左乙拉西坦對癲癇大鼠海馬組織中Syt1和PSD95表達(dá)的影響①

王　禹，王海燕，王　婧，趙冬梅，趙塔娜，聶　磊，馮宏達(dá)

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)二科，黑龍江 佳木斯 154003)

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左乙拉西坦對癲癇大鼠海馬組織中Syt1和PSD95表達(dá)的影響①

王禹，王海燕，王婧，趙冬梅，趙塔娜，聶磊，馮宏達(dá)

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)二科，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：探討抗癲癇藥物左乙拉西坦對癲癇大鼠海馬組織中的突觸囊泡膜蛋白Ⅰ(synaptotagminⅠ,Syt1)和突觸后致密物(PSD95)表達(dá)的影響。方法: 隨機(jī)將清結(jié)級Wistar雄性4周齡幼鼠84只,分為A、B、C組。A組：生理鹽水對照組 ，B組：模型組(Li-pilo組)，C組：治療組(LEV治療組) ，其中A組24只，B、C兩組組每組各30只。分組后分別給予造模，造模成功后，給予C組以LEV150mg/kg灌胃給藥每日一次，連續(xù)4周。采用免疫組化方法分別在1周、2周和4周動態(tài)檢測3組大鼠海馬組織中Syt1和PSD95的表達(dá)。結(jié)果：B、C 兩組均出現(xiàn)癲癇樣發(fā)作。左乙拉西坦對照組組與生理鹽水對照組相比，Syt1和PSD95 各表達(dá)量的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；B組的Syt1 的表達(dá)量明顯升高，PSD95的表達(dá)明顯減少，與A組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組與B組相比，Syt1的表達(dá)量明顯降低而PSD95的表達(dá)有所增加，各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:癲癇反復(fù)發(fā)作后可能誘導(dǎo) Syt1表達(dá)增強(qiáng)，Syt1可能通過增加興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放進(jìn)一步促進(jìn)癲癇發(fā)生。癲癇大鼠海馬組織中PSD95的表達(dá)水平明顯下降，左乙拉西坦能增強(qiáng)癲癇大鼠海馬組織中PSD95的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：左乙拉西坦；癲癇 ； 突觸囊泡膜蛋白Ⅰ；突出后致密物；大鼠海馬

神經(jīng)元間信號傳遞主要是通過突觸間的相互傳遞。突觸間的傳遞異?？稍斐赡X細(xì)胞群出現(xiàn)異常的放電，即可引起癲癇發(fā)作，可產(chǎn)生突然的、短暫的腦功能障礙。由于兒童與成人不同，腦組織等尚未發(fā)育健全，故較成人更易發(fā)生癲癇。而反復(fù)發(fā)作的癲癇更可影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育[1]。Syt1又叫突觸結(jié)合蛋白-1，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)突觸囊泡特有的膜的內(nèi)在蛋白質(zhì), 其位置位于突觸前膜。是最主要的Ca2+感受器之一，在調(diào)節(jié)突觸傳遞方面起到重要作用。有實(shí)驗(yàn)表明[2]，在癲癇大鼠海馬組織中Syt-1可以通過調(diào)節(jié)谷氨酸(Glu)等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放進(jìn)一步影響神經(jīng)突觸可塑性,從而引發(fā)癲癇發(fā)生。PSD95是一種位于突觸后膜的蛋白-蛋白復(fù)合體，它能整合信號分子、調(diào)節(jié)分子和靶分子在突觸后膜[3]，促進(jìn)突觸可塑性,而突觸可塑性和結(jié)構(gòu)的改變是異常放電反復(fù)發(fā)生的的基本原因[4]。左乙拉西坦(levetiracetam, LEV)是一種新型廣譜抗癲癇藥物，已有研究表明其與突觸囊泡有關(guān)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物分組

選用84只清潔級的Wistar大鼠(佳木斯大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)室提供)，體重均在(90±10)g，隨機(jī)分為3組，用記號筆標(biāo)注。A組：生理鹽水對照組 ，B組：模型組(Li-pilo組)，C組：治療組(LEV治療組) ，其中A組24只，B、C兩組組每組各30只。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑

主要試劑有: 氯化鋰 (上海寶泰生物科技公司)、匹羅卡品(德國Sig公司)、左乙拉西坦片(UCB Pharma 比利時(shí))、兔抗大鼠Syt1抗體(上海寶泰生物科技有限公司)、兔抗大鼠PSD95抗體(上海寶泰生物科技有限公司)。

1.3動物模型的制備

參照相關(guān)文獻(xiàn)[5]建立動物模型，給予B、C兩組按氯化鋰腹腔注射按100mg/kg計(jì)算，再于20h后，給予東莨菪堿腹腔注射按l.0mg/kg計(jì)算，再于30min后給予腹腔注射匹羅卡品按80mg/kg計(jì)算，同時(shí)觀察大鼠癲癇發(fā)作情況。參照癲癇發(fā)作RACINE等級分級。0級:大鼠表現(xiàn)無反應(yīng)或抽搐停止;1級:大鼠的嘴和面部出現(xiàn)節(jié)律性抽動;2級:大鼠可出現(xiàn)點(diǎn)頭或甩尾;3級:大鼠單側(cè)肢體抽動;4級:大鼠多肢抽動或強(qiáng)直;5級:全面性強(qiáng)直陣攣發(fā)作甚至不自主跌倒。選擇出現(xiàn)4級或以上發(fā)作的大鼠，且發(fā)作持續(xù)30min后再給予地西泮10mg/kg腹腔注射終止發(fā)作。選擇各組符合條件的鼠每組各24只，C組在成功造模24h后給予左乙拉西坦200mg/kg灌胃，其他兩組則給予相同劑量的生理鹽水灌胃，均為每日一次，連續(xù)4周，動態(tài)觀察，并分別于第1周、2周、4周提取海馬組織于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.4應(yīng)用免疫組化方法檢測大鼠海馬組織中Syt1和PSD-95的表達(dá)水平

先將甲醛溶液中的海馬組織取出并置20%蔗糖溶液(4℃)中24h。將海馬組織取出并通過石蠟包埋切片進(jìn)行免疫組化染色。

按照說明進(jìn)行免疫組化染色，按照脫蠟水化—抗原修復(fù)—血清封閉—滴加一抗—滴加二抗—復(fù)染—脫水后充分晾干后中性樹膠封片的步驟逐一操作。 在顯微鏡鏡下(X400)觀察每張切片免疫組化

染色后海馬陽性細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1觀察動物的行為學(xué)表現(xiàn)

在腹腔注射匹羅卡品約10min后B組和C組大鼠均出現(xiàn)0～5級等不同程度的癲癇發(fā)作，甚至全面性強(qiáng)直陣攣發(fā)作。給予止抽后再給予LEV200mg/kg每日一次灌胃，發(fā)現(xiàn)C組與B組大鼠比較，癲癇發(fā)作的程度及次數(shù)均明顯減少。

2.2Syt1免疫組化結(jié)果

免疫反應(yīng)產(chǎn)物主要分布在海馬區(qū)，呈棕黃色圓形或橢圓形。與A組比較，B組大鼠海馬中的Syt1免疫反應(yīng)的陽性細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)，PSD-95免疫反應(yīng)的陽性細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與B組比較，各時(shí)間點(diǎn)C組海馬組織中Syt1表達(dá)減少(P<0.05)而PSD-95表達(dá)減少(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1～2。

表1　各組大鼠海馬組織中Syt1陽性細(xì)胞數(shù)比較±s，n=8)

注：ΔLEV組與NS組比較：P>0.05；*Li-PILO與NS組比較：P<0.05；※LEV治療組與Li-PILO組比較：P<0.05。

表2　各組大鼠海馬組織中PSD-95陽性細(xì)胞數(shù)比較±s，n=8)

注：ΔLEV對照組與NS組比較：P>0.05；*Li-PILO與NS組比較：P<0.05；※LEV治療組與Li-PILO組比較：P<0.05。

3討論

癲癇是由于突觸間的傳遞異?？稍斐赡X細(xì)胞群出現(xiàn)異常的放電[6]。兒童處于生長發(fā)育期，神經(jīng)系統(tǒng)尚未發(fā)育健全，長期反復(fù)的癲癇發(fā)作可嚴(yán)重影響其日后生長發(fā)育及生活質(zhì)量。癲癇可造成神經(jīng)元損傷，進(jìn)而導(dǎo)致腦組織損傷甚至是永久性的損害。區(qū)別于傳統(tǒng)抗癲癇藥物，新一代左乙拉西坦(LEV)，是通過多種機(jī)制發(fā)揮作用。研究表明[7]，在匹羅卡品誘發(fā)的癲癇大鼠中，LEV能明顯減少海馬神經(jīng)細(xì)胞的死亡，具有神經(jīng)保護(hù)作用，對神經(jīng)元突觸重建有著重要的影響。通過本次實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，模型組中大鼠海馬組織中Syt1的細(xì)胞數(shù)表達(dá)明顯高于鹽水對照組，而經(jīng)LEV治療組中海馬組織中Syt1的表達(dá)水平與模型組比較明顯降低。由此可推測，LEV可以通過控制癲癇發(fā)作，減少突出囊泡的循環(huán)，減輕突觸損害的程度，進(jìn)而抑制癲癇大鼠海馬組織中Syt1的表達(dá)和減輕PSD-95的降低程度，在影響突觸囊泡、Ca2+和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)等在異常突觸間的轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮其抗癲癇作用。

參考文獻(xiàn):

[1]王海燕，王影，聶磊，等.左乙拉西坦對癲癇大鼠認(rèn)知功能及海馬組織中NPY和NCAM-mRNA表達(dá)的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2013,36(3):6-8

[2]Burkhardt C, Muller M, Badde A, et al. Semaphorin 4B interacts with thepost-synaptic density protein PSD-95/SAP90 and is recruited to synapses through C-terminal PDZ-binding motif[J]. FEBS-Lett, 2005, 579(17): 3821-3828

[3]王海燕，胡云秋，劉杰薇.左乙拉西坦對海人酸致癇大鼠血清NSE和MBP變化的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2012,35(4):2-3

[4]Lynch BA, Lambeng N, Nocka K,et al.The synaptic vesicle protein SV2A is thebinding site for the antiepileptic drug levetiracetam[J]. Proc NatlAcad SciU SA, 2004, 101 (26): 9861-9866

[5]Aarts MM , Tymianski M. Molecular Mechanisms Underlying Specificity ofExcitotoxic Signaling in Neurons[J]. Curr-Mol-Med, 2004, 4(2):137-147

[6]Angela FL, JoseLuisSC, MariCI, et al.Caloric restiction increases learning consolidation and facilitates synaptic plasticity through mechanisms dependent on NR2B subunits of the NMDA receptor[J]. JNeurosci，2007,27(38):10185-10195

[7]Yan XB, Song B, Zhang GY. Postsynaptic density protein 95 mediatesCa2+/calmodulin-dependent protein kinase II-activated serine phosphorylation ofneuronal nitric oxide synthase during brain ischemia in rat hippocampus[J].Neurosci Lett,2004,355(3):197-200

基金項(xiàng)目：①黑龍江省衛(wèi)生計(jì)生委科研課題，編號：2014-225。

作者簡介：王禹(1968～)男,黑龍江佳木斯人,學(xué)士，副主任醫(yī)師。

中圖分類號:R742.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號：1008-0104(2016)04-0014-02

(收稿日期：2016-01-21)