Wee1抑制劑聯(lián)合阿霉素對急性白血病細胞的生長抑制作用①

倪　蕾，張西凱，侯志凌，楊　玉，梁衍峰，于廣晴

(1.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學基礎醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154007)

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Wee1抑制劑聯(lián)合阿霉素對急性白血病細胞的生長抑制作用①

倪蕾1，張西凱1，侯志凌1，楊玉2，梁衍峰2，于廣晴1

(1.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學基礎醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154007)

摘要：目的：研究應用Wee1抑制劑PD0166285聯(lián)合阿霉素對急性白血病細胞的生長抑制。方法：以人急性白血病細胞株HL60、NB4、EOL-1為研究對象，采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測PD0166285和阿霉素對細胞的生長抑制作用。結果：單獨用藥實驗結果示，PD0166285或者阿霉素對HL60、NB4、EOL-1均有不同程度的生長抑制作用，并呈明顯的濃度一效應關系。聯(lián)合用藥實驗結果顯示，PD0166285和阿霉素聯(lián)用后對HL60、EOL-1細胞株的抑制率顯著增加，明顯高于單一用藥，且有顯著差異(P<0.05)，對NB4細胞株的抑制率也增加，但無顯著差異(P>0.05)。結論：相對于單獨應用PD0166285或者阿霉素，PD0166285聯(lián)合阿霉素增強了對急性白血病細胞株HL60、EOL-1的生長抑制作用。

關鍵詞：Wee1抑制劑； 阿霉素； 白血??； 增殖抑制； MTT

阿霉素(Adriamycin，ADM；多柔比星，Doxorubicin，DXR)作為蒽環(huán)類抗腫瘤藥物的一種代表，在多種腫瘤尤其急性白血病的治療中參與組成聯(lián)合化療方案，具有良好的療效。阿霉素通過嵌入到DNA雙鏈之間并緊密結合到DNA上形成穩(wěn)定的復合物，破壞DNA的三級結構，從而抑制細胞DNA以及DNA依賴性RNA的合成[1]。阿霉素作為一種細胞周期非特異性抗腫瘤藥物, 細胞毒作用可發(fā)生于各期細胞，但耐藥性和藥物毒性限制了其在臨床的應用[2]。Wee1蛋白激酶是調(diào)控細胞從G2期到M期的關鍵靶點，國內(nèi)外多項研究發(fā)現(xiàn)，PD0166285作為一種Wee1蛋白激酶抑制劑可協(xié)同化療或放療共同發(fā)揮抗腫瘤作用[3，4]。我們希望通過檢測PD0166285聯(lián)合阿霉素對急性白血病細胞的生長抑制影響，以證實兩藥聯(lián)用是否具有協(xié)同作用，從而為進一步的體內(nèi)實驗和臨床應用提供實驗依據(jù)和理論基礎[5]。

1材料和方法

1.1藥物和試劑

Wee1抑制劑PD0166285(由日本高知大學第三內(nèi)科提供)，Doxorubicin(Sigma公司)均溶于100%二甲基亞砜(DMSO)配制成10-2M于-80℃下保存。臨用前用RPMI1640調(diào)至所需濃度。小牛血清(FBS)：Sigma公司產(chǎn)品，56 ℃水浴30min滅活后分裝，4℃保存。RPMI1640：Sigma公司產(chǎn)品，4℃保存。MTT粉劑：Sigma公司產(chǎn)品。

1.2細胞株及其培養(yǎng)

HL60細胞株(AML)、NB4細胞株(APL)、EOL-1細胞株(eosinophilic leukemia cell line)(均由日本高知大學第三內(nèi)科提供)。HL60、NB4、EOL-1細胞株按常規(guī)懸浮細胞培養(yǎng)法接種于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、體積分數(shù)為5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，2～3d換液一次。取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3細胞活力測定(MTT法)

本實驗分單一用藥實驗和聯(lián)合用藥實驗兩部分。單一藥物作用實驗設PD0166285實驗組、阿霉素實驗組和空白對照組, PD0166285的濃度范圍為0.005～1μM/mL、阿霉素的濃度范圍為0.03～10μM/mL。根據(jù)單一用藥對HL-60、NB4、EOL-1作用的實驗結果,選擇抑制率在10%～30%左右的PD0166285、阿霉素濃度作為聯(lián)合用藥的濃度,作用48h后用MTT法測定PD0166285、阿霉素單獨和聯(lián)合應用對HL-60、NB4、EOL-1細胞的增殖抑制作用,計算抑制率并求得半數(shù)抑制濃度(IC50)。

將HL60細胞(2×105/mL)接種于96孔板，每孔體積為100μL，每孔分別加入不同倍比稀釋濃度的藥物，PD0166285的濃度范圍為0.25～1μM，阿霉素的濃度范圍為0.1～1μM；將NB4細胞(2×105/mL)接種于96孔板，每孔體積為100μL，每孔分別加入不同倍比稀釋濃度的藥物，PD0166285的濃度范圍為0.125～0.5μM，阿霉素的濃度范圍為1～10μM；將EOL-1細胞(2×105/mL)接種于96孔板，每孔體積為100μL，每孔分別加入不同倍比稀釋濃度的藥物，PD0166285的濃度范圍為3～30nM，阿霉素的濃度范圍為30～300nM。以上實驗組每個濃度設2個平行孔，同時用RPMI1640替代藥物作為空白對照，將鋪好的96孔板置于含5% CO2的37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育48h，然后每孔加入5mg/mLMTT液10μL再孵育1h，加入20%SDS溶解紫瓚晶體后置于微量光譜測量儀器570nm處測吸光度(A)。實驗至少重復三次取其中三次的平均值。

1.4統(tǒng)計學方法

2結果

單獨用藥實驗結果顯示：PD0166285、阿霉素對HL60、NB4、EOL-1細胞均有不同程度的抑制作用，并呈明顯的濃度—效應關系。PD0166285作用于HL60、EOL-1細胞48h的IC50分別為1μM、0.08μM，作用NB4相對較弱，48h未達到IC50(圖1)；阿霉素作用于HL60、NB4、EOL-1細胞48h的IC50分別為0.65μM、8μM、0.25μM(圖2)。

聯(lián)合用藥實驗結果顯示：PD0166285聯(lián)用阿霉素增強了對細胞株的生長抑制作用。例如，單獨應用PD0166285 (0.25μM，48h)或者阿霉素(1μM，48 h)，對HL60細胞株的抑制率分別為(33±1)% 、(63±0.002)%；當二者聯(lián)合時，抑制率可達(77±0.2)%(P<0.05)(圖3)。同樣的，單獨應用PD0166285(30 nM，48h)或者阿霉素(100nM，48h)，對EOL-1細胞株的抑制率分別為(53±4)% 、(57±4)%；當二者聯(lián)合時，抑制率可達(74±4)%(P<0.05) (圖4)。PD0166285聯(lián)合阿霉素也同樣增強了對NB4細胞株的生長抑制作用，但無顯著差異(P>0.05)(圖5)。

圖1　PD0166285對HL60、NB4、EOL-1細胞增殖抑制(MTT法)

圖2阿霉素(Doxorubicin)對HL60、NB4、EOL-1細胞增殖抑制(MTT法)

圖3PD0166285聯(lián)用阿霉素對HL60細胞株的生長抑制作用(MTT法)(*P<0.05，**P<0.01)

圖4PD0166285聯(lián)用阿霉素對EOL-1細胞株的生長抑制作用(MTT法)(*P<0.05，**P<0.01)

圖5PD0166285聯(lián)用阿霉素對NB4細胞株的生長抑制作用(MTT法)(*P<0.05，**P<0.01)

3討論

參與細胞周期調(diào)控的分子靶向治療已經(jīng)成為目前腫瘤治療研究的焦點。Wee1蛋白激酶作為一種細胞周期的調(diào)節(jié)因子，屬于蛋白激酶中絲氨酸/蘇氨酸家族的一員。Wee家族包括Wee1-A，Wee1-B和MYT1三種蛋白激酶，Wee1-A主要存在于體細胞中，Wee1-B主要存在于胚胎細胞中，而MYT1在體細胞和胚胎細胞中均存在。Wee1激酶最初的研究源于酵母，是一種細胞分裂周期的突變體，在酵母中呈低表達。人類Wee1激酶是調(diào)控細胞周期從G2期到M期的關鍵靶點。在細胞周期進入有絲分裂之前，Wee1激酶促使其完成DNA損傷修復和DNA復制。Wee1在細胞周期的S期和G2期十分活躍，可通過使Cdc2的Tyr-15位點磷酸化繼而降低Cdc2激酶的生物活性，最后可特異地調(diào)控細胞周期和有絲分裂。Wee1基因缺失或表達受抑后，致使相關的細胞周期激酶被激活，使細胞DNA損傷無法得到修復而直接進入下一細胞周期，可進一步導致DNA損傷細胞出現(xiàn)有絲分裂災難，甚至出現(xiàn)細胞凋亡或死亡等[6]。伴有p53失活的腫瘤經(jīng)常出現(xiàn)細胞周期G1檢查點缺失，使細胞DNA復制及損傷修復過程中更加依賴于細胞周期G2/M期檢查點的修復功能，因而作為細胞周期G2/M期檢查點的關鍵因子，Wee1蛋白激酶成為了潛在的具有抗腫瘤作用的靶點。國內(nèi)外報道顯示wee1抑制劑已經(jīng)在肺癌、結腸癌、骨肉瘤等多種腫瘤試驗中被證明可以加強放化療的作用。WANG等[7]通過實驗發(fā)現(xiàn)Wee1被siRNA沉默后的HeLa細胞更容易被阿霉素殺死，但正常的宮頸上皮細胞卻無明顯損傷。Hashimoto等[8]通過研究發(fā)現(xiàn)WEE1抑制劑PD0166285可使B16黑色素瘤細胞從G2期阻滯變?yōu)镚1期阻滯并抑制細胞增殖，促使細胞死亡。SCHELLENS等[9]通過研究證明Wee1小分子抑制劑MK-1775既可以作為單獨藥物應用，也可以與卡鉑、順鉑、吉西他濱等化療藥物聯(lián)用，均對多種實體腫瘤有明顯抑制作用。WANG等[4,10]進行了一系列的實驗發(fā)現(xiàn)Wee1抑制劑PD0166285可以協(xié)同化療或放療增強對肺癌、結腸癌和黑色素瘤患者腫瘤細胞的殺傷，從而使腫瘤細胞產(chǎn)生有絲分裂災難，甚至誘導腫瘤細胞凋亡。阿霉素作為蒽環(huán)類抗腫瘤藥物的一種代表，是多種腫瘤尤其急性白血病的化療方案的重要組成藥物，使用廣泛，能夠嵌合于DNA堿基對之間并緊密地結合到DNA上，這種嵌合可破壞DNA三級結構，從而抑制DNA以及DNA依賴性RNA的合成。阿霉素作為一種細胞周期非特異性抗腫瘤藥物, 對各期細胞均有細胞毒作用，但以S期細胞對其最敏感。然而，DNA損傷后會通過激活相關細胞周期檢查點而使細胞周期停滯，為細胞進行DNA修復提供時間并促使細胞經(jīng)過修復而存活。因此，細胞周期檢查點的激活可能是導致阿霉素等蒽環(huán)類藥物治療急性白血病失敗的原因之一。

為此，本實驗應用Wee1抑制劑PD0166285聯(lián)合阿霉素，觀察作用環(huán)節(jié)及作用機理各不相同的藥物聯(lián)合應用對急性白血病細胞的增值抑制作用。實驗結果顯示，PD0166285和阿霉素聯(lián)用后對HL60、EOL-1細胞株的抑制率顯著增加，明顯高于單一用藥，且有顯著差異(P<0.05)。綜上所述，PD0166285聯(lián)用阿霉素不僅能提高抗白血病作用，而且可望降低阿霉素的用量而減少相關副作用，聯(lián)合運用PD0166285與阿霉素可望成為治療白血病新的有效方案。PD0166285和阿霉素聯(lián)用對HL60、EOL-1細胞株的抑制有協(xié)同作用。PD0166285聯(lián)用阿霉素不僅能提高抗白血病作用，而且可望降低阿霉素的用量而減少相關副作用，聯(lián)合運用PD0166285與阿霉素可望成為治療白血病新的有效方案。

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作者簡介：①倪蕾(1983～)女，黑龍江佳木斯人，主治醫(yī)師。 通訊作者:于廣晴(1956～)男，河北博野人,主任醫(yī)師，碩士研究生導師。E-mail:YuGuangqing1956@163.com。

中圖分類號：R557

文獻標識碼：B

文章編號：1008-0104(2016)04-0055-03

(收稿日期：2015-12-01)

Wee1 inhibitor PD0166285 and Doxorubicin induce growth arrest of AML cell lines by MTT assay

NILei1,ZHANGXi-kai1,HOUZhi-ling1,YANGYu2,LIANGYan-feng2,YUGuang-qing1

(1.The First Hospital Affiliated to Jiamusi University, Jiamusi 154003,China; 2. Basic Medical College, Jiamusi University, Jiamusi 154007,China)

Abstract:Objective: To investigate the effects of Wee1 inhibitor PD0166285 and Doxorubicin induce growth arrest of AML cell lines by MTT assay．Methods: Taking human AML cell line HL60, NB4, EOL-1 as the research objects, we investigated the inhibition of PD0166285 and Doxorubicin on cell growth by MTT Assay. Results: The results of solo-medication group showed that PD0166285 and Doxorubicin inhibited the growth of HL60、NB4、EOL-1 cells in a dose-dependent manner. The results of combined-medication group showed that PD0166285 and Doxorubicin which used in combination inhibited the growth of HL60、EOL-1 cells. The inhibition was more obvious in the combination group than in the solo-medication group(P<0.05). The inhibition of the growth of NB4 cells was not obvious in the combination group than in the solo-medication group(P>0.05). Conclusions: The inhibition of the growth of HL60, EOL-1 cells was more obvious in the combination group of PD0166285 and Doxorubicin than in the solo-medication group.

Key words:Wee1 Inhibitor; Doxorubicin; leukemia; proliferation inhibition; MTT