防御素基因在烏金豬與約大烏豬組織中的表達及東亞飛蝗抗菌活性物質對防御素基因表達的調節(jié)作用

李美荃　劉　紅　張春勇　安清聰　駱　雪　陳克嶙　郭榮富

(云南農業(yè)大學，云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，昆明650201)

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*同等貢獻作者

防御素基因在烏金豬與約大烏豬組織中的表達及東亞飛蝗抗菌活性物質對防御素基因表達的調節(jié)作用

李美荃劉紅*張春勇安清聰駱雪陳克嶙郭榮富**

(云南農業(yè)大學，云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，昆明650201)

摘要：本試驗旨在檢測β防御素-1(pBD-1)、β防御素-2(pBD-2)和β防御素-3(pBD-3)基因在烏金豬和具有烏金豬血緣的約大烏豬不同組織中的表達，并探討東亞飛蝗抗菌活性物質(LAAS)對豬胎兒皮膚成纖維細胞(PFSF)免疫應激參數(shù)和防御素(pBDs)基因表達的調節(jié)作用。采用實時熒光定量PCR方法檢測2月齡烏金豬與約大烏豬心臟、肝臟、肺臟、腎臟、空腸、回腸、十二指腸、皮膚、肌肉、胰腺、睪丸或卵巢這12種組織中pBD-1、pBD-2和pBD-3基因的表達差異；采用培養(yǎng)至第4～5代的PFSF，通過脂多糖(LPS)誘導建立免疫應激模型，在DMEM/F12培養(yǎng)液中添加不同濃度(0、75、150、300、600和1 200 μg/mL)的LAAS，考察LAAS對PFSF免疫應激參數(shù)和pBD-1、pBD-2、pBD-3基因表達的影響。結果表明：1)烏金豬血清溶菌酶(LSZ)活性、免疫球蛋白G(IgG)含量顯著高于約大烏豬(P<0.05)，血清一氧化氮(NO)含量極顯著低于約大烏豬(P<0.01)。2)約大烏豬大多數(shù)組織中pBD-1、pBD-2和pBD-3基因的表達量高于烏金豬；2個品種豬的pBD-1和pBD-3基因均在皮膚和卵巢中表達量較高，pBD-2基因在肝臟和腎臟中表達量較高。3)300 μg/mL LAAS極顯著降低了培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)活性(P<0.01)；LAAS極顯著增加了培養(yǎng)液中NO含量(除75 μg/mL組正常細胞外)(P<0.01)，正常細胞和應激細胞均在LAAS濃度為600 μg/mL時達到最高；LAAS濃度為0、75和150 μg/mL時應激細胞一氧化氮合酶(NOS)活性顯著或極顯著高于正常細胞(P<0.05或P<0.01)；添加1 200 μg/mL LAAS可極顯著降低培養(yǎng)液中的LSZ活性(P<0.01)，LAAS濃度為150、300、600和1 200 μg/mL時應激細胞與正常細胞中LSZ活性差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)。4)應激細胞pBD-1、pBD-2和pBD-3基因的表達量均高于正常細胞；當LAAS濃度為150 μg/mL時，pBD-1、pBD-2和pBD-3基因的表達量最高。結果提示，烏金豬和約大烏豬防御素基因的表達存在明顯的品種差異性和組織特異性，適宜濃度的LAAS能夠降低PFSF中LDH活性，提高NO含量及NOS、LSZ活性，上調應激細胞與正常細胞防御素的表達量。

關鍵詞：烏金豬；約大烏豬；β-防御素；免疫應激；東亞飛蝗抗菌活性物質

目前豬的疾病越來越趨向于復雜化，尋找新型、安全、高效的抗生素替代品已成為豬營養(yǎng)研究和生豬健康養(yǎng)殖的重要研究課題。動物健康是保障其生存、種屬繁衍和發(fā)揮遺傳生產潛力的重要生物學基礎。營養(yǎng)與免疫是動物健康的重要研究課題。抗病基因與動物健康密切相關，營養(yǎng)可通過改善免疫力和影響抗病基因進而提高機體抗病力，從而增強動物健康和改善其生產性能?？咕淖鳛橐环N無毒副作用、無殘留的抗微生物添加劑具有廣闊的開發(fā)應用前景。防御素(pBDs)是動物體內防御系統(tǒng)中最大的成員，它是一類富含半胱氨酸的陽離子活性肽，可形成3對分子內二硫鍵，分子質量為2～6 ku。根據(jù)防御素二硫鍵的連接位置及形成的空間結構，可將其分為α-防御素、β-防御素和θ-防御素，其中在豬體內僅發(fā)現(xiàn)了β-防御素，且研究較多的為β防御素-1(pBD-1)、β防御素-2(pBD-2)和β防御素-3(pBD-3)[1]。防御素具有廣譜抗菌、抗病毒活性和非特異性細胞毒性作用，可以調節(jié)體內適應性免疫及其他抗微生物免疫。Diamond等[2]首次在牛的氣管黏膜上皮細胞中發(fā)現(xiàn)了防御素，由38～42個氨基酸殘基組成，且主要存在于哺乳動物的皮膚、黏膜等上皮細胞中。Herrera等[3]研究報道，人類pBD-2和pBD-3與成人口腔上皮細胞的抗艾滋病病毒耐藥性的機制密切相關。Kallóo等[4]研究報道，新型方法選擇反應監(jiān)測(SRM)可以快速分析防御素與生物樣本的相關性。昆蟲具有其獨特的免疫機制，在免疫防御體系中主要由一系列抗菌肽發(fā)揮作用。駱雪等[5]研究報道，東亞飛蝗蟲體內含有抗菌活性物質可被誘導表達。溫劉發(fā)等[6]以蠶抗菌肽飼喂豬和禽的試驗證明，蠶抗菌肽具有代替?zhèn)鹘y(tǒng)飼用抗生素應用的潛力。由此提示，昆蟲抗菌肽作為一種免疫調節(jié)劑是否對動物防御素基因的表達具有調節(jié)作用。云南本地烏金豬生活在云南高原生態(tài)條件下，長期的生物進化形成耐粗飼、生長速度緩慢、抗逆性即抗病和抗氧化性強等生物學特性和遺傳特點。約大烏豬是利用現(xiàn)代遺傳育種技術，經過多代選育而成的含有25%烏金豬血緣的雜交豬種，其瘦肉率和生長速度明顯提高，抗逆性也可能會發(fā)生改變。本研究檢測了具有抗菌活性的pBD-1、pBD-2和pBD-3基因在烏金豬和約大烏豬不同組織中的表達，同時探討了東亞飛蝗抗菌活性物質(locust antibacterial active substances，LAAS)對豬免疫應激細胞pBD-1、pBD-2和pBD-3基因表達的調節(jié)作用。

1材料與方法

1.1試驗動物和血清生化指標測定

隨機選取來源一致、健康、飼養(yǎng)方式相同、體重相近的2月齡烏金豬和約大烏豬各12頭(公母各占1/2)，所有仔豬空腹前腔靜脈采血5 mL，制備血清備用，測定溶菌酶(LSZ)、免疫球蛋白G(IgG)、一氧化氮合酶(NOS)、乳酸脫氫酶(LDH)、一氧化氮(NO)活性或含量。IgG含量采用全自動生化分析儀測定，NO含量及NOS、LDH、LSZ活性采用比色法測定，試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2組織采集

試驗仔豬07:30空腹稱重后屠宰，收集心臟、肝臟、肺臟、腎臟、空腸、回腸、十二指腸、皮膚、肌肉、胰腺、睪丸或卵巢共12種組織，剔除脂肪組織，迅速剪碎，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3細胞培養(yǎng)

選用培養(yǎng)至第4～5代的皮膚成纖維細胞(porcine fetal skin fibroblasts，PFSF)，以DMEM/F12(1∶1)含血清培養(yǎng)液(10%的胎牛血清，1%的青霉素、鏈霉素雙抗，1%的谷氨酰胺)為細胞的基礎培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)。

1.4試驗材料

東亞飛蝗成蟲提取物由云南農業(yè)大學云南省動物營養(yǎng)與飼料單胃動物營養(yǎng)研究室提供(抗菌活性物質提取率8.62%，抗菌活性物質濃度11.78 mg/mL)，選用東亞飛蝗針刺蘸大腸桿菌法誘導其產生抗菌活性物質，抗菌活性物質主要為防御素。具體方法為：東亞飛蝗成蟲針刺腹部，浸泡于處于對數(shù)生長的大腸桿菌菌懸液中10 min，作用24 h，收集蟲體，-80 ℃過夜,勻漿離心取上清[5]。

1.5脂多糖(LPS)誘導豬細胞免疫應激模型的建立

在基礎培養(yǎng)液中分別加入0(對照)、0.1、1.0、10.0、100.0 μg/mL的LPS，誘導細胞產生免疫應激，每組24個重復(1個24孔板)，每孔為1個重復。于培養(yǎng)后0、9、18、36 h觀察細胞狀態(tài)(圖1)，從中選擇10 μg/mL和培養(yǎng)18 h分別為試驗LPS濃度和考察時間點。在應激的細胞培養(yǎng)皿中移去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，添加600 μg/mL的LAAS，0、3、6、12、24、48 h后檢測培養(yǎng)液中細胞的pBD-1、pBD-2、pBD-3基因的表達情況，從中選擇3個基因表達量均較高的24 h時間點作為試驗考察時間點；然后在此時間點上，分別考察0、75、150、300、600、1 200 μg/mL 6個濃度的LAAS對PFSFpBD-1、pBD-2、pBD-3基因的表達的影響。

A：無任何處理的細胞；B：10 μg/mL脂多糖誘導的免疫應激狀態(tài)細胞；C：應激后換用含有LAAS的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后的細胞；D：100 μg/mL脂多糖誘導的過度應激死亡細胞。

A: cells without any treatment; B: immune stress cells induced by 10 μg/mL LPS; C: cells cultured in culture medium containing LAAS for 24 h after stress; D: dead cells of excessive stress induced by 100 μg/mL LPS.

圖1不同形態(tài)的PFSF

Fig.1PFSF in different modality

1.6細胞培養(yǎng)液中LDH、NOS、LSZ活性及NO含量的測定

細胞培養(yǎng)液中LDH活性采用比色法測定；NO含量采用硝酸還原酶法測定；NOS活性采用比色法測定；LSZ活性采用比濁法測定。所有測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.7總RNA提取

各組織及細胞總RNA提取按照RNAsimple Total RNA Kit(北京天根)試劑盒說明書進行，每50～100 mg組織加1 mL裂解液。各組織經過研磨粉碎勻漿后，加入氯仿萃取。最后得到的總RNA溶解于超純水中，總RNA的純度與濃度分別用分光光度計在260與280 nm下檢測，OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0之間方可采用。

1.8反轉錄

采用相同濃度的總RNA樣品按試劑盒(TaKaRa，日本)說明書要求配制反轉錄反應液，總體系10 μL。用于實時熒光定量的反轉錄產物(cDNA)于-20 ℃保存。

1.9常規(guī)PCR反應結果

以提取的RNA反轉錄產物作為模板進行常規(guī)PCR反應，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，結果如圖2所示，基因PCR擴增產物條帶清晰、明亮、無雜帶，說明引物可以特異性擴增出目的產物。

Marker：100 bp DNA分子量標準；1：pBD-1基因；2：pBD-2基因；3：pBD-3基因；4：β-肌動蛋白；5：甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因；6：18S rRNA。

Marker：100 bp DNA ladder marker；1：pBD-1 gene；2：pBD-2 gene；3：pBD-3 gene；4：ACTBgene；5：GAPDHgene；6：18S rRNA.

圖2PCR產物2%瓊脂糖凝膠電泳結果

Fig.2Results of 2% agarose gel electrophoresis of PCR product

1.10實時熒光定量PCR

表1　實時熒光定量PCR引物參數(shù)Table 1　Parameters of primers for RT-qPCR

1.11數(shù)據(jù)分析

所有組織的防御素表達量均以GAPDH、18SrRNA、ACTB為內參基因，最終以mRNA相對表達量來表示，相對熒光定量計算方法采用Pfaffl[7]方法計算。所有數(shù)據(jù)均采用Excel進行整理，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，結果用平均值±標準差表示，各組織間的基因表達采用Duncan氏法進行多重比較。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2結果

2.1烏金豬與約大烏豬的血清生化指標

如表2所示，烏金豬血清LSZ活性和IgG含量顯著高于約大烏豬(P<0.05)，血清NO含量極顯著低于約大烏豬(P<0.01)。烏金豬血清LDH和NOS活性低于約大烏豬，但差異不顯著(P>0.05)。

表2　烏金豬與約大烏豬的血清生化指標Table 2　The serum biochemical indices of Wujin pigs and Yuedawu pigs

同行數(shù)據(jù)肩標小寫字母不同者表示差異顯著(P<0.05)，肩標大寫字母不同者表示差異極顯著(P<0.01)，肩標無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), while with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

2.2烏金豬與約大烏豬不同組織間pBD-1、pBD-2、pBD-3基因的表達差異

2.2.1不同組織間pBD-1基因的表達規(guī)律

如圖3-a所示，烏金豬和約大烏豬各個組織中均用實時熒光定量PCR方法檢測到pBD-1基因的表達。在烏金豬不同組織間pBD-1基因表達量較高的組織為皮膚和卵巢，表達量較低的組織為心臟和腎臟。在約大烏豬不同組織間pBD-1基因表達量較高的組織為皮膚和卵巢，表達量較低的組織為心臟和肌肉。

2.2.2不同組織間pBD-2基因的表達規(guī)律

如圖3-b所示，烏金豬和約大烏豬各個組織中均用實時熒光定量PCR方法檢測到pBD-2基因的表達。在烏金豬不同組織間pBD-2基因表達量較高的組織為肝臟和腎臟，表達量較低的組織是心臟和肌肉。在約大烏豬不同組織間pBD-2基因表達量較高的組織為肝臟和腎臟，表達量較低的組織為肌肉和胰腺。

2.2.3不同組織間pBD-3基因的表達規(guī)律

如圖3-c所示，烏金豬和約大烏豬各個組織中均用實時熒光定量PCR方法檢測到pBD-3基因的表達。在烏金豬不同組織間pBD-3基因表達量較高的組織為皮膚和睪丸，表達量較低的組織為心臟和十二指腸。在約大烏豬不同組織間pBD-3基因表達量較高的組織為皮膚和卵巢，表達量較低的組織為肌肉和空腸。

1：心臟 heart；2：肝臟 liver；3：肺臟 lung；4：腎臟 kidney；5：皮膚 skin；6：肌肉 muscle；7：卵巢 ovary；8：睪丸 testis；9：胰腺 pancreas；10：十二指腸 duodenum；11：空腸 jejunum；12：回腸 ileum

同一品種豬數(shù)據(jù)柱形標注小寫字母不同者表示差異顯著(P<0.05)，大寫字母不同者表示差異極顯著(P<0.01)。同一組織數(shù)據(jù)柱形標注*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。圖4同。

Data columns of the same breed of pigs with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). Data columns of the same tissue with * mean significant difference (P<0.05), and with ** mean significant difference (P<0.01). The same as Fig.4.

圖3烏金豬與約大烏豬不同組織間pBD-1，pBD-2，pBD-3基因的表達差異

Fig.3Difference ofpBD-1，pBD-2，pBD-3 genes expression in different tissues ofWujinpigs andYuedawupig

2.3LAAS對PFSF培養(yǎng)液應激參數(shù)的影響

如表3所示，正常細胞：與對照組比較，300 μg/mL LAAS極顯著降低了培養(yǎng)液中LDH活性(P<0.01)，再增加LAAS濃度LDH活性繼續(xù)增加。應激細胞：與對照組相比，300 μg/mL LAAS極顯著降低了培養(yǎng)液中LDH活性(P<0.01)，再增加LAAS濃度LDH活性繼續(xù)增加。

不論是正常細胞還是LPS應激細胞，各LAAS組培養(yǎng)液中NO含量均極顯著高于對照組(除75 μg/mL組正常細胞外)(P<0.01)，正常細胞和應激細胞培養(yǎng)液中NO含量均以600 μg/mL LAAS組最高，分別為(16.50±3.76) μg/mL和(20.39±2.81) μg/mL。

正常細胞：隨著LAAS濃度的增加，培養(yǎng)液NOS活性呈上升趨勢。應激細胞：隨著LAAS濃度的增加，培養(yǎng)液中NOS活性呈下降趨勢。應激細胞與正常細胞相比，0、75和150 μg/mL LAAS組NOS活性顯著或極顯著增加(P<0.05或P<0.01)。

正常細胞：添加600、1 200 μg/mL LAAS時LSZ活性極顯著低于對照組(P<0.01)。應激細胞：添加300、1 200 μg/mL LAAS時LSZ活性極顯著低于對照組(P<0.01)。添加150、300、600和1 200 μg/mL LAAS時應激細胞與正常細胞LSZ活性差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)。

表3　LAAS對PFSF培養(yǎng)液應激參數(shù)的影響Table 3　Effect of LAAS on stress parameters of culture medium of PFSF

同行數(shù)據(jù)肩標小寫字母不同者表示差異顯著(P<0.05)，肩標大寫字母不同者表示差異極顯著(P<0.01)；同一指標、同列數(shù)據(jù)肩標*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference(P<0.05)，and with different capital letter superscripts mean significant difference(P<0.01). In the same column, values of the same index with * mean significant difference(P<0.05), and with ** means significant difference.

2.4LAAS對PFSFpBD-1、pBD-2和pBD-3基因表達的影響

如圖4-a所示，應激細胞pBD-1基因的表達量均高于正常細胞，LAAS濃度為0、75、300 μg/mL時差異極顯著(P<0.01)，LAAS濃度為150 μg/mL時差異顯著(P<0.05)。隨著LAAS濃度的增加，應激細胞和正常細胞pBD-1基因的表達量均增加，當LAAS濃度為150 μg/mL時，pBD-1基因的表達量最高，隨后呈降低趨勢。

由圖4-b所示，應激細胞pBD-2基因的表達量均高于正常細胞，LAAS濃度為0、75、150、300 μg/mL時差異極顯著(P<0.01)，LAAS濃度為600 μg/mL時差異顯著(P<0.05)。隨著LAAS濃度的增加，應激細胞和正常細胞pBD-2基因的表達量均增加，當LAAS濃度為150 μg/mL時，pBD-2基因表達量最高，隨后呈降低趨勢。

由圖4-c所示，應激細胞pBD-3基因的表達量均高于正常細胞，LAAS濃度為0、75 μg/mL時

差異極顯著(P<0.01)，LAAS濃度為150、1 200 μg/mL時差異顯著(P<0.05)。隨著LAAS濃度的增加，應激細胞和正常細胞pBD-3基因的表達量均增加，當LAAS濃度為150 μg/mL時，pBD-3基因表達量最高，隨后呈降低趨勢。

圖4　LAAS對PFSF pBD-1, pBD-2, pBD-3基因表達的影響Fig.4　Effect of LAAS on expression of pBD-1, pBD-2 and pBD-3 genes of PFSF

3討論

3.1血清生化指標的變化

血液免疫球蛋白濃度是仔豬免疫功能和健康的重要標識之一。IgG具有免疫替代和免疫調節(jié)的雙重治療效果[8]。本試驗結果顯示，烏金豬血清IgG含量顯著高于約大烏豬，血清NO含量、LDH和NOS活性低于約大烏豬。NO在免疫反應中具有重要作用，通過非特異性殺傷細菌、真菌、寄生蟲和腫瘤細胞而增強非特異性免疫功能，適量的NO含量有助于宿主增強免疫能力。烏金豬血清LSZ活性顯著高于約大烏豬，在畜禽養(yǎng)殖中，應用LSZ可以提高仔豬的生產性能、降低腹瀉率、增強免疫力[9]。結果提示，培育豬種約大烏豬的免疫功能發(fā)生了適應性變化。

3.2品種差異和組織特異性

本研究發(fā)現(xiàn)，烏金豬與約大烏豬不同組織中pBD-1基因表達量較高的組織為皮膚和卵巢，pBD-2基因表達量較高的組織為肝臟和腎臟，與Veldhuizen等[10]檢測的雜交豬(約克夏×荷蘭長白豬)防御素表達結果類似。pBD-3基因表達模式與pBD-1相似，在皮膚、睪丸和卵巢中表達量較高，這與Sang等[11]報道的遠親雜交豬pBD-3基因在十二指腸、肝臟、皮膚、睪丸及附睪上表達較高的試驗研究結果不完全一致，原因可能與豬種及日齡有關。已有研究證明，不同日齡、不同健康狀況的試驗動物具有不同的防御素基因表達模式[12-13]。迄今為止，有關云南高原本地烏金豬和約大烏豬不同組織間防御素基因表達差異的研究報道尚未見到。

皮膚作為機體和環(huán)境間的第1道屏障，它的破壞易使病原菌直接入侵機體，導致炎癥甚至發(fā)生疾病。本試驗結果表明，烏金豬和約大烏豬pBD-1、pBD-3基因在皮膚的表達量最高，皮膚表面防御素的大量存在有利于增強豬機體的抗病能力。

小腸不僅是動物消化吸收的主要場所，也是機體重要的免疫器官。安沙等[14]研究報道，初生到60日齡，pBD-1和pBD-3基因在豬腸道中的表達呈上升趨勢。約大烏豬小腸中pBD-1、pBD-3基因的表達量高于烏金豬。結果提示，含有烏金豬血緣的約大烏豬小腸免疫功能發(fā)生了適應性改變。

在心臟、腎臟和肌肉等組織器官中，均檢測到防御素基因的表達。防御素基因在肝臟、腎臟中表達趨勢一致，均為約大烏豬高于烏金豬，pBD-2基因在肝臟和腎臟的表達量極顯著高于其他組織，為所檢測12個組織中表達量最高的2個組織，結果與Veldhuizen等[10]報道的雜交豬(約克夏×荷蘭長白豬)防御素表達結果一致。

胰腺中，pBD-1基因在約大烏豬的表達量低于烏金豬，而pBD-2、pBD-3基因在約大烏豬的表達量則高于烏金豬，有關胰腺中防御素基因表達差異與胰腺功能間的聯(lián)系有待于進一步研究。

本試驗結果表明，絕大多數(shù)約大烏豬組織中防御素基因的表達量高于烏金豬。

3.3細胞免疫應激參數(shù)變化

試驗研究選擇本試驗團隊提供的東亞飛蝗為試驗材料，選用東亞飛蝗針刺蘸大腸桿菌法誘導其產生抗菌活性物質。鄒峰[15]通過對各種家蠅幼蟲抗菌肽誘導表達方式進行篩選，以抗菌活性為指標，確定了豬糞飼養(yǎng)誘導法。索相敏等[16]以黃粉蟲幼蟲和甜菜夜蛾幼蟲為材料，發(fā)現(xiàn)以針刺蘸大腸桿菌法誘導得到的抗菌肽的抑菌活性最強。LDH存在于豬體內各組織器官中，是國際上常用的評價細胞存活狀態(tài)、生長狀態(tài)和損傷狀態(tài)的檢測指標，用于檢測細胞整體損傷，損傷細胞因胞溶作用而使LDH釋放于細胞外。駱雪等[17]研究報道，L-精氨酸能夠降低豬胎兒PFSF培養(yǎng)液中LDH活性，提高NO含量以及NOS、LSZ活性。本試驗結果表明，以LPS刺激PFSF產生免疫應激時，NO含量及LDH、NOS、LSZ活性免疫應激參數(shù)均發(fā)生不同程度的升高，添加適宜濃度的LAAS有利于維持細胞形態(tài)和正常生長。有研究表明，通過減少白細胞來促進誘導型NOS產生，能保護腸道免受炎癥損傷[18]。

3.4LAAS對PFSF防御素基因的誘導表達

細胞培養(yǎng)結果顯示，LAAS可誘導豬防御素基因的表達，LPS誘導豬免疫應激細胞防御素基因表達量均明顯高于正常細胞。雖然目前關于防御素產生的分子機制還不十分清楚，但當細菌微生物侵襲時，LPS、細菌鞭毛等可被模式識別受體識別和結合，啟動機體免疫防御反應[19]，從而產生大量防御素。研究表明，LPS可以誘導上皮細胞產生防御素[20]，與本試驗結果一致。

在本試驗所設計的LAAS濃度范圍之內，LAAS對防御素基因具有誘導表達作用，當LAAS濃度為150 μg/mL時，均能顯著提高pBD-1、pBD-1和pBD-3基因的表達量。有研究表明，昆蟲抗菌肽不僅對細菌有殺傷作用，而且對真菌、病毒、腫瘤細胞和病原蟲具有廣泛的抑制作用[21]，與本試驗結果一致。LAAS濃度與豬不同組織β-防御素表達量之間的適宜劑量效應仍需要進一步研究。本試驗豬不同組織和LAAS濃度對免疫應激細胞防御素基因表達的調節(jié)作用及其細胞免疫應激參數(shù)研究結果提示，有關LAAS提高豬的免疫力和機體抗病能力的機制值得進一步深入研究。

4結論

① 烏金豬血清LSZ活性、IgG含量顯著高于約大烏豬，血清NO活性極顯著低于約大烏豬。

② 烏金豬和約大烏豬防御素基因的表達存在明顯的品種差異性和組織特異性。2個品種豬的pBD-1、pBD-3基因均在皮膚和卵巢表達量較高，pBD-2基因在肝臟和腎臟表達量較高。

③ 適宜濃度的LAAS能夠降低細胞LDH活性，增加NO含量及NOS、LSZ活性。

④ 適宜濃度的LAAS能夠上調應激細胞與正常細胞防御素的表達量，且LAAS濃度為150 μg/mL時，pBD-1、pBD-1和pBD-3基因的表達量最高。

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*Contributed equally

**Corresponding author, professor, E-mail: rongfug@163.com

(責任編輯李慧英)

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.07.014

收稿日期：2016-1-29

基金項目：云南省重大科技專項基金(2012ZA018)；云南現(xiàn)代農業(yè)生豬產業(yè)技術體系2014[云財教]105#、2015[云財教]90#、2016[云財教]112#

作者簡介：李美荃(1986—)，女，黑龍江哈爾濱人，博士研究生，從事豬的營養(yǎng)與免疫基礎研究。E-mail: limeiquan2010@163.com **通信作者：郭榮富，教授，博士生導師，E-mail: rongfug@163.com

中圖分類號：S828

文獻標識碼：A

文章編號：1006-267X(2016)07-2096-10

The Expression of β-Defensins Genes in Tissues ofWujinandYuedawuPigs and Effect of Locust Antibacterial Active Substances on Expression of β-Defensins Genes

LI MeiquanLIU Hong*ZHANG ChunyongAN QingcongLUO XueCHEN KelinGUO Rongfu**

(Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science of Yunnan Province， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China)

Abstract:This experiment was aimed to investigate the expression of β-defensin-1 (pBD-1), β-defensin-2 (pBD-2) and β-defensin-3 (pBD-3) genes in different tissues of Wujin pigs and Yuedawu pigs with the blood of Wujin pigs, and also investigate the effect of locust antibacterial active substances (LAAS) on the immune stress parameters and expression of β-defensins (pBDs) in procine fetal skin fibroblasts (PFSF). The expression differences of pBD-1, pBD-2 and pBD-3 genes were determined by real-time PCR in 12 tissues such as heart, liver, lung, kidney, jejunum, ileum, duodenum, skin, muscle, pancreas, testis and ovary of 2-month-old Wujin and Yuedawu pigs. The cultured 4th to 5th generations of PFSF were used, and immune stress model was induced by lipopolysaccharides (LPS). Adding different concentrations (0, 75, 150, 300, 600 and 1 200 μg/mL) of LAAS in DMEM/F12 culture medium, and the effect of LAAS on the immune stress parameters and expression of pBD-1, pBD-2 and pBD-3 genes in PFSF were studied. The results showed as follows: 1) the serum lysozyme (LSZ) activity and immunoglobulin G (IgG) content of Wujin pigs were significantly higher than those of Yuedawu pigs (P<0.05), and serum nitric oxide (NO) content of Wujin pigs was extremely significantly lower than that of Yuedawu pigs (P<0.01). 2) The expression of pBD-1, pBD-2 and pBD-3 genes in most tissues of Yuedawu pigs were higher than those of Wujin pigs. The expression of pBD-1 and pBD-3 genes in skin and ovary of two breeds pigs were higher than those in other tissues, and the expression of pBD-2 gene in liver and kidney of two breeds pigs was higher than that in other tissues. 3) The supplementation of 300 μg/mL LAAS extremely significantly decreased lactate dehydrogenase (LDH) activity in culture medium (P<0.01). LAAS could extremely significantly increased NO content in culture medium except for the 75 μg/mL LAAS group in normal cells (P<0.01), and that in normal cells and stressed cells both reached the highest when LAAS concentration was 600 μg/mL. When LAAS concentrations were 0, 75 and 150 μg/mL, nitric oxide synthase (NOS) activity in stressed cells was significantly higher than that in normal cells (P<0.05 or P<0.01). The supplementation of 1 200 μg/mL LAAS extremely significantly decreased LSZ activity in culture medium (P<0.01). When LAAS concentrations were 150, 300, 600 and 1 200 μg/mL, LSZ activity had significant differences in normal cells and stressed cells (P<0.05 or P<0.01). 4) The expression of pBD-1, pBD-2 and pBD-3 genes in stressed cells were higher than those in normal cells. When LAAS concentration was 150 μg/mL, the expression of pBD-1, pBD-2 and pBD-3 genes all reached the highest. The results indicate that there are significant differences in species and tissues specificity of the expression of pBDs genes in Wujin and Yuedawu pigs. The proper concentration of LAAS can decrease LDH activity, but increase NO content and the activities of NOS and LSZ in PFSF, and up-regulate the expression of pBDs in both stressed cells and normal cells.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(7)：2096-2105]

Key words:Wujin pigs; Yuedawu pigs; β-defensins; immune stress; locust antibacterial active substances