小鼠外周血單個核細胞分離、純化①

徐太哲，李　麗，王長山

(1.佳木斯市紅十字醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

?

小鼠外周血單個核細胞分離、純化①

徐太哲1，李麗2，王長山2

(1.佳木斯市紅十字醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

摘要:目的:探討小鼠外周血單個核細胞(PBMC)最佳分離條件，提高細胞獲得率與純度，以便后續(xù)分子生物學(xué)實驗。方法:小鼠摘除眼球取血，設(shè)置離心力、離心時間、實驗環(huán)境溫度等梯度優(yōu)化，分別采用EDTA-K2、肝素、枸櫞酸鈉 抗凝，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離單個核細胞，直接進行貼壁培養(yǎng)和分析獲得率、純度，計數(shù)存活率。結(jié)果:Ficoll密度梯度離心法經(jīng)條件優(yōu)化后分離的PBMC純度可達85%，細胞獲得率最高可達80%以上，活細胞百分率在92%以上。結(jié)論:Ficoll密度梯度離心法在優(yōu)化條件下可有效地分離PBMC，對后續(xù)分子生物學(xué)實驗無影響。

關(guān)鍵詞：小鼠;Ficoll密度梯度離心;PBMC

外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)包括淋巴細胞和單核細胞。是免疫系統(tǒng)的重要組成，是研究免疫老化和衰老的主要依據(jù)。研究T、B淋巴細胞首要分離外周血單個核細胞，主要的分離方法是Ficoll-hypaque密度梯度離心法，因血液中各組成成分的沉降系數(shù)存在差異，而得以分離[1]。離心后，單個核細胞因與分離液密度相當，集中在血漿層和分層液的界面上，呈白霧層，吸取該層細胞經(jīng)洗滌離心即獲得PBMC。PBMC分離是分子生物學(xué)試驗常用的技術(shù)，其效果直接影響PCR等后續(xù)試驗結(jié)果。實驗對象小鼠因體重小，體內(nèi)血液量少，F(xiàn)icoll密度梯度離心法正適用這樣少量血液的分離，本文探討小鼠外周血單個核細胞的分離最佳條件。

1材料和方法

1.1材料與分組

BALB/c小鼠18只，5～6月齡，體重23～25g，雌雄不限；小鼠外周血單核細胞分離液試劑(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)。

1.2 方法

1.2.1取血與離心

摘除眼球取血：抓取小鼠，側(cè)臥位，食指按壓眼部皮膚致眼球突出。眼科彎鑷迅速摘除眼球，倒立鼠，接取滴流血液。采血完畢紗布壓迫止血[2]。每次采血量0.7～1mL。按乙二胺四乙酸鹽(EDTA-K2)抗凝、肝素抗凝、枸櫞酸鈉抗凝，將抗凝血標本分為3個實驗組，每組6例，相互對照[3]。

Ficoll密度梯度離心：首先取抗凝血與RPMI1640培養(yǎng)液等體積混勻，再加相當于抗凝血2倍體積的淋巴細胞分離液，于400～600×g離心20～30min，謹慎吸取單核細胞層，RPMI1640培養(yǎng)液洗兩遍備用[4～7]。

因細胞獲得率與純度關(guān)系到實驗效果，一般根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，其離心時間越長，最終目的是達到最佳分離效果，對于小鼠本實驗依據(jù)離心力、離心時間等設(shè)置優(yōu)化梯度，因細胞獲得率的高低與室溫還有關(guān)，室溫設(shè)置3個優(yōu)化梯度[8]。

1.2.2PBMC的差異貼壁法純化

將獲取的PBMC計數(shù)后，用單核細胞完全培養(yǎng)基以4×106個/mL的密度重懸細胞，將細胞鋪于24孔培養(yǎng)板，每孔2×106細胞，放于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中進行貼壁培養(yǎng)。2～4h內(nèi)貼壁的為巨噬細胞前體(俗稱為單核細胞)，吸去培養(yǎng)液上清，用RPMI1640培養(yǎng)液輕輕洗滌培養(yǎng)孔3次，去除非貼壁細胞。收集貼壁細胞即獲得貼壁法純化的PBMC。

1.2.3PBMCs純度

收集貼壁細胞，用含有10%小牛血清的RPMI1640重懸后，涂片進行瑞氏(美藍-伊紅Y)染料，計數(shù)100個細胞，計算單個核細胞純度，單個核細胞純度=(淋巴細胞數(shù)+單核細胞數(shù))/總細胞數(shù)×100%。

1.2.4計數(shù)PBMCs

洗滌1.2.2獲得的PBMCs 2次，即加適量PBS或RPMI1640培養(yǎng)液、混勻、600g離心5min棄上清，重復(fù)2次。加PBS懸浮細胞，臺盼藍染液染色，死的細胞可被染成藍色，活細胞不著色。倒置顯微鏡10× 物鏡下計數(shù)200個PBMCs活細胞百分率和細胞總數(shù)(存活率=活細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%)。

1.2.5統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1抗凝劑分離的PBMC細胞獲得率、純度、存活率

PBMC獲得率：EDTA-K2組與肝素組比較差異顯著(P<0.05)，EDTA-K2組獲得率較高，而枸櫞酸鈉組與肝素組獲得率比較，差異不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。PBMC純度：EDTA-K2組與肝素組比較差異顯著(P<0.05)，肝素組PBMC純度較高，而枸櫞酸鈉組與EDTA-K2組比較，純度則差異不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。PBMC存活率：EDTA-K2組、肝素組和枸櫞酸鈉組比較，細胞存活率差異不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1　不同抗凝劑分離PBMC獲得率、純度、存活率

注：*P<0.05。

2.2不同離心力、離心時間的PBMC細胞獲得率

在相同離心時間不同的離心力下，500g離心力下效果好于400g和600g；在相同離心力下時間越長收集的PBMCs細胞獲得率越高，但不同時間下差異不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2不同離心力、離心時間的PBMC獲得率

離心力時間20min25min30min400×g70.67±1.4672.05±1.4872.13±1.61500×g87.31±1.9589.90±1.3890.65±1.79600×g77.46±2.2180.78±1.9376.78±1.28

2.3不同環(huán)境溫度下PBMC獲得率

比較20℃、25℃和30℃三個環(huán)境溫度下PBMC獲得率，如表3可知，環(huán)境溫度20℃時PBMC獲得率最高，25℃次之和30℃最低，環(huán)境溫度30℃PBMC獲得率較20℃差異顯著(P<0.05)。20℃與25℃下差異不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3　不同環(huán)境溫度下PBMC獲得率

注：*P<0.05。

3討論

分離PBMC是一項實驗和臨床時常要做的工作,比如外周血單個核細胞培養(yǎng)的上清液中細胞因子等對基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床疾病有一定實用價值[9～14]。傳統(tǒng)方法采用Ficoll-hypaque密度梯度離心，小鼠外周血單核細胞分離液比重為1.080，因血液中各組成成分的沉降系數(shù)存在差異Ficoll在一定離心力的作用下離心時，血液中各組成成分將按密度的梯度重新聚集[15]。密度較低的血小板和血漿懸于分層液上部；密度較大的紅細胞與粒細胞沉于分層液下部；由于PBMC密度稍低于分層液，則位于分層液界面上，小心吸取該層即可獲得PBMC。該法操作需將抗凝血作適當稀釋，比較適用于小鼠等血液量少的分離。特別說明，單核細胞分離液，在分離人PBMC時，其比重為1.077；而分離小鼠單個核細胞時比重為1.080。用本法分離PBMC，經(jīng)條件優(yōu)化后純度可達85%，細胞獲得率最高可達80%以上，活細胞百分率在92%以上。

PBMC的差異貼壁法純化時，收集2～4h內(nèi)貼壁貼壁細胞為巨噬細胞前體(俗稱為單核細胞)，而10～24h內(nèi)貼壁的細胞為內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮祖細胞、干細胞，不貼壁的則為淋巴細胞[16]?？傊?，EDTA-K2組PBMC獲得率較肝素組高，而肝素組PBMCs純度較高，PBMC存活率三組細胞存活率差異不顯著。另外據(jù)報道，枸櫞酸鈉對細胞損傷小些。環(huán)境溫度在30℃PBMC獲得率較20℃差異顯著，超過25℃時會影響細胞獲得率。綜上所述，再考慮到細胞純度、細胞回收率、細胞存活率以及操作的難易等因素，我們認為Ficoll密度梯度離心法在優(yōu)化條件下可有效地分離PBMC，對后續(xù)分子生物學(xué)實驗無影響。

參考文獻：

[1]張素華, 林丹丹, 張美娟,等. Ficoll密度梯度離心法分離豬外周血單個核細胞條件的探討[J]. 中國血吸蟲病防治雜志, 2007, 19(3):192-195

[2]鄧娜, 藺曉源, 蔡光先. 實驗動物眼球取血的中醫(yī)理論探討[J]. 光明中醫(yī), 2014, 29(1):4-5

[3]王翠華, 梁慶久. 幾種抗凝血劑抗凝效果的對比試驗[J]. 四川畜牧獸醫(yī),1997，(2):21-22

[4]韓亞萍, 劉源, 章莉莉,等. 不同方法分離外周血單個核細胞對樹突狀細胞增殖的影響[J]. 放射免疫學(xué)雜志, 2004, 17(4):315-316

[5]羅利瓊, 陳誠華, 張軍. 長期培養(yǎng)外周血單個核細胞的簡易分離純化方法[J]. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2013, 30(4):249-250

[6]胡永波, 展群嶺, 劉海朋,等. 動物外周血單個核細胞分離方法探討[J]. 世界科技研究與發(fā)展, 2010, 32(6):835-839

[7]樊衛(wèi)平, 宋玉靖, 郝顏琴,等. 簡易外周血單個核細胞分離方法的探索[J]. 山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2010, 41(3):274-276

[8]蔡敏敏, 顧曉瓊, 高飛,等. 分離外周血單個核細胞的條件優(yōu)化[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2016,37(1):1-3

[9]劉亞波, 孫玉鴻, 王芳. HBV慢性感染者外周血單個核細胞IL-2、sIL-2R的表達及臨床意義[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2007, 30(6):60

[10]田黎明, 代建華, 郝翠翠. ITP患者外周血單個核細胞中TIM-3和IL-17的表達及意義[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2011, 34(1):62-63

[11]王建杰, 張濤, 羅文哲,等. 川芎嗪對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細胞IL-12mRNA表達的影響[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2005, 28(2):18-19

[12]張富運, 楊建華, 王蕾,等. 骨髓單個核細胞對大鼠脊髓損傷后行為功能影響的研究[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2013, 36(6):44-46

[13]趙中男, 楊建華, 王瑩,等. 骨髓單個核細胞移植對脊髓半橫斷大鼠損傷組織中髓鞘堿性蛋白表達的影響[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2014, 37(1):43-45

[14]季慶輝, 申福國, 孔維麗,等. 骨髓單個核細胞移植對大鼠脊髓全橫斷損傷后髓鞘堿性蛋白表達影響[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2015, 38(1):66-68

[15]肖海波, 段德溥. 體外誘導(dǎo)小鼠骨髓單個核細胞向內(nèi)皮分化的實驗研究[J]. 南通大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版, 2006, 26(5):327-330

[16]周龍, 陳曦, 羅宗平,等. C57BL/6小鼠骨髓單核細胞分離、培養(yǎng)、純化及向破骨細胞的分化[J]. 中國組織工程研究, 2015(6):940-944

基金項目：①1.黑龍江省普通高等學(xué)校青年學(xué)術(shù)骨干支持計劃，編號：1253G057;2.佳木斯大學(xué)自然科學(xué)基礎(chǔ)研究類重點項目，編號：Sjz2012-11。

作者簡介：徐太哲(1967～)男，吉林吉林人，本科，主治醫(yī)師。 通訊作者：王長山(1977～)男，黑龍江佳木斯人，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：wcs0451@163.com。

中圖分類號：R446.11+3

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)04-0010-02

(收稿日期：2016-03-10)