自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血大鼠腦水腫與水通道蛋白-9的表達①

姜廣宇,董　航,顧志成,李洪濱,張世華,史　濤

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

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自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血大鼠腦水腫與水通道蛋白-9的表達①

姜廣宇,董航,顧志成,李洪濱,張世華,史濤

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

摘要:目的：旨在探討自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血大鼠模型中，神經(jīng)組織內(nèi)水通道蛋白9(AQP9)表達變化，了解自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血這一病理生理過程中AQP9與腦水腫的變化，并試圖揭示出其相關性。方法：健康成年雄性大鼠60只,隨機分為假手術組、SAH組,建立大鼠自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血模型。分別建模后24h、48h及72h斷頭、取腦，測腦含水量，并利用RT-PCR技術檢測大鼠腦組織在自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血后AQP9的表達。結果：大鼠自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血后，腦含水量增高，AQP9呈現(xiàn)高表達，且于72h內(nèi)逐漸遞增，明顯高于對照組(P<0.05)。結論：自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血后AQP9高表達和腦水腫呈現(xiàn)正相關，二者可能存在相關性，前者或為后者的原因之一，對自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血后腦水腫而言意義重大。

關鍵詞:水通道蛋白9；腦水腫；腦含水量；自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血

自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血是腦血管意外之一，統(tǒng)計發(fā)病率每年6～20/10萬人。自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血后，腦組織受到血紅蛋白等物質(zhì)的毒性作用，產(chǎn)生一系列病理生理變化，腦水腫則是其中最為重要的變化之一。在腦水腫中,水通道蛋白9起著十分重要的作用[1]，本實驗建立自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血大鼠模型，檢測APQ9的表達，并測量大鼠腦含水量，試圖加深自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血后相關因素對腦水腫發(fā)生的作用的理解。

1材料與方法

1.1材料

健康成年Wistar雄性大鼠80只,假手術組20只，SAH組60只。建模大鼠取自佳木斯大學實驗動物中心。依據(jù)術后時間段，將60只大鼠再次分為三個亞組：12h組、24h組、48h組，每組20只。

1.2動物模型制備1.2.1SAH大鼠模型的制備

枕大池二次注血法建立模型[2],麻醉方法：100g/L水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射，固定后,枕外隆突下顯露枕大孔，枕大池內(nèi)注人0.3mL自體血，注射速度為0.lmL/min。1d后再次注血0.2mL，方法同前。術畢仰臥位,頭低30°仰臥30min。

1.2.2假手術組模型制備

手術方式及步驟同SAH組,僅將自體血更換為生理鹽水。

1.3腦組織水含量測定

大鼠斷頭，取腦，一側(cè)大腦半球用于檢測AQP9，另一側(cè)半球以濾紙吸盡血漬,置于干燥的錫紙上稱重,置于恒溫干燥箱內(nèi)48h，溫度為110℃。對比前后濕質(zhì)量及干質(zhì)量,代入公式:腦含水量(%)=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)÷濕質(zhì)量×100%，計算腦含水率。

1.4RT-PCR檢測AQP9的表達

取各組大鼠腦組織，行RT-PCR檢測分析，在提取總RNA后，RNA含量使用紫外分光光度儀測定，1%瓊脂糖凝膠電泳法，檢測總RNA純度，分裝后-80℃?zhèn)溆谩⒔M織總RNA中的mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，取反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA進行40個循環(huán)PCR擴增。實驗結果采用用2-ΔΔCT法法進行比較和統(tǒng)計學分析。

1.5統(tǒng)計學方法

2結果

2.1腦含水量測定

SAH后12h腦組織含水量即增加，并在48h內(nèi)呈遞增，見表1。SAH后12h、24d、48d組與對照組比較，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2腦含水量與AQP49mRNA表達的相關性

由表1可以看出,腦含水量與對應組AQP9表達的變化規(guī)律一致,相關分析得(r=0.768,P<0.01),表明二者具有正相關性。

表1　SAH后大鼠腦含水量和AQP9mRNA表達

注:*與SAH組和假手術組比較，有顯著性差異(P<0.05)。

3討論

自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血是一種常見的腦卒中類型，中國人群發(fā)病率約為每年6～20/10萬人，顱內(nèi)動脈瘤為其主要病因，致死及致殘率較高，對社會危害大。在自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血的病理生理過程中，腦水腫是神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的主要因素之一，這一病理生理過程中，往往是細胞性腦水腫和血管性腦水腫均參與其中。自體血二次注入枕大池法，是比較成熟的自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血大鼠建模方式，該模型可較為完善的模擬出自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血的病理生理過程，是神經(jīng)外科常用的動物模型之一。哺乳動物體內(nèi)，已知 13種水通道蛋白亞型，AQP9是其一。在神經(jīng)系統(tǒng)中，AQP9和其他水通道蛋白成分一起，發(fā)揮著水鹽代謝，各種物質(zhì)轉(zhuǎn)運的作用。本實驗中，在自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血發(fā)生后，AQP9呈現(xiàn)高表達，并隨著時間的延長呈增加趨勢；同時，大鼠腦含水量也呈現(xiàn)出增多現(xiàn)象，提示AQP9與腦水腫呈現(xiàn)正相關性。這一現(xiàn)象表明在自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血后，AQP9表達上調(diào)與腦水腫的相關性。

已有研究發(fā)現(xiàn)，AQP9可出現(xiàn)在腦內(nèi)各個位置，如：神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞等不同部位，這提示在神經(jīng)系統(tǒng)的水鹽代謝中，AQP9在不同的部位發(fā)揮不同的作用。在腦缺血、缺血再灌注損傷，以及腦出血后腦水腫中，AQP9都發(fā)揮著重要的作用[3～5]。本實驗中，自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血可延腦脊液循環(huán)到神經(jīng)系統(tǒng)各處，筆者認為這也是AQP9表達上移與建模時間呈相關性的原因之一。

廉嘵宇等[6]建立自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血的大鼠模型，從中發(fā)現(xiàn)AQP4表達上調(diào)，可在3d內(nèi)達峰，并與腦水腫呈時間正相關，這一結果與本實驗研究結果相類似，同時也提示，水通道蛋白各個亞型，在調(diào)節(jié)水代謝過程中，可有協(xié)同作用。王復新等[7]的研究表明水通道蛋白與基質(zhì)蛋白表達的相關性，提示水代謝可能與血腦屏障的開放存在相關因素，表明水通道蛋白或與血腦屏障的開放有關。

參考文獻:

[1]劉永剛，姜鳳，姜堯佳.高血壓性腦出血周圍腦組織超微結構及腦水腫發(fā)生機制研究[J]．黑龍江醫(yī)藥科學，2009，32(6)：142-143

[2]馬朝暉,李貴福,羅望池,等.改良“二次枕大池注血法”構建Wistar大鼠自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血模型[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志,2012,38(3):190-192

[3]Ribeiro Mde C，Hirt L，Bogousslavsky J，et a1．Time course of aquaporin expression after transient focal cerebral ischemia in mice[J].Neurosic Res，2006，83(7)：1231-1240

[4]Hwang IK，Yoo KY，li H，et a1．Aquaporin 9 changes in pyramidal cells before and is expressed in astrocytes after delayed neuronal death in the ischemic hippocampal CAl region of the gerbil[J].Neurosic Res，2007，85(11)：2470-2479

[5]陳敏，李長清，吳春麗．二硫代氨基甲酸吡咯烷對實驗性腦出血血腫周圍腦組織含水量及水通道蛋白-9表達的影響[J].臨床神經(jīng)病學雜志，2006，19(6)：444-446

[6]廉嘵宇,張秀峰,宣兆博,等.水通道蛋白4mRNA在大鼠自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下出血后腦水腫中的表達及尼莫地平對其表達的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學，209，32(6)：7-8

[7]王復新，張潔，王辰，等．尼莫地平對早期腦出血大鼠AQP4mRNA、MMP-9mRNA表達的影響[J]．黑龍江醫(yī)藥科學，2012，35(4)：1-2

基金項目：①黑龍江省衛(wèi)計委科研課題，編號：2013259。

作者簡介：姜廣宇(1981～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫(yī)師。 通訊作者：董航(1979～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫(yī)師。E-mail:donghang1006@sina.com。

中圖分類號:R642

文獻標識碼:A

文章編號：1008-0104(2016)04-0075-02

(收稿日期：2016-04-05)