新型吲哚類衍生物對(duì)人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的影響

滕玉鷗，趙紅葉，周 瑤，韓開林，陸 斌，孫 華（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

新型吲哚類衍生物對(duì)人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的影響

滕玉鷗，趙紅葉，周 瑤，韓開林，陸 斌，孫 華
（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

為了深入研究吲哚類衍生物對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的作用及其機(jī)制，本文研究了19種吲哚類衍生物對(duì)人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的抑制作用并進(jìn)行了構(gòu)效關(guān)系分析，最終篩選出結(jié)構(gòu)全新且具有明顯抗腫瘤活性的候選化合物16. 進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)：化合物16能誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯；同時(shí)，Annexin V/PI雙染的結(jié)果表明化合物16能誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞的凋亡.

吲哚類衍生物；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

吲哚類衍生物具有廣泛的生物活性，如抗癌、抗抑郁、抗驚厥、抗真菌、抗HIV及消炎等［1］.在過去的幾十年中，越來越多的工業(yè)界和學(xué)術(shù)界研究人員已著手開發(fā)新的吲哚類抗癌藥物［2］.2006年FDA批準(zhǔn)的用于治療胃腸道間質(zhì)腫瘤和晚期腎細(xì)胞癌的化療藥舒尼替尼（Sutent）即為吲哚類衍生物.本課題組在前期工作中合成了一系列新型吲哚類衍生物，并對(duì)其抑制人白血病細(xì)胞K562的增殖作用進(jìn)行了初步研究［3-4］.

胃癌近年來呈現(xiàn)高發(fā)病率和高致死率的趨勢(shì)，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率僅次于肺癌，位居第二位.每年胃癌發(fā)病率約為萬分之六，死亡率約為萬分之三，居惡性腫瘤死亡第一位［5］.本文以人胃癌MGC-803細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究了吲哚類衍生物對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響及其初步的作用機(jī)制.首先通過MTT法［6］對(duì)19種化合物的抗腫瘤活性進(jìn)行測(cè)試，通過構(gòu)效關(guān)系分析篩選出具有明顯抗腫瘤活性的候選化合物.然后觀察候選化合物對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響，并應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)候選化合物對(duì)MGC-803細(xì)胞周期及凋亡的影響，從而闡明候選化合物抑制MGC-803細(xì)胞增殖的初步作用機(jī)制.深入研究吲哚類衍生物對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的作用及其機(jī)制，對(duì)擴(kuò)展該類化合物的抗腫瘤譜及日后開發(fā)新型吲哚類抗癌藥物具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌細(xì)胞MGC-803（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院藥物設(shè)計(jì)與合成研究室保存）用體積分?jǐn)?shù)為10%，胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37，℃、5%，CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn).吲哚類衍生物加入培養(yǎng)基前均用二甲基亞砜（DMSO）溶解.

1.2 試劑與儀器

PRMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液、巴西胎牛血清、0.25%，胰蛋白酶（1×）溶液、青霉素-鏈霉素溶液，賽默飛世爾科技公司；MTT、RNase A，北京索萊寶科技有限公司；乙醇（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；喜樹堿（分析純），北京偶合科技有限公司；二甲基亞砜，美國(guó)Amresco公司；Annexin V-FITC 凋亡試劑盒，美國(guó)BD公司；碘化丙啶（PI），西格瑪奧德里奇中國(guó)有限公司；本實(shí)驗(yàn)使用的吲哚類衍生物由天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院藥物設(shè)計(jì)與合成研究室成員韓開林等人合成.

TX323L型電子分析天平，島津國(guó)際貿(mào)易有限公司；Model 3100 series型CO2培養(yǎng)箱、MULTISKAN MK3型基礎(chǔ)酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技公司；CKX41型奧林巴斯倒置顯微鏡，奧林巴斯（中國(guó)）有限公司；TGL-20M型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；VORTEX-6型漩渦混合器、LX-300型迷你離心機(jī)，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；YXQ-LS-50SI型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司.

1.3 吲哚類衍生物抑制MGC-803細(xì)胞增殖的IC50值的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC-803細(xì)胞，用0.25%，胰蛋白酶消化，以5×104，mL-1濃度接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100，μL，置37，℃、5%，CO2培養(yǎng)箱孵育24，h.吲哚衍生物組（2—20）加藥終濃度分別為：10，μmol/L、1，μmol/L、0.1，μmol/L、10，nmol/L、1，nmol/L.同時(shí)設(shè)置等體積DMSO 溶劑對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組（喜樹堿），每組設(shè)3個(gè)平行孔.24，h后，每孔加入藥物0.5，μL，溶劑對(duì)照組加入等體積DMSO.37，℃、5%，CO2培養(yǎng)箱孵育48，h后，每孔加入MTT 20，μL，37，℃、5%，CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4，h后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基上清液，每孔加入DMSO 100，μL，置于培養(yǎng)箱10，min，使甲臜結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀492、630，nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，用Graph Pad Prism 5.0軟件計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的半數(shù)抑制濃度IC50值［7］.

1.4 化合物16對(duì)MGC-803細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC-803細(xì)胞，用0.25%，胰蛋白酶消化，以5×104，mL-1濃度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，37，℃、5%，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24，h.每孔加入10，μL終濃度為 300，nmol/L化合物16，繼續(xù)作用24，h.將各組細(xì)胞置于奧林巴斯倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及形態(tài)變化.

1.5 化合物16對(duì)MGC-803細(xì)胞周期的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC-803細(xì)胞，用0.25%，胰蛋白酶消化，以5×104，mL-1濃度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，在37，℃、5%，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24，h后每孔加入10，μL終濃度為 300，nmol/L化合物16，同時(shí)溶劑對(duì)照組加入等體積DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)6，h.以2，500，r/min離心5，min后收集細(xì)胞，并用預(yù)冷的PBS緩沖液500，μL清洗2次，2，500，r/min再次離心5，min收集細(xì)胞，緩緩加入預(yù)冷75%，乙醇，4，℃下固定過夜.1，000，r/min離心5，min后收集細(xì)胞，并用1，mL PBS清洗2次，最后用含有100，μg/mL RNase A、50，μg/mL PI、0.2%， Triton X-100 的PBS緩沖液500，μL重懸細(xì)胞，4，℃避光孵育30，min，立即用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期，得到其細(xì)胞周期的分布時(shí)相.

1.6 化合物16對(duì)MGC-803細(xì)胞凋亡的影響

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞鋪板，細(xì)胞濃度為5×104，mL-1，化合物16加藥終濃度為300，nmol/L，溶劑對(duì)照組加入等體積DMSO，加藥刺激24，h后，以2，500，r/min離心5，min后收集細(xì)胞.然后用預(yù)冷的500，μL PBS清洗2次，以2，500，r/min離心5，min后收集細(xì)胞.用100，μL 1×Binding buffer 重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為1×106，mL-1，置于新的EP管，加5，μL FITC Annexin V 和 5，μL PI，25，℃避光放置15，min，每管加400，μL 1×Binding buffer用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡測(cè)定［8］.

2 結(jié)果與分析

2.1 吲哚類衍生物抑制MGC-803細(xì)胞增殖的IC50值的測(cè)定結(jié)果

通過MTT法檢測(cè)5-取代吲哚類衍生物2—9對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803體外抗腫瘤活性，其中化合物1（喜樹堿）為陽(yáng)性對(duì)照，化合物2（靛紅）為母核化合物，結(jié)果見表1.

從表1中的數(shù)據(jù)可以看出，在C-5位引入甲基丙烯酸酯的化合物9表現(xiàn)出的抗腫瘤活性比母核化合物2至少提高130～230倍.因此，將化合物9作為先導(dǎo)化合物，進(jìn)一步研究了N-衍生物的構(gòu)效關(guān)系，結(jié)果見表2.

表1 吲哚類衍生物2—9抑制MGC-803細(xì)胞增殖的IC50值Tab. 1 IC50of indole derivatives 2-9 for MGC-803 cell

表2 吲哚類衍生物10—20抑制MGC-803細(xì)胞增殖的IC50值Tab. 2 IC50of indole derivatives 10-20 for MGC-803 cell

由表2可知，在N-1的位置引入芐基并在苯環(huán)的對(duì)位引入溴時(shí)，化合物16抑制MGC-803細(xì)胞生長(zhǎng)的IC50值為最低，達(dá)到了0.08，μmol/L.與溴芐基的對(duì)位取代化合物16相比，間位和鄰位溴芐基取代的化合物17和化合物18的生物活性有所降低，其IC50值分別為0.35，μmol/L和0.51，μmol/L.這一結(jié)果說明：R2處溴芐基取代的空間位置對(duì)化合物的活性有較大影響，對(duì)位的溴芐基取代能提高至少4～6倍的抗腫瘤活性.

表1和表2的構(gòu)效關(guān)系分析結(jié)果表明：在19個(gè)新型吲哚類衍生物中，化合物16較其他衍生物具有更高效的抗腫瘤活性.因此，將選擇化合物16為候選化合物，進(jìn)一步研究該化合物對(duì)MGC-803細(xì)胞形態(tài)學(xué)產(chǎn)生的影響和對(duì)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用.

2.2 化合物16對(duì)MGC-803細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

在普通光學(xué)顯微鏡下觀察MGC-803細(xì)胞生長(zhǎng)狀況時(shí)發(fā)現(xiàn)（圖1）：溶劑對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞形態(tài)完整；而化合物16（300，nmol/L）刺激24，h后，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)變化，細(xì)胞從不規(guī)則形態(tài)變成圓形并呈漂浮狀態(tài)，且多數(shù)呈漂浮狀態(tài).

圖1 化合物16對(duì)MGC-803細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響Fig. 1 Effect of compound 16 on MGC-803 cell morphology

2.3 化合物16對(duì)MGC-803細(xì)胞周期的影響

化合物16對(duì)MGC-803細(xì)胞周期的影響如圖2所示.從圖2中可以看出：濃度為300，nmol/L的化合物16處理細(xì)胞6，h后，與溶劑對(duì)照組相比，化合物16組的G1期以及S期細(xì)胞明顯下降，G2/M期細(xì)胞明顯上升（從12.7%，增加至32.8%）.說明化合物16能夠顯著引起MGC-803細(xì)胞周期發(fā)生G2/M期阻滯.

圖2 化合物16對(duì)MGC-803細(xì)胞周期的影響Fig. 2 Effect of compound 16 on MGC-803 cell cycle

2.4 化合物16對(duì)MGC-803細(xì)胞凋亡的影響

化合物16對(duì)MGC-803細(xì)胞凋亡的影響如圖3所示.

圖3 化合物16對(duì)MGC-803細(xì)胞凋亡的影響Fig. 3 Effect of compound 16 on MGC-803 cell apoptosis

從圖3中可以看出：化合物16 以300，nmol/L處理MGC-803細(xì)胞24，h后，右下象限早期凋亡細(xì)胞顯著增加（31.3%），比溶劑對(duì)照組的早期凋亡率（3.7%）增加了27.6%，說明候選化合物16能夠誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞的凋亡.這可能是該化合物抑制MGC-803細(xì)胞增殖的另一個(gè)作用機(jī)制.

3 討 論

吲哚類生物堿具有重要的生物活性，在已發(fā)現(xiàn)的天然吲哚類化合物中，有40多種可作為治療型藥［9］，如可治療心血管病、糖尿病及肺癌等多種疾病.吲哚類化合物在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用非常廣泛，如主要由5-甲氧基吲哚制取的松果腺素（又名腦白金）直接作用于下丘腦，具有促進(jìn)睡眠、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌及增強(qiáng)免疫力等多種生理功能［10］.

本文從吲哚衍生物的構(gòu)效關(guān)系分析入手，由于一些N-芐基靛紅衍生物表現(xiàn)出廣泛的生物活性，我們以化合物9作為一個(gè)潛在的先導(dǎo)化合物，進(jìn)一步集中N-衍生化類似物的構(gòu)效關(guān)系.首先通過在C-5位改變?nèi)〈?，通過分析化合物2—9對(duì)MGC-803胃癌細(xì)胞增殖抑制作用，發(fā)現(xiàn)C-5丙烯酸酯基團(tuán)取代的靛紅衍生物有潛在抗腫瘤活性，而后對(duì)C-5丙烯酸酯基團(tuán)取代的靛紅衍生物進(jìn)行了一系列N取代，取代合成了10—20的化合物.以同樣的方法對(duì)10—20這一系列化合物進(jìn)行MTT法分析，從數(shù)據(jù)和不同取代基團(tuán)分析選用活性較好的化合物16進(jìn)行進(jìn)一步的作用機(jī)制研究.

化合物16對(duì)MGC-803細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響和對(duì)細(xì)胞周期及凋亡的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：MGC-803細(xì)胞經(jīng)化合物16刺激后變成圓形，呈漂浮狀態(tài)；化合物16能夠顯著引起MGC-803細(xì)胞周期發(fā)生G2/M期阻滯.腫瘤細(xì)胞過度增殖的本質(zhì)是細(xì)胞周期調(diào)控異常，主要是兩方面原因：其一為細(xì)胞周期的驅(qū)動(dòng)機(jī)制失控（如Cyclins過表達(dá)，Cdk表達(dá)異常，CKI表達(dá)不足和突變Cyclins、Cdk和CKI表達(dá)異常）；其二為監(jiān)控機(jī)制受損，其主要原因?yàn)镚1/S、G2/M檢查點(diǎn)異常［11］.化合物16對(duì)這些細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的影響正在進(jìn)一步的研究中.同時(shí)，在研究化合物16對(duì)MGC-803細(xì)胞凋亡的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，化合物16能夠誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡.細(xì)胞凋亡是機(jī)體生長(zhǎng)、分化、發(fā)育和病理過程中由基因編碼調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)自殺過程，機(jī)體通過凋亡使衰老、畸變和能導(dǎo)致疾病的細(xì)胞清除［12］.化合物16具體是通過哪個(gè)通路誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡的，有待進(jìn)一步的研究.

綜上，化合物16對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803增殖有較好的抑制作用，該化合物能誘導(dǎo)G2/M期的阻滯和細(xì)胞凋亡.這一結(jié)果對(duì)深入研究具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型吲哚類抗腫瘤藥物具有重要意義.目前，關(guān)于化合物16更加深入的作用機(jī)制研究正在進(jìn)行中.

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責(zé)任編輯：郎婧

Effects of Novel Indole Derivatives on Human Gastric Cancer MGC-803 Cell Proliferation

TENG Yuou，ZHAO Hongye，ZHOU Yao，HAN Kailin，LU Bin，SUN Hua
（College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

In order to study the effect of indole derivatives on human gastric cancer cell proliferation and its mechanism，the structure-activity relationships of 19 indole derivatives were analyzed，and compound 16 with a novel structure was finally screed，which had significant anti-tumor activities.In further research，it was found that compound 16 can induced G2/M phase arrest in MGC-803 cells.After treatment，compound 16 also caused apoptosis in MGC-803 cells.

indole derivatives；cell proliferation；apoptosis

R962

A

1672-6510（2016）03-0016-04

10.13364/j.issn.1672-6510.20150114

2015-09-05；

2015-09-29

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31301142）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目（201410057069）

滕玉鷗（1976—），女，吉林人，副教授；通信作者：孫 華，副教授，sunhua@tust.edu.cn.

數(shù)字出版日期：2015-12-10；數(shù)字出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1355.N.20151210.1045.006.html.