敲除iclR基因?qū)Υ竽c桿菌發(fā)酵L-色氨酸的影響

陳勝杰，劉 輝，謝希賢，徐慶陽，陳 寧（代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

敲除iclR基因?qū)Υ竽c桿菌發(fā)酵L-色氨酸的影響

陳勝杰，劉 輝，謝希賢，徐慶陽，陳 寧
（代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

為了研究敲除iclR基因?qū)Υ竽c桿菌（Escherichia coli）發(fā)酵L-色氨酸的影響，以L-色氨酸工程菌大腸桿菌TRTH為出發(fā)菌株，利用Red重組技術(shù)構(gòu)建了iclR基因（編碼乙醛酸操縱子阻遏蛋白）缺失菌株TRTHΔiclR.搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：TRTH?iclR的L-色氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到（6.52±0.46）g/L和13.17%，比原菌的分別提高了21.86%，和22.85%，；乙酸累積量為6.82，g/L，比原菌的降低了37.63%. 30，L發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：TRTH?iclR的L-色氨酸產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到（13.01±1.05）g/L和6.51%，比原菌的下降了60.34%，和68.27%，；乙酸累積量為18.21，g/L，比原菌的增加了33.42%. 結(jié)果表明：在搖瓶條件下，重組菌株生物量較出發(fā)菌株高，代謝流分配適合L-色氨酸積累；但在發(fā)酵罐條件下，乙醛酸循環(huán)的增強(qiáng)導(dǎo)致重組菌株供能不足和乙酸的過多積累，最終使得生物量不足以及L-色氨酸產(chǎn)量下降.

L-色氨酸；大腸桿菌；乙醛酸循環(huán)；iclR；發(fā)酵

L-色氨酸（L-tryptophan，L-trp）是人和動(dòng)物的必需氨基酸之一［1-2］.目前，發(fā)酵法工業(yè)生產(chǎn)L-色氨酸存在的主要問題是L-色氨酸轉(zhuǎn)化率偏低（低于23%，），其主要原因是較多的碳源在TCA循環(huán)中消耗.以往的菌株改造主要集中在修飾與合成L-色氨酸直接相關(guān)的途徑（如莽草酸途徑）或過表達(dá)關(guān)鍵基因（如tktA、ppsA、aroG等［3］），但鮮有改變TCA循環(huán)等中心代謝途徑和L-色氨酸積累的研究報(bào)道.Rezaei等［4］在酵母菌株S288C中同時(shí)敲除TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶基因aco1（編碼順烏頭酸酶）和基因icl1（編碼異檸檬酸裂合酶），重組菌的產(chǎn)琥珀酸的能力明顯下降.借鑒此思路，若對(duì)TCA循環(huán)的支路代謝（乙醛酸循環(huán)）作適當(dāng)修飾，可能會(huì)增加草酰乙酸的合成，通過丙酮酸更多地轉(zhuǎn)化成合成L-色氨酸的重要前體物——磷酸烯醇式丙酮酸；另外也可能會(huì)降低TCA中間代謝物的生成，減少因生成能量而消耗的碳源.作為乙醛酸循環(huán)的抑制子IclR，能和編碼乙醛酸循環(huán)關(guān)鍵酶（異檸檬酸裂合酶、蘋果酸合成酶和異檸檬酸脫氫酶/磷酸化酶）的aceBAK操縱子結(jié)合［5-6］，關(guān)閉乙醛酸循環(huán).抑制子IclR的缺失會(huì)導(dǎo)致乙醛酸循環(huán)關(guān)鍵酶的組成型表達(dá)，強(qiáng)化乙醛酸循環(huán)，有利于減少TCA循環(huán)的CO2損失，可能是一種更經(jīng)濟(jì)的代謝方式［7］.Lee等［8］發(fā)現(xiàn)大腸桿菌（E.coli）iclR敲除菌株的蘇氨酸產(chǎn)量顯著提高.本文基于此，改變乙醛酸循環(huán)代謝流分布，構(gòu)建iclR缺失的工程菌TRTH ΔiclR，研究了iclR缺失對(duì)L-色氨酸積累的影響.

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

所用菌株和質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室保存，見表1.

表1 菌株和質(zhì)粒Tab. 1 Bacterial strains and plasmids

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：用于大腸桿菌的培養(yǎng).根據(jù)需要添加抗生素，氨芐青霉素100，μg/mL，氯霉素25，μg/mL.

用于大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)的種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖40，酵母粉1，檸檬酸鈉1.6，硫酸銨1.2，磷酸氫二鉀5.6，硫酸鎂1.6，維生素B10.001，3，硫酸亞鐵0.002，8，硫酸錳0.001，2，生物素0.000，3，微量元素混合液0.004.

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖7.5，硫酸銨1.6，酵母粉1，檸檬酸鈉2，磷酸氫二鉀7.5，硫酸鎂2，微量元素混合液0.001.

1.3 試劑

引物合成由金唯智生物科技公司完成.PCR所用試劑以及限制酶、T4，DNA連接酶均購(gòu)于TaKaRa公司.其他化學(xué)試劑均為分析純.

1.4 產(chǎn)L-色氨酸大腸桿菌TRTH?iclR的構(gòu)建

質(zhì)粒和基因組提取、DNA片段回收、大腸桿菌的電轉(zhuǎn)化等常規(guī)技術(shù)的操作參照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行.根據(jù)大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄抑制子基因iclR 的序列設(shè)計(jì)引物.分別擴(kuò)增iclR上游同源臂、下游同源臂和Cmr抗性基因盒，對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增上、下游引物分別為iclR-1∶5'-TTGCGTAACCTTTTCCCTGG-3'，iclR-2∶5'-CTCC AGCCTACAAATCGCTCAAGCTAACATCTCTTCA GATTCGGTT-3'，iclR-3∶5'-GCTAATTCCCATGTC AGCCGTTATACCGAGCGGCACTACTAACAC-3'，iclR-4∶5'-CAGCAGAGTAGAACCCAGGATTAC-3'，pKD 3-up：5'-TTGAGCGATTGTGTAGGCTGGAG-3'，pKD 3-down：5'-TAACGGCTGACATGGGAATT AGC-3'（其中標(biāo)注下劃線的引物為用于同源重組的具有同源堿基的引物）.再采用重疊PCR，以iclR-1和iclR-4擴(kuò)增連接3個(gè)片段，得到片段?iclR.其中PCR條件為：95，℃預(yù)變性5，min；94，℃變性30，s，55，℃退火30，s，72，℃延伸，時(shí)間依各片段大小設(shè)定，1，kbp對(duì)應(yīng)1，min，循環(huán)25次.22，℃保溫，PCR體系為EXTaq（10，U/mL）0.25，μL，dNTP mixture（10，mmol/L）4，μL，PCR buffer（10×）5，μL，上、下游引物 1，μL，模板10～100，ng，ddH2O補(bǔ)齊至50，μL.將片段?iclR電轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，擊穿電壓為1，800，V，時(shí)間為5.8，s.利用Red同源重組技術(shù)［9］，用Cmr抗性基因盒替換iclR基因.基因替換成功的陽性克隆子通過轉(zhuǎn)化入pCP20質(zhì)粒，消除染色體上Cmr抗性基因.

1.5 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

搖瓶發(fā)酵：將保存菌株接種到四環(huán)素抗性斜面活化，37，℃培養(yǎng)12，h，活化兩代后接種于含30，mL的種子培養(yǎng)基的500，mL擋板搖瓶中，培養(yǎng)至A600為4～6時(shí)，以10%，接種量接種于含30，mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500，mL擋板搖瓶中.用2%，的苯酚紅溶液作為pH指示劑，并用氨水調(diào)節(jié)并維持pH在6.7～7.0.發(fā)酵周期為32，h，期間補(bǔ)加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%，的葡萄糖溶液.

30，L發(fā)酵罐發(fā)酵：用接種環(huán)刮取斜面菌苔接種至含3，L種子培養(yǎng)基的5，L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)至A600為14～16時(shí)，以13%，接種量接種于含16，L發(fā)酵培養(yǎng)基的30，L發(fā)酵罐中.發(fā)酵周期為36，h，通過溶氧反饋控制葡萄糖質(zhì)量濃度小于1，g/L，流加氨水調(diào)節(jié)并維持pH在6.7～7.0，溶氧控制在30%～40%，流加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%，的葡萄糖溶液進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵.

1.6 檢測(cè)方法

菌體生物量檢測(cè)：菌體生物量以菌體干質(zhì)量表示.取10，mL發(fā)酵液，13，000，r/min離心20，min，棄上清液，菌體用去離子水洗滌3次后置于55，℃恒溫干燥箱中干燥至質(zhì)量恒定.將發(fā)酵液稀釋不同倍數(shù)，使其在600，nm波長(zhǎng)下的吸光度為0.2～0.8，繪制吸光度（x）與干質(zhì)量（y）曲線并測(cè)定菌體生物量，y＝0.39x+0.01，R2＝0.991.

發(fā)酵液中葡萄糖濃度和谷氨酸濃度均采用SBA-40C型生物傳感儀（山東科學(xué)院生物研究所）測(cè)定.

采用高效液相色譜儀測(cè)定L-色氨酸含量.色譜條件：色譜柱為Agilent C18（4.6，mm×150，mm，5，μm），采用純乙腈和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%，的磷酸二氫鉀緩沖液（乙腈與磷酸二氫鉀體積比為1﹕9）恒梯度洗脫，柱溫39，℃，流量1，mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 278，nm.

胞內(nèi)ATP濃度采用ATP快速檢測(cè)試劑盒（Promega公司）測(cè)定.

采用高效液相色譜儀檢測(cè)發(fā)酵液中乙酸的含量.色譜條件：色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87H（300，mm×7.8，mm，9，μm），0.05，mol/L硫酸緩沖液洗脫，柱溫30，℃，流量0.5，mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)215，nm.

1.7 數(shù)據(jù)分析

搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)平行并重復(fù)3次，利用Origin 8.0和SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理.30，L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次.

2 結(jié)果與分析

2.1 iclR基因缺失突變株構(gòu)建

本研究采用Red同源重組技術(shù)構(gòu)建iclR基因缺失突變株TRTH?iclR.先將378，bp、388，bp和1，024 bp的iclR基因的上、下游同源臂片段和氯霉素抗性Cmr片段通過重疊PCR擴(kuò)增得到大小為1，790，bp的?iclR片段，如圖1（a）所示；然后將?iclR片段電轉(zhuǎn)化到含有pKD46質(zhì)粒的TRTH感受態(tài)中，復(fù)蘇2，h后涂布于氨芐青霉素培養(yǎng)基上，挑取陽性菌進(jìn)行PCR驗(yàn)證，iclR敲除陽性菌PCR產(chǎn)物大小為1，790，bp，原菌PCR產(chǎn)物大小為1，207，bp，如圖1（b）所示.選取pCP20質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的陽性菌，切除基因組上的氯霉素抗性基因，成功構(gòu)建TRTH?iclR.

圖1 TRTH?iclR敲除菌PCR驗(yàn)證圖譜Fig. 1PCR identification map of TRTH?iclR knock-out mutant strains

2.2 iclR基因缺失突變株發(fā)酵測(cè)試

2.2.1 搖瓶分批補(bǔ)料發(fā)酵

將TRTH?iclR接種于 30，mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量10%，.定時(shí)取樣，經(jīng) 32，h發(fā)酵，結(jié)果如圖2所示.重組菌TRTH?iclR的細(xì)胞生物量（以干質(zhì)量計(jì)）最大為（10.52±0.42）g/L；L-色氨酸產(chǎn)量達(dá)到（6.52± 0.46）g/L，相比原菌提高了21.86%，.由此可見，在搖瓶上分批補(bǔ)料培養(yǎng)，敲除基因iclR能明顯提高菌體生物量和L-色氨酸積累量.搖瓶水平分批補(bǔ)料培養(yǎng)，重組菌 TRTH?iclR和原菌的耗糖速率幾乎同時(shí)在17，h達(dá)到峰值，之后的耗糖趨勢(shì)基本一致，說明敲除基因iclR對(duì)菌體耗糖能力影響很小，甚至有微弱促進(jìn)，因?yàn)榍罢叻逯德愿哂诤笳?；與原菌相比，重組菌胞內(nèi)ATP濃度更高，16，h時(shí)為（4，210±450）pmol/L，與原菌的差值達(dá)到最大，是原菌的2.1倍，這說明在發(fā)酵過程中重組菌的能量供給更充足.這可能是重組菌TRTH?iclR的生物量高于原菌的主要原因.

搖瓶分批補(bǔ)料培養(yǎng)下，重組菌 TRTH?iclR發(fā)酵過程乙酸積累更低，最大值為（6.82±0.58）g/L（圖3a），比原菌降低了37.63%.這說明在搖瓶條件下，重組菌不會(huì)增加乙酸的積累，一定程度上降低了乙酸對(duì)菌體的毒害作用.作為中間代謝物，發(fā)酵液中谷氨酸的含量對(duì)菌體的生長(zhǎng)代謝也具有重要影響，相較于原菌株，谷氨酸濃度更低，在15，h后保持在1.01，g/L，而原菌則保持在2.03，g/L（圖3，b）.雖然谷氨酸濃度略低，但搖瓶?jī)?nèi)菌體量有限，對(duì)谷氨酸的需求并不高，故影響不大.

圖2 大腸桿菌TRTHΔiclR搖瓶分批補(bǔ)料發(fā)酵過程曲線Fig. 2 The shake flask fed-batch fermentation process curve of E. coli TRTHΔiclR

圖3 搖瓶條件下的大腸桿菌TRTHΔiclR發(fā)酵液中乙酸積累濃度和谷氨酸濃度過程曲線Fig. 3Acetaic acid concentrations and glutamic acid concentrations in E. coli TRTHΔiclRshake flask fermentation broth

2.2.2 30，L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵

將種子液以13%，接種量接種于16，L發(fā)酵培養(yǎng)基中（30，L發(fā)酵罐）.發(fā)酵周期為36，h，每4，h取樣測(cè)細(xì)胞生物量和殘?zhí)橇坎⒂涗?，剩余部分離心留樣用于后續(xù)發(fā)酵液分析，結(jié)果如圖4和圖5所示.

重組菌TRTH?iclR細(xì)胞生物量（以干質(zhì)量計(jì)）為（30.36±2.10）g/L，相比原菌（42.52±2.50）g/L降低了28.59%，并且在培養(yǎng)16，h時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期，比原菌提前了4，h；L-色氨酸產(chǎn)量為（13.01±1.00）g/L，比原菌（32.81±2.20）g/L降低了60.34%.重組菌TRTH?iclR比耗糖速率先于原菌在11，h時(shí)就達(dá)到峰值，比原菌提前了7，h，并在22，h后比耗糖速率急劇下降，相比原菌耗糖明顯緩慢.胞內(nèi)ATP濃度在發(fā)酵前期與原菌的相差不大，但在發(fā)酵16，h時(shí)即降到（110±20）pmol/L，遠(yuǎn)低于原菌的（5，760±590）pmol/L，且此后幾乎檢測(cè)不到ATP含量，這可能是TRTH?iclR生物量低的原因.

30，L發(fā)酵罐發(fā)酵中，重組菌發(fā)酵液中的乙酸積累量略高于原菌，達(dá)到了（18.21±1.10）g/L，相比原菌增加了33.42%，.其原因可能是TRTH?iclR過多、過快的攝糖使菌體無法消耗，多余的糖則易轉(zhuǎn)化為乙酸.乙酸積累量的增多，加重了菌體的負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致菌體裂解死亡、生物量減少、活力下降.谷氨酸含量低于原菌，在20，h后保持在2，g/L，而原菌在24，h達(dá)到最高值4，g/L，并最終保持在3，g/L.

圖5 30，L發(fā)酵罐條件下的大腸桿菌TRTHΔiclR發(fā)酵液中乙酸積累濃度和谷氨酸濃度Fig. 5Acetaic acid concentrations and glutamic acid concentrations in E. coli TRTHΔiclR 30，L fermenter fermentation broth

3 討 論

通過敲除基因iclR，強(qiáng)化乙醛酸循環(huán)，并研究了TCA代謝流量改變對(duì)L-色氨酸合成的影響.基因iclR的缺失對(duì)菌體在搖瓶上L-色氨酸的積累有一定的促進(jìn)作用，但在30，L發(fā)酵罐上效果卻不明顯.在搖瓶上L-色氨酸產(chǎn)量高于原菌，可能是搖瓶的溶氧和pH條件等欠佳，在低生物量下，由于能量代謝相對(duì)較弱，敲除基因iclR的結(jié)果是通過TCA循環(huán)損失的CO2量減少，有利于提高L-色氨酸的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率.對(duì)比Lee等［8］的研究發(fā)現(xiàn)，缺失了基因iclR后的改造菌較出發(fā)菌有更高的L-蘇氨酸積累，可以推測(cè)增強(qiáng)乙醛酸循環(huán)敲除iclR會(huì)對(duì)下游的氨基酸代謝產(chǎn)生明顯影響，包括L-色氨酸合成（莽草酸途徑和分支途徑等）和L-蘇氨酸合成（蘇氨酸合成途徑）等.而在30，L發(fā)酵罐上，溶氧和pH等條件適宜時(shí)，菌體前期快速生長(zhǎng)，能量需求量大，而重組菌缺失iclR 基因，在促進(jìn)乙醛酸循環(huán)的同時(shí)，間接削弱TCA循環(huán)的進(jìn)行.同樣的結(jié)果出現(xiàn)在了周茜等［10］的實(shí)驗(yàn)中，可以推測(cè)作為TCA循環(huán)的支路——乙醛酸的加強(qiáng)一定程度上抑制了TCA循環(huán).作為中心代謝途徑，TCA循環(huán)一旦被削弱，則會(huì)從多方面影響菌體的生長(zhǎng)，例如使谷氨酸的合成量減少，而谷氨酸又是許多重要氨基酸的合成前體，可能影響菌體生長(zhǎng)和L-色氨酸的積累（圖4）；又如減少重要中間產(chǎn)物α-酮戊二酸的合成［10］，作為碳-氮代謝的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，其供應(yīng)量不足勢(shì)必會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)；同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致能量供應(yīng)不足，胞內(nèi)ATP濃度的降低（圖5）.供能不足會(huì)產(chǎn)生大量的乙酸（圖5），而乙酸對(duì)菌體生長(zhǎng)和各種酶的活性都有毒害和抑制作用，導(dǎo)致生物量偏低和L-色氨酸積累不足.根據(jù)相關(guān)研究［5，11-12］，在接下來可以嘗試對(duì)乙醛酸循環(huán)的強(qiáng)度進(jìn)行適時(shí)、準(zhǔn)確的調(diào)整，使其不會(huì)干擾菌體正常生長(zhǎng)，做到這點(diǎn)不易，需要更深刻地認(rèn)識(shí)乙醛酸循環(huán)和與其相關(guān)的代謝網(wǎng)絡(luò)；在強(qiáng)化能量代謝方面作進(jìn)一步研究，例如增加細(xì)胞生長(zhǎng)階段的ATP合成等；通過基因手段去除或減弱合成乙酸途徑，降低乙酸的積累等.

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責(zé)任編輯：郎婧

Effects of Knockout of Gene iclR on L-tryptophan Fermentation in Escherichia coli

CHEN Shengjie，LIU Hui，XIE Xixian，XU Qingyang，CHEN Ning
（National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology，Tianjin Engineering Lab of Efficient and Green Amino Acid Manufacture，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

Escherichia coli TRTH ΔiclR was constructed via knockout of iclR，the key gene of the glyoxylate shunt in E.coli TRTH through Red recombination to study the effects of iclR knockout on E.coli TRTH L-tryptophan accumulation.The results of shake flask fermentation indicated that the yield of L-tryptophan and the titer of L-tryptophan from glucose of E.coli TRTH ΔiclR reached（6.52±0.46）g/L and 13.17%，which were 21.86%， and 22.85%， higher than those obtained from E.coli TRTH，respectively；6.82，g/L of acetic acid accumulated in the culture of E.coli TRTH ΔiclR，which was 37.63%， lower than that of the control strain.In the fermentation of 30，L fermenter，the titer and yield of L-tryptophan of E.coli TRTH ΔiclR were（13.01±1.05）g/L and 6.51%，which were 60.34%， and 68.27%， lower than those of the control，respectively；18.21，g/L acetic acid，33.42%， times higher than that of the control，accumulated in the broth.In conclusion，in shake flask fermentation assays，the metabolic flux of the recombined strain was beneficial for L-tryptophan accumulation although the biomass was lower than E.coli TRTH.On the contrary，enhancement of glyoxylate shunt resulted in the shortage of energy supply and higher acetic acid accumulation，which can lead to lower biomass and L-tryptophan titer in 30，L fermentation.

L-tryptophan；Escherichia coli；glyoxylate shunt；iclR；fermentation

Q816

A

1672-6510（2016）03-0025-06

10.13364/j.issn.1672-6510.20150159

2015-10-14；

2015-12-11

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目（2012AA022102，2012AA02A703）；天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)資助項(xiàng)目（14ZCZDSY00015）

陳勝杰（1991—），男，河南新鄉(xiāng)人，碩士研究生；通信作者：陳 寧，教授，ningch@tust.edu.cn.