高分化PC12細(xì)胞電化學(xué)行為研究①

劉　冰,焦　宇,王思君,屈天龍,邱　丹,朱金玲,李光植

(1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007; 2. 佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

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高分化PC12細(xì)胞電化學(xué)行為研究①

劉冰1,焦宇1,王思君1,屈天龍1,邱丹1,朱金玲2,李光植1

(1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007; 2. 佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

摘要:目的: 研究高分化PC12細(xì)胞的電化學(xué)行為。方法：采用單線伏安法研究高分化PC12細(xì)胞電化學(xué)行為，并通過電化學(xué)、高效液相以及黃嘌呤氧化酶催化方法對電化學(xué)信號進(jìn)行歸屬。結(jié)果：高分化PC12細(xì)胞的兩個電化學(xué)信號分別來源于鳥嘌呤和黃嘌呤的混合以及次黃嘌呤和腺嘌呤的混合。結(jié)論：采用電化學(xué)方法可以檢測到高分化PC12細(xì)胞來源于嘌呤的電化學(xué)信號，對以高分化PC12細(xì)胞為模型的生命科學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)上的研究具有重要意義。

關(guān)鍵詞：高分化PC12細(xì)胞；嘌呤；電化學(xué)

高分化PC12細(xì)胞為大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤克隆化的細(xì)胞株，經(jīng)常作為一種神經(jīng)細(xì)胞的模型[1]。具有較典型的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)分泌特征，近年來廣泛用于信號的傳導(dǎo)與細(xì)胞神經(jīng)毒性和神經(jīng)保護(hù)機(jī)制研究[2, 3]。本文采用電化學(xué)方法探索高分化PC12細(xì)胞，對其電化學(xué)行為進(jìn)行研究[4～6]，通過高效液相方法和酶催化方法佐證[7, 8]，確定電化學(xué)信號的來源。為高分化PC12細(xì)胞的研究提供一個新的思路和手段。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

高分化PC12細(xì)胞購買于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；電化學(xué)工作站為上海辰華儀器有限公司；優(yōu)級胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和雙抗購于Gibco公司；黃嘌呤氧化酶購于Sigma公司；多壁碳納米管(MWNTs)購于深圳納米港有限公司；離子液體(bmim-PF6)購于百靈威科技有限公司。所用水均為三次蒸餾水，所有試劑均為分析純。

1.2高分化PC12細(xì)胞的培養(yǎng)、收集以及處理

高分化PC12細(xì)胞加適量的DMEM培養(yǎng)液，放置于37℃、5% CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將生長狀態(tài)良好的貼壁高分化PC12細(xì)胞取出，除去培養(yǎng)基，用pH 7.4的PBS緩沖溶液沖洗3次，然后加入適量pH 7.4的PBS緩沖溶液，50℃水浴裂解30 min，獲得細(xì)胞裂解液，將其用于電化學(xué)和高效液相檢測。

1.3酶催化高分化PC12細(xì)胞裂解液處理過程

在一定量高分化PC12細(xì)胞裂解液中加入適量的黃嘌呤氧化酶， 37℃水浴10min，以保證黃嘌呤氧化酶對細(xì)胞裂解液中的黃嘌呤和次黃嘌呤的催化作用。

1.4電化學(xué)檢測

電化學(xué)檢測采用三電極體系：以多壁碳納米管復(fù)合離子液體修飾玻碳電極為工作電極，飽和Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為對極，對上述裂解液進(jìn)行電化學(xué)檢測，檢測條件：掃速為100mv·s-1，掃描電位為0～1.1V，富集時間為480s。

1.5高效液相檢測

色譜條件：Ascenis RP-Amide 柱；DAD檢測器；檢測波長為254nm；流動相為磷酸二氫鉀溶液；流速為1.0mL·min-1。

2結(jié)果與討論

2.1高分化PC12細(xì)胞裂解液的伏安行為

高分化PC12細(xì)胞裂解液的伏安曲線如圖1所示。四種嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品混合物的伏安曲線在0.68、0.92和1.0V處出現(xiàn)3個不可逆的氧化峰(見圖1Aa)，可歸屬為鳥嘌呤與黃嘌呤的混合氧化峰，腺嘌呤以及次黃嘌呤的氧化峰(見圖1B)。高分化PC12細(xì)胞裂解液的伏安曲線出現(xiàn)2個氧化峰(圖1Ab)，其峰電位與混合標(biāo)準(zhǔn)品的鳥嘌呤與黃嘌呤的混合氧化峰以及腺嘌呤和次黃嘌呤的氧化峰峰位接近。因此，高分化PC12細(xì)胞裂解液2個氧化峰可能分別來源于鳥嘌呤與黃嘌呤的混合，以及腺嘌呤與次黃嘌呤的混合。

2.2液相色譜法分析高分化PC12細(xì)胞裂解液

為證明高分化PC12細(xì)胞中含有四種嘌呤，對高分化PC12細(xì)胞裂解液進(jìn)行高效液相檢測，結(jié)果見圖2。高分化PC12細(xì)胞裂解液出現(xiàn)五個色譜峰，保留時間分別為11.51、13.10、14.91、16.82和26.78min。在此細(xì)胞裂解液中加入尿酸、次黃嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品后，五個色譜峰均有增高，說明細(xì)胞裂解液中五個色譜峰分別為尿酸、次黃嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤。

2.3黃嘌呤氧化酶對高分化PC12細(xì)胞的催化作用

黃嘌呤氧化酶具有將次黃嘌呤氧化為黃嘌呤，再將黃嘌呤氧化為尿酸的作用。為進(jìn)一步證明高分化PC12細(xì)胞裂解液兩個電化學(xué)信號峰的來源，對比了加黃嘌呤氧化酶催化前后高分化PC12細(xì)胞裂解液的電化學(xué)伏安曲線(見圖3)。黃嘌呤氧化酶催化前，高分化PC12細(xì)胞裂解液0.68V處的峰I和1.0 V處的峰II(圖3 a線)，經(jīng)黃嘌呤氧化酶催化后，峰I的峰面積大幅減小，說明峰I中的黃嘌呤已被氧化，剩下的峰為鳥嘌呤峰；峰II幾乎消失不見，說明峰II中的次黃嘌呤已被氧化，而由于細(xì)胞中腺嘌呤含量低，幾乎檢測不到，因此，峰II主要來源于次黃嘌呤；在0.3V左右處出現(xiàn)新的尿酸峰，表明經(jīng)酶催化后，黃嘌呤和次黃嘌呤均轉(zhuǎn)化為尿酸。

圖1(A)高分化PC12細(xì)胞裂解液伏安圖：(a) 5×10-6mol·L-1黃嘌呤、鳥嘌呤、腺嘌呤和次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品混合液，(b) 高分化PC12細(xì)胞裂解液，細(xì)胞濃度: 2×106cells·mL-1；(B)嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品伏安圖：(a) 5×10-6mol·L-1黃嘌呤 (b) 5×10-6mol·L-1鳥嘌呤 (c) 5×10-6mol·L-1腺嘌呤 (d) 5×10-6mol·L-1次黃嘌呤

圖2高分化 PC12 細(xì)胞裂解液(A線)與高分化 PC12 細(xì)胞裂解液和四種嘌呤、尿酸標(biāo)準(zhǔn)品混合物(B線)的高效液相色譜圖

(a)尿酸(b)次黃嘌呤 (c)鳥嘌呤(d)黃嘌呤(e)腺嘌呤

圖3　黃嘌呤氧化酶催化前后高分化PC12細(xì)胞裂解液伏安圖

(a) 高分化PC12細(xì)胞裂解液，(b) 黃嘌呤氧化酶催化后的高分化PC12細(xì)胞裂解液，細(xì)胞濃度:2×106cells·mL-1

3討論

采用離子液體/多壁碳納米管修飾的玻碳電極對高分化PC12細(xì)胞進(jìn)行檢測，通過高效液相佐證，黃嘌呤氧化酶的催化作用，確定了高分化PC12細(xì)胞電化學(xué)信號I來源于黃嘌呤和鳥嘌呤，而信號II來源于次黃嘌呤和腺嘌呤。高分化PC12細(xì)胞具有典型的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)分泌特征，對其代謝過程中嘌呤含量的變化的檢測在生命科學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)上均有重要意義。

參考文獻(xiàn):

[1]Ci Y X, Zhai Q, Wang S, et al. Voltammetric studies of the effect of Cisplatin-liposome on Hela cells[J]. Talanta, 2001, 55: 693-698

[2]張金波,王淑秋,朱金玲,等. 大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)化[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2009, 32(4): 20-21

[3]張金波,王淑秋,張春斌,等. 體外培養(yǎng)新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞方法的探究[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2007,30(2):25

[4]孫海中,周成福,馬曉茹,等.大鼠脊髓損傷早期Survivivn表達(dá)規(guī)律與細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2009,32(4):29-31

[5]鄭衍芳,呂文昌,孫田靜,等.蟲草素在Aβ1-42寡聚體誘導(dǎo)AD模型大鼠神經(jīng)元損傷中的作用[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2009,32(4):8-11

[6]胡金玲,孟凡榮,沈明格,等.紅花注射液對腦復(fù)蘇大鼠神經(jīng)元凋亡相關(guān)基因的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2014,37(4):29-30

[7]Fukada K,Shoda T,Mima H,et al. Midazolam induces expression of cfos and EGR-1 by a non-GABA ergic mechanism[J].Anesth Analg,2002,95:373-378

[8]Shinomiya N, Shinomiya M. Dichlorodiphenyltrichoethane suppresses neurite outgrowth and induces apoptosis in PC pheochromocytoma cells[J].Toxicol lett,2003,137:175-183

[9]武冬梅,胡玲,劉繼光,等.基于MCF-7細(xì)胞質(zhì)伏安行為的電化學(xué)抗腫瘤藥物敏感試驗研究[J].藥物分析雜志,2011,31(5):857-861

[10]Wu D M, Fu G L, Hu L, et al. Studies on the origin of the voltam-metric response of the PC-3 cell suspension[J].Talanta,2009,78(2):602-607

[11]Wang J T, Li X E, Zhang Y, et al. Voltammetric behavior of the MCF-7 cell cytoplasm and the effect of taxol on voltammetric response[J]. Analytical Biochemistry, 2009,394(2):229-236

[12]Parks D A, Granger D N. Xanthine oxidase: biochemistry, distribution and physiology[J]. Acta Physiol Scand Supple, 1986, 548:87-99

[13]展鵬, 劉濤, 劉新泳. 以黃嘌呤氧化酶為靶點的新型非嘌嘌呤類抗痛風(fēng)及高尿酸血癥藥物研究進(jìn)展[J]. 中國藥物化學(xué)雜志, 2012, 22(5): 403-415

基金項目：①1.佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項目，編號：LM2014-056；2.黑龍江省自然科學(xué)基金項目，編號：H201369。

作者簡介：劉冰(1989～)女，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。 通訊作者：李光植(1965～)男，黑龍江佳木斯人，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:liguangzhi2009@163.com。

中圖分類號:R965.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號：1008-0104(2016)04-0103-02

(收稿日期：2016-02-20)