奶牛外周血樹(shù)突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)與鑒定

詹　康　趙倩明　隋雁南　封飛飛　占今舜　趙國(guó)琦

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225009)

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奶牛外周血樹(shù)突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)與鑒定

詹康趙倩明隋雁南封飛飛占今舜趙國(guó)琦*

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225009)

摘要：通過(guò)粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細(xì)胞介素-4(IL-4)體外誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞為樹(shù)突狀細(xì)胞，為利用樹(shù)突狀細(xì)胞免疫療法治療奶牛乳房炎奠定基礎(chǔ)和提供細(xì)胞模型。利用淋巴細(xì)胞分離液分離獲得奶牛外周血單核細(xì)胞，在6孔板內(nèi)培養(yǎng)2 h后，棄掉含有大量的T細(xì)胞和B細(xì)胞上清液，貼壁的基本上是單核細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液清洗5次，加入含有GM-CSF和IL-4的2 mL培養(yǎng)基進(jìn)行3 d誘導(dǎo)。之后，從培養(yǎng)基頂部小心吸棄1.4 mL的培養(yǎng)基，然后再補(bǔ)加含有GM-CSF和IL-4的1.8 mL培養(yǎng)基繼續(xù)誘導(dǎo)3 d。每天通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。第7天經(jīng)流式檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD11c、CD14、主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ(MHCⅡ)、CD40、CD80、CD86的表達(dá)。結(jié)果表明：1)第2天，一些細(xì)胞表面可以生長(zhǎng)出刺突并伴隨著偽足的生長(zhǎng)。第3天，細(xì)胞表面的刺突和偽足越來(lái)越多。第4、5天，一些帶有刺突和偽足的細(xì)胞開(kāi)始聚集和融合。第6天，單核細(xì)胞基本被誘導(dǎo)為樹(shù)突狀細(xì)胞，細(xì)胞表面含有大量清晰可見(jiàn)的刺突和偽足。2)經(jīng)流式檢測(cè)，CD14、CD11c、MHCⅡ陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞分別占誘導(dǎo)細(xì)胞的6.8%、65.0%、75.9%，CD80和CD86陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞分別占誘導(dǎo)細(xì)胞的2.0%和1.2%。綜上所述，采用奶牛外周血單核細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)能夠獲得一定純度的奶牛樹(shù)突狀細(xì)胞。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞免疫治療；單核細(xì)胞；樹(shù)突狀細(xì)胞；奶牛乳房炎

近年來(lái)有關(guān)樹(shù)突狀細(xì)胞的表型、功能及細(xì)胞免疫療法等方面的研究已成為熱點(diǎn)[1]。細(xì)胞免疫療法主要通過(guò)對(duì)疾病動(dòng)物進(jìn)行靜脈采血，然后在體外獲得的外周血單核細(xì)胞，經(jīng)過(guò)特定培養(yǎng)條件下定向誘導(dǎo)為樹(shù)突狀細(xì)胞，被誘導(dǎo)的細(xì)胞與病原菌或抗原共孵育，最后經(jīng)過(guò)靜脈注射至動(dòng)物體內(nèi)[2]。奶牛乳房炎是奶牛最重要的疾病之一，直接導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降，甚至淘汰，這給畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)嚴(yán)重的損失[3]。因此，利用未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞治療奶牛乳房炎具有重要意義，然而，如何在體外獲得一定純度的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞阻礙了利用細(xì)胞免疫療法治療乳房炎的發(fā)展。同時(shí)，動(dòng)物外周血的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量極其少，僅僅只有外周血單核細(xì)胞的1%，因此，如果直接從外周血分選未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞是不可行的。動(dòng)物體內(nèi)的大部分的前體細(xì)胞是單核細(xì)胞，在一定條件下能夠定向分化為所需要的目的細(xì)胞。因此，本試驗(yàn)通過(guò)體外獲得單核細(xì)胞，再經(jīng)過(guò)粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細(xì)胞介素-4(IL-4)細(xì)胞因子誘導(dǎo)，以期獲得未成熟的奶牛樹(shù)突狀細(xì)胞。同時(shí)，奶牛營(yíng)養(yǎng)與免疫的關(guān)系能夠得到很好的闡明。人和動(dòng)物體內(nèi)有很多抗原呈遞細(xì)胞，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞。其中，樹(shù)突狀細(xì)胞是人體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞。樹(shù)突狀細(xì)胞分化成熟過(guò)程中具有未成熟與成熟2個(gè)階段[4]。Werling等[5]在體外通過(guò)外周血獲得了奶牛樹(shù)突狀細(xì)胞，并利用此細(xì)胞來(lái)俘獲和吸收牛呼吸道合胞體病毒，結(jié)果表明奶牛樹(shù)突狀細(xì)胞能夠加工和處理這種病毒。Schreiner等[6]通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞、T細(xì)胞和金黃色葡萄球菌調(diào)節(jié)肽共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)黃色葡萄球菌調(diào)節(jié)肽能夠加強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞和T細(xì)胞功能并調(diào)節(jié)初始型T細(xì)胞的功能。Guermonprez等[7]樹(shù)突狀細(xì)胞與瘧原蟲(chóng)共培養(yǎng)，誘導(dǎo)T細(xì)胞的激活，尤其是CD8殺傷性T細(xì)胞的激活，能夠抑制瘧原蟲(chóng)的增殖。本試驗(yàn)旨在體外誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞為未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞并觀察細(xì)胞形態(tài)變化和鑒定其表面分子的豐富度，同時(shí)利用未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞與奶牛乳房炎病原菌共培養(yǎng)提供素材，這將為利用細(xì)胞免疫療法治療奶牛乳房炎提供細(xì)胞模型。

1材料與方法

1.1材料

對(duì)3頭荷斯坦奶牛進(jìn)行頸靜脈采血，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌肝素鈉抗凝管中放冰上，立即帶回實(shí)驗(yàn)室。RPMI1640完全培養(yǎng)基和澳洲胎牛血清均購(gòu)自Gibco公司；100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素均購(gòu)自Sigma公司；GM-CSF和IL-4均購(gòu)自Kingfisher公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自Cedarlane公司；2-巰基乙醇(2-ME)購(gòu)自Amresco公司；CD11c、CD14、主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ(MHCⅡ)、CD40、CD80、CD86以及Isotype Control IgG1、IgM和IgG2a)均是鼠源單克隆抗體(1∶50)，均購(gòu)自University of Washington；PerCP-Rat Anti-Mouse IgG1(1∶4)購(gòu)自BD公司；PE-Goat Anti-Mouse IgM和FITC-Goat Anti-Mouse IgG 2a(1∶50)均購(gòu)自Southern Biotech公司。

1.2奶牛外周血單核細(xì)胞的獲得

對(duì)奶牛靜脈采血20 mL至肝素鈉抗凝管中，用含有100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行1∶1稀釋外周血，總體積40 mL。加淋巴細(xì)胞分離液到50 mL離心管底部，然后緩慢加入稀釋的奶牛靜脈血至淋巴細(xì)胞分離液表面，2 000/min條件下離心30 min。離心之后，細(xì)胞將分層，依次是血清和稀釋液層、淋巴細(xì)胞層、淋巴細(xì)胞分離液層、血細(xì)胞和粒細(xì)胞層。轉(zhuǎn)移淋巴細(xì)胞層到新的50 mL移液管中。加PBS至總體積40 mL。2 000/min條件下離心10 min，棄上清。加800 μL紅細(xì)胞裂解液懸浮細(xì)胞，然后再加紅細(xì)胞裂解液至總體積20 mL，室溫靜置5 min。2 000/min條件下離心10 min，倒掉上清。加800 μL PBS懸浮細(xì)胞，然后再加PBS至總體積40 mL，2 000/min條件下離心10 min，棄上清。加1 mL的PBS懸浮細(xì)胞，將4管1 mL細(xì)胞全部轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，冰上保存。80倍稀釋細(xì)胞，計(jì)數(shù)。

1.3奶牛外周血樹(shù)突狀細(xì)胞的分化誘導(dǎo)

通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)，取107個(gè)細(xì)胞加至6孔板，每孔加入3 mL的含有終濃度為50 ng/mL GM-CSF、50 ng/mL IL-4、0.5 mol/L 2-ME、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育3 d。之后，從培養(yǎng)基頂部吸棄適量的培養(yǎng)基，然后再補(bǔ)加上述培養(yǎng)基。培養(yǎng)至第7天，收獲細(xì)胞，進(jìn)行流式分析。培養(yǎng)的6 d內(nèi)，每天通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4奶牛樹(shù)突狀細(xì)胞表型的鑒定

取106誘導(dǎo)細(xì)胞懸液加入1.5 mL指形管，2 000/min條件下離心3 min棄上清。100 μL PBS懸浮細(xì)胞，加50 μL的一抗，總體積150 μL，4 ℃孵育30 min，接下來(lái)4 ℃、2 000/min條件下離心3 min棄上清，重復(fù)3次。再加對(duì)應(yīng)于PerCP-Rat Anti-Mouse IgG1、PE-Goat Anti-Mouse IgM和FITC-Goat Anti-Mouse IgG各自二抗，4 ℃避光孵育30 min，4 ℃、2 000/min條件下離心3 min，棄上清，重復(fù)3次，通過(guò)FACS Aria流式細(xì)胞儀檢測(cè)樹(shù)突狀細(xì)胞的表型。對(duì)于每個(gè)樣品都加入Isotype Control一抗，進(jìn)行同型對(duì)照，以消除非特異性熒光的差異。

2結(jié)果

2.1奶牛外周血樹(shù)突狀細(xì)胞形態(tài)鑒定

由圖1可知，外周血單核細(xì)胞接種第1天(接種2 h之后)，細(xì)胞開(kāi)始貼壁，但是細(xì)胞貼壁不牢。細(xì)胞上清液中仍然有大量的懸浮細(xì)胞，這些細(xì)胞大部分為T(mén)細(xì)胞和B細(xì)胞。加入GM-CSF和IL-4細(xì)胞因子之后，單核細(xì)胞開(kāi)始被分化。第2天，一些細(xì)胞表面可以生長(zhǎng)出刺突并伴隨著偽足的生長(zhǎng)。第3天，細(xì)胞表面的刺突和偽足越來(lái)越多。第4、5天，一些帶有刺突和偽足的細(xì)胞開(kāi)始聚集和融合。第6天，顯微鏡下具有典型的樹(shù)突狀細(xì)胞的形態(tài)特征，細(xì)胞表面的刺突更加明顯，一些形態(tài)開(kāi)始向周?chē)由?。一些?xì)胞體積變大，細(xì)胞表面有許多樹(shù)突，呈長(zhǎng)短、大小不一的樹(shù)枝狀，有的突起較直，有的較彎曲并且疊加在一起形成較大突起。同時(shí)，少部分細(xì)胞開(kāi)始衰老并開(kāi)始脫落。

圖1　誘導(dǎo)過(guò)程中樹(shù)突狀細(xì)胞的形態(tài)Fig.1　The morphology of induced dendritic cells in process (10×)

2.2奶牛樹(shù)突狀細(xì)胞表型鑒定

由圖2和圖3可知，貼壁的單核細(xì)胞經(jīng)過(guò)GM-CSF和IL-4細(xì)胞因子6 d誘導(dǎo)之后，CD14陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞占誘導(dǎo)細(xì)胞的6.8%，然而，CD11c陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞占誘導(dǎo)細(xì)胞的65.0%，MHCⅡ陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞占誘導(dǎo)細(xì)胞的75.9%。結(jié)果表明，剛開(kāi)始貼壁的單核細(xì)胞已大部分被誘導(dǎo)為樹(shù)突狀細(xì)胞。然而，樹(shù)突狀細(xì)胞在體內(nèi)有2種狀態(tài)。一般情況下，樹(shù)突狀細(xì)胞在體內(nèi)呈現(xiàn)為成熟狀態(tài)，在血液中監(jiān)視外來(lái)入侵者，一旦發(fā)現(xiàn)體內(nèi)有外來(lái)入侵抗原，成熟細(xì)胞立刻啟動(dòng)免疫應(yīng)答，此時(shí)未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞變?yōu)槌墒斓臉?shù)突狀細(xì)胞。鑒定樹(shù)突狀細(xì)胞是否成熟的表面標(biāo)志抗原為CD80和CD86。由圖4可知，CD80和CD86表面抗原分子陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞占誘導(dǎo)細(xì)胞的分別占誘導(dǎo)細(xì)胞2.0%和1.2%，說(shuō)明誘導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞呈現(xiàn)未成熟狀態(tài)，此時(shí)，它能高效地?cái)z取、加工處理抗原。同時(shí)，未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移能力。然而，成熟樹(shù)突狀細(xì)胞能有效激活初始型T細(xì)胞，處于啟動(dòng)、調(diào)控和維持體內(nèi)自身免疫應(yīng)答。

3討論

3.1奶牛樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)和形態(tài)分析

樹(shù)突狀細(xì)胞是由加拿大科學(xué)家斯塔曼于1973年發(fā)現(xiàn)的，是目前所知的功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，由于其形態(tài)伸出許多樹(shù)突樣或偽足樣刺突而得名[8]。同時(shí)，它對(duì)誘導(dǎo)初次免疫應(yīng)答具有獨(dú)特的功能，未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞在對(duì)抗原的攝取、加工和處理具有很強(qiáng)的作用，成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)抗原的攝取和加工則減弱[9]。由于它在機(jī)體的細(xì)胞免疫及唯一能夠激活初始型T細(xì)胞免疫應(yīng)答中的作用而成為研究治療疾病重要手段之一。然而，樹(shù)突狀細(xì)胞在畜牧領(lǐng)域中研究較少，尤其是利用樹(shù)突狀細(xì)胞來(lái)治療奶牛乳房炎未見(jiàn)報(bào)道。奶牛乳房炎一直是困擾著奶業(yè)發(fā)展重要阻礙之一。目前，治療奶牛乳房炎一般是利用大量的抗生素進(jìn)行治療，這樣病原菌會(huì)對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性。更為重要的是奶牛乳腺所產(chǎn)的奶中也會(huì)有抗生素殘留，從而給人類(lèi)健康帶來(lái)不利影響。Guermonprez等[7]利用樹(shù)突狀細(xì)胞與瘧原蟲(chóng)感染期間能夠激活T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而有效地抑制了瘧原蟲(chóng)的生長(zhǎng)。Schreiner等[6]利用金黃色葡萄球菌的苯酚肽能夠調(diào)節(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞的功能并在體外活化初始型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。Lei等[10]利用樹(shù)突狀細(xì)胞與分歧桿菌亞種類(lèi)結(jié)核在體外共培養(yǎng)并感染樹(shù)突狀細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)被類(lèi)結(jié)核感染的奶牛樹(shù)突狀細(xì)胞的功能和活性受損，結(jié)果表明類(lèi)結(jié)核感染的樹(shù)突狀細(xì)胞將限制樹(shù)突狀細(xì)胞的表型和功能。Cruz-Adalia等[11]在研究小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞俘獲抗原并呈遞給T細(xì)胞，最終T細(xì)胞能夠殺死細(xì)菌和給予小鼠免疫保護(hù)。樹(shù)突狀細(xì)胞起源于造血干細(xì)胞主要來(lái)源于2條途徑：骨髓樣干細(xì)胞在GM-CSF和IL-4的刺激下分化為樹(shù)突狀細(xì)胞，稱(chēng)為骨髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞，它與單核細(xì)胞和粒細(xì)胞有共同的前體細(xì)胞，包括朗格漢斯細(xì)胞、表皮樹(shù)突狀細(xì)胞以及單核細(xì)胞分化而來(lái)的樹(shù)突狀細(xì)胞。其次，是來(lái)源于淋巴樣干細(xì)胞，稱(chēng)為淋巴樣樹(shù)突狀細(xì)胞[12]。它與T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞有共同的前體細(xì)胞。在體內(nèi)外周血中樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量不足外周血單核細(xì)胞的1%，然而，表面具有豐富的抗原遞呈分子主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ(MHCⅠ)和MHCⅡ以及共刺激因子CD40、CD40L、CD80和CD86，是功能強(qiáng)大的專(zhuān)職抗原遞呈細(xì)胞。但是，骨髓樣和淋巴樣的樹(shù)突狀細(xì)胞的形態(tài)和功能也不盡相同。本試驗(yàn)結(jié)果表明誘導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞在第6天時(shí)，顯微鏡下呈現(xiàn)典型的樹(shù)突起的形態(tài)特征，細(xì)胞表面的刺突明顯，表明細(xì)胞膜表明具有大量的捕獲抗原的受體。

P1為門(mén)水平陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞總數(shù)；P2、P3、P4均為對(duì)照的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)。

P1 was total positively expressed cell count at phylum level； P2，P3 and P4 were positively expressed cell count of control.

圖2同型對(duì)照

Fig.2Isotype control

3.2奶牛樹(shù)突狀細(xì)胞鑒定

通過(guò)單核細(xì)胞添加GM-CSF和IL-4細(xì)胞因子在體外獲得樹(shù)突狀細(xì)胞是最好的選擇。然而，從骨髓和外周血來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞的表型并不一致。Borkowski等[13]和Galy等[14]指出人和小鼠的樹(shù)突狀細(xì)胞存在2種不同的世系，即髓系和淋巴系的樹(shù)突狀細(xì)胞。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，從外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)獲得的樹(shù)突狀細(xì)胞的表型為CD11c+/CD14-。Miyazawa等[15]在奶牛外周血的樹(shù)突狀細(xì)胞表型研究中，得出奶牛外周血來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞表型為CD11c+/CD172A+，從鑒定的表型顯示此樹(shù)突狀細(xì)胞為髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞。來(lái)自于胸腺的奶牛樹(shù)突狀細(xì)胞表型為CD1+/CD172Aa+，進(jìn)一步表明髓樣的樹(shù)突狀細(xì)胞缺乏CD1分子。在小鼠來(lái)源的外周血樹(shù)突狀細(xì)胞中也被報(bào)道都表達(dá)CD11c分子[16]。Renjifo等[17]在奶牛外周血中也能檢測(cè)到外周血樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)CD11c分子。這些結(jié)果表明，CD11c+能夠作為外周血樹(shù)突狀細(xì)胞表型標(biāo)志。一般來(lái)說(shuō)，具有功能的樹(shù)突狀細(xì)胞是具有能夠激活初始型T細(xì)胞和初始型免疫反應(yīng)。樹(shù)突狀細(xì)胞在黏膜免疫系統(tǒng)具有重要的作用，如腸道黏膜和乳腺組織經(jīng)常受到外來(lái)病原菌的攻擊[18]，尤其奶牛乳腺受到病原菌的感染之后，引起乳腺組織局部紅腫，這是由于大量的淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子遷移至乳腺感染部位進(jìn)行免疫應(yīng)答所產(chǎn)生的生理反應(yīng)。乳腺受到細(xì)菌感染之后，首先，定居在乳腺組織的淋巴細(xì)胞，如樹(shù)突狀細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞俘獲抗原，立即啟動(dòng)免疫應(yīng)答來(lái)殺傷病原菌。同時(shí)，乳腺上皮細(xì)胞也遭到細(xì)菌致命的損壞，最終，引起奶牛乳房炎導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降。因此，營(yíng)養(yǎng)與免疫的結(jié)合對(duì)于畜牧發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。尤其是近來(lái)樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)外來(lái)抗原的俘獲、加工并呈遞至淋巴結(jié)的T細(xì)胞區(qū)進(jìn)行殺傷作用。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明在體外通過(guò)外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞的表型為CD11c+/CD14-/CD80-/CD86-，為典型的未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞，因此，可作為細(xì)胞免疫療法的細(xì)胞素材來(lái)治療奶牛乳房炎。

P1為門(mén)水平陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞總數(shù)；P2為CD14陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)；P3為CD11c陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)；P4為MHC II陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)。

P1 was total positively expressed cell count at phylum level； P2 was CD14 positively expressed cell count; P3 was CD11c positively expressed cell count; P4 was MHCⅡ positively expressed cell count.

圖3CD14、CD11c和MHCⅡ陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞占誘導(dǎo)細(xì)胞的比例

Fig.3The percentage of CD14, CD11c and MHCⅡ positively expressed cells in induced cells

P1為門(mén)水平陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞總數(shù)；P2為CD80陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)；P2′為CD86陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)。

P1 was total positively expressed cell count at phylum level； P2 was CD80 positively expressed cell count; P2′ was CD86 positively expressed cell count.

圖4CD80和CD86陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞占誘導(dǎo)細(xì)胞的比例

Fig.4The percentage of CD80 and CD86 positively expressed cells in induced cells

4結(jié)論

① 通過(guò)6 d對(duì)外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)，細(xì)胞表面含有大量清晰可見(jiàn)的刺突，同時(shí)，細(xì)胞向外圍延伸并長(zhǎng)出樹(shù)枝的偽足。

② 通過(guò)流式檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞的表型，得出CD14、CD11c、MHCⅡ陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞分別占誘導(dǎo)細(xì)胞的6.8%、65.0%、75.9%，CD80和CD86陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞分別占誘導(dǎo)細(xì)胞的2.0%和1.2%，表明單核細(xì)胞已被誘導(dǎo)為樹(shù)突狀細(xì)胞且是未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞。

③ 采用奶牛外周血單核細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)能夠獲得一定純度的奶牛樹(shù)突狀細(xì)胞。

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(責(zé)任編輯王智航)

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.07.024

收稿日期：2016-01-12

基金項(xiàng)目：江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工作資助項(xiàng)目(PAPD)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31572430)

作者簡(jiǎn)介：詹康(1988—)，男，江蘇南京人，博士研究生，從事動(dòng)物分子營(yíng)養(yǎng)研究。E-mail: zhankang0305@163.com *通信作者：趙國(guó)琦，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: gqzhao@yzu.edu.cn

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-267X(2016)07-2184-07

*Corresponding author, professor, E-mail: gqzhao@yzu.edu.cn

Bovine Peripheral Blood Monocyte Derived Dendritic Cell Culture and IdentificationinVitro

ZHAN KangZHAO QianmingSUI YannanFENG FeifeiZHAN JinshunZHAO Guoqi*

(College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)

Abstract:This study aimed to induce bovine peripheral blood monocyte derived dendritic cell by granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and interleukin-4 (IL-4) cytokines, which could lay foundation and provide cell model for dairy cow mastitis treatment using cell immunotherapy. The bovine peripheral blood monocyte was acquired by lymphocyte separation medium and seeded in 6-proe plate to culture for 2 h. Then, suspended cells containing an amount of B and T cells were discarded, and adherent cells were mostly monocyte. The cells were washed for 5 times using phosphate buffer, and 2 mL culture medium containing GM-CSF and IL-4 cytokines was added to culture for 3 d. After that, 1.4 mL culture medium was discard from medium top, and 1.8 mL culture medium containing GM-CSF and IL-4 was added to culture for another 3 d. The cell was observed under microscope every day. On days 7, the cells were harvested to detect CD11c, CD14, major histocompatibility complex Ⅱ (MHCⅡ), CD40, CD80 and CD86 molecules by flow cytometry. The result showed as follows: 1) on days 2, some of the cells started to extend spikes and accompanied by pseudopodia stretching. On days 3, the spikes and pseudopodia grew more and more. On days 4 and 5, cells with spikes and pseudopodia started aggregation and fusion. On days6, most of monocytes were derived to dendritic cells, on which plenty of spikes and pseudopodia could be clearly seen. 2) CD14, CD11c, MHCⅡ, CD80 and CD86 positively expressed cells accounts for 6.8%, 65.0%, 75.9%, 2.0% and 1.2% of induced cells by flow cytometry, respectively. In conclusion, bovine peripheral blood monocytes can be derived to dendritic cells with certain purity.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(7)：2184-2190]

Key words:cellular immune treatment; monocyte; dendritic cell; bovine mastitis