LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌浸潤過程中的表達及與血管生成的關(guān)系①

侯艷妮，李義強，周　昱，王　博，胡少軍

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

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LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌浸潤過程中的表達及與血管生成的關(guān)系①

侯艷妮，李義強，周昱，王博，胡少軍

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：通過對LGR5、Nodal蛋白在乳腺正常組織、乳腺原位癌、浸潤癌中表達水平的研究，探討LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，并且通過研究LGR5、Nodal蛋白與血管生成相關(guān)因子CD34在乳腺浸潤癌中的關(guān)系，進一步探討兩因子在乳腺癌血管生成事件中的作用。方法：應用免疫組化法檢測LGR5、Nodal蛋白在30例正常乳腺組織、24例乳腺原位癌、66例浸潤癌中的表達水平，并且檢測在66例乳腺浸潤癌中LGR5、Nodal蛋白與CD34的表達水平，分析LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌發(fā)展過程中的作用以及與乳腺癌血管生成之間的關(guān)系。結(jié)果：LGR5、Nodal在乳腺癌中呈高表達，明顯高于原位癌、正常乳腺組織組(P<0.01)。LGR5、Nodal的表達水平均與患者年齡無顯著相關(guān)性(P>0.05)；與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)(P<0.01)；LGR5、Nodal分別與CD34、MVD之間存在相關(guān)性(P<0.01)，且陽性發(fā)生率一致，說明LGR5、Nodal蛋白均與乳腺癌血管生成呈正相關(guān)。結(jié)論：LGR5、Nodal在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，且可能促進了乳腺癌血管的生成。另外，在乳腺癌中LGR5、Nodal之間存在正相關(guān)系。

關(guān)鍵詞：乳腺癌；LGR5；Nodal；CD34；血管生成

眾所周知，乳腺癌是影響女性身心健康甚則 危及生命的最常見的癌癥。因此，研究乳腺癌的各種致病因素、發(fā)病機制以及可能的治療靶點已經(jīng)成為當代學者迫不及待需要解決的問題。LGR5是最新發(fā)現(xiàn)的一種7 次跨膜 G蛋白偶聯(lián)受體，在人體的多種組織中如脊髓、大腦、眼睛、胃腸道及生殖器官等多處都有表達，是多種組織成體干細胞的標志物。研究證明，LGR5可作為腸等部位的干細胞標志物，且其表達的產(chǎn)物在胚胎和器官的發(fā)育以及多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中均發(fā)揮著重要作用。并且，LGR5在卵巢癌、結(jié)腸癌、基底細胞癌以及肝癌中表達均升高[1]。Nodal蛋白是胚胎形成素的一種，是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員，既可以調(diào)控胚胎干細胞的生長和分化，還可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞的可塑性及惡性腫瘤細胞的侵襲，維持胚胎干細胞及惡性腫瘤細胞的分化多潛能性[2]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)許多惡性腫瘤如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、惡性黑素瘤、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌都可檢測到Nodal蛋白的表達，并發(fā)現(xiàn)這些腫瘤的發(fā)生，發(fā)展轉(zhuǎn)移及預后中離不開Nodal蛋白的影響[3]，表明Nodal蛋白可能是腫瘤進展中，腫瘤從可控階段發(fā)展到更具侵襲性及轉(zhuǎn)移性階段一個重要的標志物。但是，國內(nèi)外尚沒有關(guān)于LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌中的研究報道，因此，我們通過研究LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌發(fā)展過程中的表達情況，并且通過分析LGR5、Nodal蛋白與血管生成指標CD34之間的相關(guān)性，初步探討LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的可能性作用，為臨床研究提供更多的試驗證據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1資料和方法

1.1一般資料

收集2014-05～2015-05佳木斯大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科乳腺疾病手術(shù)切除標本，其中乳腺正常組織30例、原位癌24例、浸潤癌66例。入選標準：1)所有患者均為女性；2)所有患者術(shù)前均未經(jīng)過放化療、生物治療及中西醫(yī)結(jié)合治療；3)所有標本均經(jīng)佳木斯大學附屬第一醫(yī)院病理科資深病理醫(yī)生進行讀片確定診斷。

1.2 試驗

1.2.1試驗方法

采用免疫組化法：三組組織標本均經(jīng)福爾馬林固定，石蠟包埋存檔，標本做3μm厚度連續(xù)切片及HE染色。采用SP法檢測LGR5、Nodal、CD34在不同標本中的表達。實驗方法嚴格按照實際說明書進行操作。

1.2.2結(jié)果判定

陽性結(jié)果判斷：細胞質(zhì)、細胞核呈黃色者判為陽性。先在低倍鏡下對組織切片全面觀察，隨后在200倍的光鏡下隨機觀察5個視野。通過將細胞的陽性的強度評分和陽性細胞的百分比評分相加來綜合判斷染色結(jié)果。

微血管密度(MVD)計數(shù)：先在40倍顯微鏡下觀察病理，選擇出癌灶內(nèi)微血管密度最密集的三個區(qū)域，然后再在200倍鏡下計數(shù)每個區(qū)域中的MVD，取三個區(qū)域的平均值作為該張腫瘤切片的微血管密度。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，等級資料進行秩和檢驗，一般性分類資料采用Pearson卡方檢驗進行分析，以P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。兩變量間相關(guān)性采用 Spearman 相關(guān)分析，檢驗水準α=0.05。

2結(jié)果

2.1LGR5、Nodal蛋白、CD34在乳腺正常組織、乳腺原位癌、浸潤癌中的表達

LGR5陽性染色表現(xiàn)為均勻細小黃色顆粒，主要分布于細胞質(zhì)，其在乳腺正常組織、原位癌、浸潤癌中陽性率分別為：13.33%(4/30)、54.17% (13/24)、89.39% (59/66)。Nodal蛋白的陽性反應同樣主要表現(xiàn)在乳腺病變組織的細胞質(zhì)中，其在乳腺正常組織、乳腺原位癌、浸潤癌中的陽性表達率為6.67%(2/30)、58.33%(14/24)、80.30%(53/66)。兩組因子在乳腺癌中表達明顯高于乳腺正常組織組及原位癌組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 見表1。

2.2LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌中的表達及與臨床病理的關(guān)系

我們進一步分析了LGR5、Nodal與血管生成相關(guān)蛋白CD34表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系，LGR5、Nodal、CD34表達水平與腫瘤大小、組織分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有顯著相關(guān)(P<0.05)；與年齡無顯著相關(guān)(P值分別為：0.267、0.629、0.916)。見表2。

表1　LGR5、Nodal蛋白、CD34在乳腺正常組織、乳腺原位癌、浸潤癌中的表達

表2　LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌中的表達及與臨床病理的關(guān)系

注明：1.#表示采用秩和卡方檢驗進行計算；2.*表示采用Fisher 精確概率卡方檢驗進行計算。

2.3LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌組織中表達與MVD之間的關(guān)系

乳腺癌組織標本LGR5、Nodal蛋白和 CD34免疫組化染色情況提示：LGR5、Nodal蛋白陽性表達均多位于腫瘤細胞質(zhì)；微血管密度采取癌組織CD34免疫組化染色方式檢測，染色也主要位于細胞質(zhì)。 同時，對乳腺癌組織中LGR5、Nodal蛋白、MVD表達相關(guān)性進行了分析，結(jié)果提示，LGR5陽性表達與CD34陽性表達間存在顯著相關(guān)(P<0.01)；Nodal蛋白陽性表達與CD34陽性表達之間也存在顯著相關(guān)(P<0.01)，且LGR5與Nodal之間亦有顯著相關(guān)(P<0.01)。見表3～5。

表3　Lgr5、CD34and MVD 在乳腺癌組織中

表4　Nodal、CD34 and MVD 在乳腺癌組織中

表5　Lgr5、Nodal在乳腺癌組織中表達相關(guān)性分析

3討論

乳腺癌是一種內(nèi)分泌依賴性腫瘤,除ER、PR外,包括LGR5、Nodal在內(nèi)的多種因子均可能參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。因此,闡明LGR5、Nodal等在乳腺癌發(fā)生中的作用及相關(guān)機制對于乳腺癌的內(nèi)分泌治療研究非常必要。近年來,大量實驗研究表明LGR5、Nodal均可以參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，促進腫瘤血管生成，但其各自在乳腺癌中的表達尚沒有見文獻報道。

我們首先分別檢測了LGR5、Nodal在乳腺正常組織、乳腺原位癌、乳腺癌及浸潤癌組織中的表達。相比于在正常組織及乳腺原位癌，LGR5、Nodal在浸潤癌組織中呈現(xiàn)明顯的高表達。這同我們預計結(jié)果相同。我們進一步分析發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中,LGR5、Nodal的高表達與乳腺癌的腫瘤大小、分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成正相關(guān)。腫瘤的生長需要新的微血管生成,而新的血管生成提供了腫瘤的血液營養(yǎng)供應,也增加了惡性腫瘤轉(zhuǎn)移機率,故微血管密度在許多原發(fā)腫瘤中已被作為判斷生物學侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能的指標。而生成血管的血管內(nèi)皮細胞染色可以清楚地顯示腫瘤的血管密度, 反映腫瘤的生物學特性。CD34作為一種血管內(nèi)皮染色劑，靈敏度高，干擾小，清晰度好[4]，所以我們又在浸潤癌中檢測了血管生成相關(guān)因子CD34的表達情況，并且在高倍顯微鏡下計數(shù)微血管密度，分別統(tǒng)計分析LGR5、Nodal與CD34、MVD之間的相關(guān)性，結(jié)果示：LGR5、Nodal與CD34、MVD之間均呈正相關(guān)，并且LGR5、Nodal之間也為正相關(guān)，這就說明了LGR5、Nodal可能促進了乳腺癌的血管生成。總結(jié)來說,LGR5、Nodal在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，可能通過促進乳腺癌細胞增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移等多種機制促進乳腺癌的發(fā)生進展。但由于實驗樣本過少，而且國內(nèi)外尚沒有此方面的文獻報道，所以LGR5、Nodal在乳腺癌中的具體作用有待進一步的研究證明。

目前，學者們還未發(fā)現(xiàn)乳腺干細胞確切的標志物[5]，部分學者發(fā)現(xiàn)，乳腺干細胞定位于末端導管小葉單位；而另有研究人員研究則顯示乳腺干細胞位于基底上皮層。LGR5、Nodal能否作為乳腺干細胞標志物還需進一步研究來證實。也有人稱LGR5是橫跨胚層的干細胞標志物，或許能代表成體干細胞的普遍標志物，但這個結(jié)論尚有待更多研究證實。而β超家族成員Nodal蛋白僅表達于人類胚胎干細胞、胚胎組織以及腫瘤細胞中，目前已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細胞的細胞株中存在Nodal的表達，如睪丸癌的移植瘤、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、胃腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌、膀胱腫瘤等。研究發(fā)現(xiàn)Nodal蛋白可促進內(nèi)皮細胞形成管狀血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)即血管生成擬態(tài)的形成，并且可以誘導VEGF的分泌，從而促進腫瘤血管生成，進而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在今后的研究中，我們希望進一步探討LGR5、Nodal通過何種機制促進惡性乳腺癌發(fā)生發(fā)展以及血管生成，明確兩因子在促進乳腺癌生成中是否為必要條件，從而為乳腺癌的臨床工作提供更有力的證據(jù)。

參考文獻：

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[3]Bar-Eli M.Back to the embryonic stage:Nodal as a biomarker for breast cancer progression [J].Bar-Eli.Breast Cancer Research,2012,14:105

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[5]王新，范立君.GRP78、GRP94在乳腺癌中的表達及其意義[A].黑龍江醫(yī)藥科學，2014，37(6):89-91

基金項目：①佳木斯大學研究生科技創(chuàng)新項目，編號：LM2015_032

作者簡介：侯艷妮(1987～)女，陜西寶雞人，在讀碩士研究生。 通訊作者：李義強(1961～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導師。E-mail：471742477@qq.com。

中圖分類號：R737.9

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)04-0031-03

(收稿日期：2015-09-24)