精，糖含量和超聲功率密度對發(fā)酵進(jìn)程都有很大的影響［17-18］。發(fā)酵過程中糖含量的變化從側(cè)面反映了發(fā)酵進(jìn)程。對發(fā)酵過程各組發(fā)酵液殘?zhí)橇康臋z測可以看出（圖2），由于酵母菌不斷生長繁殖，消耗大量的糖從而產(chǎn)生酒精，發(fā)酵液中糖含量先快速下降，之后隨著發(fā)酵的完成保持緩慢變化。超聲組的發(fā)酵進(jìn)程相比對照組提前40 h完成發(fā)酵。這一變化趨勢與發(fā)酵液中酵母菌活菌數(shù)的變化趨勢相吻合，這也進(jìn)一步證明了超聲波處理能夠促進(jìn)細(xì)胞的快速增長。

圖1　超聲波對發(fā)酵液酵母菌數(shù)量的影響

圖2　超聲波對發(fā)酵液殘?zhí)橇康挠绊?/p>

2.3超聲波對發(fā)酵液中酒精濃度的影響

對發(fā)酵液酒精濃度的檢測可以看出（圖3），隨著酵母菌不斷發(fā)酵消耗糖，兩組發(fā)酵液中酒精含量也在不斷升高。超聲組發(fā)酵液酒精濃度相比對照組提前20 h，在70 h達(dá)到最大濃度4.5 g/L。在30 h內(nèi)酒精濃度會快速升高，發(fā)酵50 h后酒精濃度基本不再變化，而對照組的酒精濃度直到4 d后都在緩慢的升高。最終的超聲組酒精濃度要高于普通組。在酵母發(fā)酵后期，往往會由于生成較大的酒精濃度而抑制發(fā)酵進(jìn)程。在超聲組中，酵母在較高的乙醇含量中快速地完成了發(fā)酵。

2.4超聲波對發(fā)酵液黏度的影響

從表1可以看出，隨著發(fā)酵進(jìn)程的延續(xù)，酵母菌不斷生長繁殖，消耗發(fā)酵底物導(dǎo)致發(fā)酵液黏度逐漸降低。發(fā)酵后、末期黏度基本不再變化，超聲組發(fā)酵液黏度明顯低于對照組，一方面是由于超聲波處理加快酵母細(xì)菌的繁殖，促使發(fā)酵底物的利用，導(dǎo)致發(fā)酵液黏度降低，另一方面，超聲波處理促使水分子團(tuán)變小進(jìn)一步導(dǎo)致黏度降低，這一規(guī)律與超聲波處理可使水分子團(tuán)變小、加快酵母生長的研究結(jié)果相一致。

圖3　超聲波對發(fā)酵液酒精濃度的影響

表1　超聲波對發(fā)酵液黏度的影響

2.5超聲波對發(fā)酵液水分子團(tuán)的影響

通常情況下，水分子團(tuán)簇是隨機(jī)、無定形的無規(guī)線團(tuán)，而水的物理化學(xué)性質(zhì)，比如黏度、溶解能力、滲透力等都由其分子團(tuán)簇結(jié)構(gòu)決定。目前，核磁共振波譜（NMR）是直接測試分子團(tuán)簇結(jié)構(gòu)的主要手段［19］。17ONMR半峰寬可以定性表征水分子團(tuán)簇大小，半峰寬越大水分子團(tuán)簇也越大。由表2可以看出，發(fā)酵初期對照組和超聲組發(fā)酵液水分子團(tuán)17O半峰寬大小均為110 Hz，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，兩組水分子團(tuán)大小均有減少，說明酵母發(fā)酵能夠使水分子團(tuán)變小，但對照組減小的幅度沒有超聲組明顯，這也驗(yàn)證了超聲波處理可以進(jìn)一步打破水分子團(tuán)，使之重新聚合成小分子團(tuán)。水分子團(tuán)越小，活性越大，水的溶解力、滲透力、代謝力、擴(kuò)散力、乳化力均有所增強(qiáng)，而具有一定的“活化”作用，從一定程度上增強(qiáng)生物機(jī)體的新陳代謝能夠促進(jìn)生命活力［10］，對細(xì)胞膜孔有比較好的滲透力，能夠很快滲入酵母細(xì)胞內(nèi)，從而促進(jìn)酵母細(xì)胞的生長。

表2　超聲波對發(fā)酵液水分子團(tuán)的影響

2.6超聲波對酵母細(xì)胞表面變化的影響

從圖4可以看出，對照組的酵母細(xì)胞表面形體飽滿，沒有大的凹陷。相反，超聲組酵母細(xì)胞形體發(fā)生變化，不再飽滿圓潤，表面粗糙，出現(xiàn)一定程度的凹陷。這是由于超聲波處理可以造成細(xì)胞表面微傷，使細(xì)胞壁局部破裂，在一定程度上改變細(xì)胞膜的通透性，從而加速了胞內(nèi)物質(zhì)的流出和胞外物質(zhì)的流入，進(jìn)而加快了發(fā)酵的進(jìn)程。這一研究結(jié)果與戴傳云等［20］和馮若等［21-22］的研究相一致，研究發(fā)現(xiàn)：低功率超聲波可以導(dǎo)致細(xì)胞的非熱生物效應(yīng)，使細(xì)胞短時(shí)局部破裂而沒有破碎、死亡，說明它在不影響代謝反應(yīng)速度的情況下，對細(xì)胞表面造成微小損傷，它可以很容易地被細(xì)胞自身所修復(fù)。

圖4　不同組酵母細(xì)胞表面

3　結(jié)論與展望

低強(qiáng)度的超聲波處理可以有效地促進(jìn)酵母細(xì)胞生長，加速釀酒酵母的發(fā)酵過程。本研究所選用的釀酒酵母在28℃的條件下，設(shè)置超聲密度為50 W/L，超聲頻率為20 kHz，超聲時(shí)間1 h，發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞的菌落總數(shù)迅速增加，與對照組相比，大約提前18 h達(dá)到最大菌落數(shù)，發(fā)酵后期2組酵母菌落數(shù)基本一致；超聲組與對照組相比，發(fā)酵過程提前40 h完成，酒精的最終產(chǎn)生量基本一致；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，超聲波處理還能夠降低發(fā)酵液的黏度，減小水分子團(tuán)簇，改變酵母菌細(xì)胞的形態(tài)，這些都有助于探究超聲波處理加速酒精發(fā)酵的機(jī)理。

目前，我國食品加工的總體水平還有待提高，新工藝和新技術(shù)的研究與推廣必將推動我國現(xiàn)有食品加工技術(shù)的進(jìn)步。將超聲波應(yīng)用于食品工業(yè)，不僅技術(shù)簡單，易于實(shí)現(xiàn)，而且減少了設(shè)備的投入，因此它在發(fā)酵工程領(lǐng)域的應(yīng)用前景是十分廣闊［23］。本研究為超聲波處理技術(shù)在生物發(fā)酵工藝方面的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，但是對于超聲ih促進(jìn)酒精發(fā)酵的機(jī)制研究還未很透徹，需要進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］劉振，曾愛武，袁希鋼.酒精發(fā)酵技術(shù)的進(jìn)展［J］.釀酒科技，2004 （6）：65-67.

［2］Castellari M，Matricardi L，Arfelli G，et al.Level of single bioactive phenolics in red wine as a function of the oxygen supplied during storage［J］.Food Chemistry，2000，1（69）：61-67.

［3］Huang C C.Studies on the chemical aging method of Shaoshing wine［C］//Annual Report of Wine Factories of the Taiwan Tobacco and Wine Monopoly Bureau，1980：81-86.

［4］Maduagwu E.Effects of pasteurization，vitamin C supplementation and ultraviolet irradiation on the nitrosamine content of palm wine［J］.Journal of Food Technology，1982，17 （5）：589-594.

［5］黎婭，黃翠姬.兩株酵母菌酒精發(fā)酵性能的比較［J］.廣西工學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，19（3）：50-53.

［6］周斌.用超聲波提取中藥材［J］.安徽科技，2005（4）：23-24.

［7］Javanaud C.Applications of ultrasound to food systems［J］. Ultrasonics，1988，26（3）：117-123.

［8］王靜，韓濤，李麗萍.超聲波的生物效應(yīng)及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用［J］.北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，26（1）：67-75.

［9］屈慧鴿，楊立紅，孫始威，等.超聲波對葡萄酒酵母發(fā)酵性能及葡萄酒質(zhì)量的影響［J］.食品科學(xué)，2007，28（03）：216-219.

［10］Wang B C，Shi L C，Zhou J，et al.The influence of Ca2+on the proliferation of S.cerevisiae and low ultrasonic on the concentration of Ca2+in the S.cerevisiae cells［J］.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces，2003，32（3）：35-42.

［11］羅華.超聲波對葡萄酒微生物活性影響及部分相關(guān)基因表達(dá)水平研究［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

［12］郭軍英.關(guān)于血球計(jì)數(shù)版的使用及注意事項(xiàng)［J］.教學(xué)儀器與實(shí)驗(yàn)，2009，25（4）：26-28.

［13］Kim H O，Lim J M，Joo J H，et al.Optimization of submerged culture condition for the production of mycelial biomass and exopolysaccharides byAgrocybe cylindracea［J］.Bioresour Technol，2005，96（10）：1175-1182.

［14］孫海彥，劉恩世，趙平娟，等.氣相色譜法和蒸餾-酒精計(jì)法測定木薯發(fā)酵液中酒精含量的比較［J］.釀酒科技，2012（11）：105-107.

［15］Loypimai P，MoongngarmA，Chottanom P，et al.Ohmic heating-assisted extraction of anthocyanins from black rice bran to prepare a natural food colourant［J］.Innovative Food Science and Emerging Technologies，2015，27：102-110.

［16］高大維，高文宏，雷德柱，等.線性超聲波輔照啤酒酵母細(xì)胞生長的影響［J］.華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1999，27（12）：35-37.

［17］Resa P，Elvira L，de Espinosa F M.Concentration control in alcoholic fermentation processes from ultrasonic velocity measurements［J］.Food Research International，2004，37：587-594.

［18］Resa P，Elvira L，de Espinosa F M，et al.Ultrasonic velocity in water-ethanol-sucrose mixtures during alcoholic fermentation［J］.Ultrasonics，2005，43（4）：247-252.

［19］王建華，丁言鎂，左春英.微波對水分子團(tuán)簇結(jié)構(gòu)影響的探究［J］.菏澤學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，28（5）：77-80.

［20］戴傳云，王伯初.低功率超聲波對微生物發(fā)酵的影響［J］.重慶大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26（2）：15-21.

［21］Elpiner I E.Ultrasound［M］.New York：The Humana Press，1964.

［22］馮若，李化茂.聲化學(xué)及其應(yīng)用［M］.合肥：安徽科學(xué)出版社，1992.

［23］趙峰，楊江帆，林河通.超聲波技術(shù)在食品加工中的應(yīng)用［J］.武夷學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，29（2）：21-26.

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-05-03；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160503.1410.008.html。

中圖分類號：TS264；TS261.4

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）07-0023-04

DOI：10.13746/j.njkj.2016083

基金項(xiàng)目：國家863計(jì)劃：（2013AA102203）；江蘇省科技支撐項(xiàng)目（BE2013404）；鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科技支撐項(xiàng)目（NY2012013）。

收稿日期：2016-03-10

作者簡介：王振斌（1975），男，陜西咸陽人，博士，教授，主要研究方向：食品物理加工技術(shù)。

Ultrasound-Assisted Alcohol Fermentation Technology

WANG Zhenbin，LIU Fengye，MAHaile，WANG Lin，ZHANG Cunsheng，YAN Jingkun and LIU Jiayou
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu 212013，China）

Abstract:In order to promote the development of liquor-making technology，the mechanism of ultrasonic treatment to advance alcohol fermentation was explored.Based on the change in yeast amount，residual sugar content in fermenting liquid，ethanol yield，and fermenting liquid viscosity before and after ultrasonic treatment，the surface features and water clusters of yeasts before and after ultrasonic treatment were studied by SEM and NMR.The results showed that，in control group，yeast amount and alcohol content reached up to 2.86×108cfu/mL at 42 h and 4.5 g/L at 90 h respectively，fermenting liquid viscosity reduced gradually，the surface of yeast was well-stacked with no defect and no big sag，and17O half-peak breadth of water clusters was 85.39 Hz；in ultrasonic treatment group，yeast amount reached up to the maximum number of 2.75×108cfu/mL 18 hours in advance，and the consumption rate of reducing sugar and ethanol yield significantly increased，fermenting liquid viscosity was evidently lower than that in the control group，and the surface of yeast was rough and with big sag on the surface，and17O halfpeak breadth of water clusters was 54.32 Hz.This study provided a theoretical evidence for the application of ultrasonic treatment in biological fermentation.

Key words:alcohol fermentation；ultrasonic treatment；fermentation speed；mechanism