熱休克蛋白質(zhì)DnaK的純化及其二聚體性質(zhì)研究

劉清岱，蘇家躍田雪利楊 營(yíng)趙 飛，盛長(zhǎng)忠（. 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 00457；. 天津天隆種業(yè)科技有限公司，天津 00457；. 丹娜（天津）生物科技有限公司，天津 00457）

熱休克蛋白質(zhì)DnaK的純化及其二聚體性質(zhì)研究

劉清岱1，2，蘇家躍1，田雪利1，楊 營(yíng)1，趙 飛1，2，盛長(zhǎng)忠1，3
（1. 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2. 天津天隆種業(yè)科技有限公司，天津 300457；3. 丹娜（天津）生物科技有限公司，天津 300457）

通過定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了兩個(gè)DnaK蛋白質(zhì)突變體，研究腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）和腺苷二磷酸（ADP）條件對(duì)熱休克蛋白質(zhì)DnaK二聚體性質(zhì)的影響.首先誘導(dǎo)表達(dá)DnaK蛋白質(zhì)的兩個(gè)突變體DnaK-A303C和DnaK-H541C，并采用硫酸鎳親和層析和陰離子交換層析對(duì)重組蛋白質(zhì)進(jìn)行純化.對(duì)等量的DnaK蛋白質(zhì)進(jìn)行氧化交聯(lián)處理，然后采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè)ATP、ADP對(duì)DnaK二聚體的影響.研究表明DnaK突變體在ADP的存在下以同二聚體的形式存在，但是在ATP條件下能夠形成異二聚體.由此為深入認(rèn)識(shí)熱休克蛋白質(zhì)兩個(gè)亞基之間的協(xié)同作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).

DnaK；ATP；二聚體；突變體

熱休克蛋白70s（heat shock proteins，Hsp70s）是從細(xì)菌到哺乳動(dòng)物中均廣泛存在的一類保守的蛋白質(zhì)家族，是維持蛋白內(nèi)穩(wěn)態(tài)所必需的分子伴侶［1］.在果蔬保鮮中，適當(dāng)?shù)臒崽幚碚T導(dǎo)產(chǎn)生的熱休克蛋白能夠提高果蔬抗冷性，降低冷害［2］，并能通過幫助調(diào)節(jié)果蔬采后的生理生化代謝［3］，保持果蔬原有品質(zhì)并延長(zhǎng)保鮮期［4-5］.同時(shí)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，熱休克蛋白及其自身抗體可能參與了許多疾病的發(fā)病過程［6］.

DnaK是大腸桿菌中的Hsp70蛋白質(zhì)，能夠促進(jìn)蛋白合成、折疊、裝配和運(yùn)輸并且參與變性蛋白的清除［7］.DnaK包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中N末端是腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）水解酶結(jié)構(gòu)域，C末端是底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域.DnaK與ATP的結(jié)合影響著DnaK蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，在沒有ATP的情況下，純化的DnaK形成無序的低聚物，當(dāng)DnaK與ATP結(jié)合時(shí)DnaK更傾向于形成二聚體結(jié)構(gòu)［8］.但是，其具體反應(yīng)機(jī)理和生化意義并不清楚，因此有必要對(duì)DnaK進(jìn)行純化，研究ATP與腺苷二磷酸（ADP）對(duì)DnaK蛋白質(zhì)二聚體的影響，進(jìn)而為醫(yī)學(xué)研究以及在食品科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用提供基本理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒

受體菌為dnak基因缺失的大腸桿菌（E.coli）菌株BB205（卡那霉素和氯霉素抗性），表達(dá)載體質(zhì)粒為pBB46（氨芐抗性），均由美國(guó)弗吉尼亞聯(lián)邦大學(xué)醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng).

1.2 試劑和儀器

DNA提取試劑盒，Qiagen公司；定點(diǎn)突變?cè)噭┖?，Agilent Technologies公司；蛋白質(zhì)marker，Biolabs公司；40%，丙烯酰胺、β-巰基乙醇、苯甲基磺酸鈉、十二烷基磺酸鈉等試劑，Sigma公司.

主要儀器包括AKTA prime蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)、Ni親和層析柱和陰離子交換柱（HisTrap）、12500，SERIES型搖床、1938型超聲儀、Mini-PROTEAN Ⅲ型電泳槽、RS232型分光熒光計(jì)等.

1.3 突變體質(zhì)粒的獲得

根據(jù)DnaK-ATP的空間結(jié)構(gòu)，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了兩個(gè)突變體，即將第303位、541位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼幔ˋ303C和H541C）.突變后經(jīng)純化的DNA經(jīng)測(cè)序，序列分析正確后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn).A303C，正向引物為5′-AAAGTGACTCGTTCAAACTGGAAAGC-3′，反向引物為5′-GCTTTCCAGTTTGAACGAGTCA CTTT-3′；H541C，正向引物為5′-CTGGTACAGACT ACCTGCTGCACAGC-3′，反向引物為5′-GCTGTGC AGCAGGTAGTCTGTACCAG-3′.PCR反應(yīng)體系為50，μL體系，PCR buffer 5，μL，PCR solution 1.5，μL，脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）1，μL，模板2，μL，5′引物2，μL，3′引物2，μL，DNA聚合酶1，μL.反應(yīng)程序?yàn)?4，℃模板預(yù)變性3，min，94，℃變性15，s，55，℃退火30，s，68，℃延伸4，min，68，℃充分延伸10，min，用4，℃進(jìn)行保存.

1.4 重組DnaK蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)所需的蛋白均是將dnak表達(dá)載體pBB46導(dǎo)入到dnak缺失菌株BB205中進(jìn)行表達(dá)而得到的.挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落于100，mL含有卡那-氯霉素-氨芐的LB培養(yǎng)基中，30，℃過夜進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后的菌體1﹕100接種于1，L培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，待菌體密度A600達(dá)到0.6時(shí)加入1，mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，4，h后誘導(dǎo)完成，離心收集菌體并用2倍磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗菌體［9］.

菌體充分重懸后加入100，μL 30，mg/mL的裂解酶充分裂解菌體，冰上孵育30，min后，置于冰水浴中進(jìn)行超聲裂解.超聲結(jié)束后，將裂解后的菌體于4，℃、20，000g離心1，h，上清液經(jīng)0.22，μm濾膜過濾后作為蛋白質(zhì)上樣液.

1.5 DnaK蛋白質(zhì)的純化

1.5.1 Ni親和層析純化

采用Ni親和柱進(jìn)行親和層析，上樣流量為1，mL/min.上樣結(jié)束后用裂解液PBS平衡洗脫柱子時(shí)，流量為5，mL/min，洗脫體積為300，mL，之后用含200，μmol的ATP、10，mmol醋酸鎂的裂解液以同樣流量清洗100，mL［10］.然后采用含4%，、8%，的洗脫液（2× PBS+300，mmol/L NaCl+400，mmol/L pH 為7.5的咪唑）對(duì)柱子進(jìn)行梯度洗脫，保持同樣流量，各洗200，mL.最后進(jìn)行梯度洗脫，洗脫流量為2，mL/min，總體積為120，mL，洗脫液的含量從8%，上升至60%，并收集樣品，每管3，mL.洗脫結(jié)束后，選取有紫外吸收值的樣品，取樣，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）進(jìn)行檢測(cè)［11］.

收集蛋白濃度較高且雜蛋白較少的樣品，置于相對(duì)分子質(zhì)量為1.0×104的透析袋中，在2倍PBS中過夜透析，同時(shí)加入1，mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）還原被氧化的蛋白.

1.5.2 陰離子交換柱進(jìn)一步純化

采用陽(yáng)離子交換柱進(jìn)一步純化，選擇5，mL/min的上樣流量.上樣結(jié)束后用溶液A（25，mmol/L pH 7.5的4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）+50，mmol/L NaCl+ 1，mmol/L DTT）沖洗柱子，流量為5，mL/min，體積為100，mL，之后用5%，溶液B（25，mmol/L pH 7.5，Hepes +1，mol/L NaCl+1，mmol/L DTT）繼續(xù)沖洗，流量為5，mL/min，體積為100，mL［12］.然后進(jìn)行蛋白梯度洗脫，洗脫流量為2，mL/min，總體積為120，mL，洗脫液（25，mmol/L pH 7.5，Hepes+1，mol/L NaCl+1，mmol/L DTT）的含量從5%，上升至60%，并收集樣品，每管3，mL［13］.洗脫后選取有紫外吸收值的樣品進(jìn)行SDSPAGE檢測(cè)其純度，然后收集樣品，濃縮，并用洗脫液稀釋，蛋白最終質(zhì)量濃度應(yīng)高于10，mg/mL.分裝后用液氮速凍并保存于-80，℃冰箱中.

1.6 蛋白質(zhì)交聯(lián)實(shí)驗(yàn)

利用溶液A（25，mmol/L pH 7.5，Hepes+ 150，mmol/L KCl+10，mmol/L Mg（OAc）2，10%，丙三醇+5，mmol/L DTT）將蛋白稀釋至5，mg/mL，并在冰上孵育2，h，以徹底除去產(chǎn)生的半胱氨酸殘基［14］.然后將樣品加到事先用溶液B（25，mmol/L pH 7.5，Hepes +150，mmol/L KCl+10，mmol/L Mg（OAc）2，10%，丙三醇）平衡好的除鹽柱子中，離心使蛋白通過柱子而除去DTT［15］.用超微量分光光度計(jì)測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，并用溶液B將蛋白稀釋至0.5，mg/mL，然后加入100，μmol/L 的硫酸銅和200，μmol/L的鄰菲羅啉開始氧化蛋白，氧化過程需在冰上進(jìn)行，1，h后加入終濃度為5，mmol/L 的二乙烯三胺（DETA）終止反應(yīng).通過聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)蛋白質(zhì)交聯(lián)結(jié)果［16］.

2 結(jié)果與討論

2.1 定點(diǎn)突變DNA測(cè)序結(jié)果

為了研究DnaK蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的DnaK的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域功能，設(shè)計(jì)DnaK-A303C、DnaKH541C兩個(gè)蛋白質(zhì)突變體，并構(gòu)建帶有突變位點(diǎn)的表達(dá)載體.將經(jīng)快速定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)（Quickchange）之后所得到的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，圖1為DnaK-A303C與DnaK野生型堿基序列比對(duì)圖，上一排顯示DnaKA303C堿基序列，下一排顯示DnaK堿基序列，其中第303位氨基酸對(duì)應(yīng)由907～909位堿基編碼，密碼子GCG突變成為UGU，對(duì)照氨基酸序列表，即由丙氨酸突變?yōu)榘腚装彼幔―naK-A303C）.測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，所有結(jié)果全部正確，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn).共得到DnaK-A303C、DnaK-H541C兩個(gè)突變質(zhì)粒.

2.2 蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌體，需要經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)并進(jìn)行下一步純化，結(jié)果如圖2所示，即DnaKA303C誘導(dǎo)表達(dá)前，蛋白質(zhì)分布均勻（泳道1、2）.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在大于6.6×104的位置有明顯的誘導(dǎo)條帶，此蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)量占蛋白質(zhì)總量的50%，以上（泳道3、4）.通過計(jì)算遷移率可知此蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量約為7.0×104，即為所需要的目標(biāo)蛋白質(zhì)DnaK-A303C.

圖1 DnaK-A303C與DnaK野生型測(cè)序堿基比對(duì)結(jié)果Fig. 1 Sequence comparison of DnaK-A303C and the wild DnaK

圖2 DnaK-A303C蛋白質(zhì)表達(dá)電泳圖Fig. 2 SDS-PAGE expression of DnaK-A303C

2.3 純化結(jié)果

2.3.1 Ni親和層析純化

Ni離子柱親和層析是一種高效的蛋白質(zhì)純化方法.本實(shí)驗(yàn)采用DnaK表達(dá)載體pBB46，重組表達(dá)的DnaK-A303C蛋白質(zhì)產(chǎn)物帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，可以采用Ni親和層析進(jìn)行高效純化.首先研究DnaKA303C蛋白質(zhì)在上清液和沉淀中的含量，比較圖3中第1、2、3泳道樣品，大部分目標(biāo)蛋白質(zhì)存在于上清液中，僅有少量目標(biāo)蛋白質(zhì)在沉淀中，說明重組表達(dá)的DnaK-A303C蛋白質(zhì)溶解性極好.

重組蛋白質(zhì)上柱后，分析上樣流出液的組成，發(fā)現(xiàn)少量目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)入流出液，說明目標(biāo)蛋白質(zhì)與Ni親和柱結(jié)合的較好（圖3，泳道4）.第5泳道為裂解液沖洗柱子的流出液樣品，由SDS-PAGE顯示，有雜蛋白質(zhì)脫離柱子.洗脫液以每管3，mL的體積進(jìn)行收集.凝膠第5泳道直至16泳道，所有樣品均為洗脫所得到的樣品.

圖3 Ni親和層析純化蛋白質(zhì)電泳圖Fig. 3 SDS-PAGE analysis of Ni-clumn purification

2.3.2 離子交換純化

由于DnaK-A303C蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為4.83，根據(jù)陰、陽(yáng)離子交換柱的不同性質(zhì)，繼續(xù)使用陰離子交換柱對(duì)2×PBS透析后的蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步純化.首先分析了樣品與陰離子交換柱的結(jié)合，其中第1泳道是上樣前的樣品，第2泳道為流出液，對(duì)比第1、2泳道，可以發(fā)現(xiàn)僅有少量蛋白質(zhì)沒有很好地與柱子結(jié)合，隨流出液流出（圖4）.從第3泳道至最后10泳道全部為梯度洗脫陰離子交換柱所得到的樣品.由電泳圖可見，陰離子交換柱對(duì)蛋白質(zhì)的進(jìn)一步純化具有較好的效果，特別是在2.7×104附近有一條雜蛋白質(zhì)在較高的鹽濃度時(shí)被洗脫下來，與大部分目標(biāo)蛋白質(zhì)分離開來.

圖4 陰離子交換柱純化蛋白質(zhì)電泳圖Fig. 4 SDS-PAGE analysis of Q-clumn purification

2.3.3 DnaK突變體的純化

將DnaK的兩個(gè)突變體（DnaK-A303C、DnaKH541C）依照兩步層析的方法分別進(jìn)行純化，并將所純化的蛋白質(zhì)同時(shí)稀釋至1，mg/mL，用7.5%，的SDSPAGE檢測(cè)其純度.純化結(jié)果如圖5所示，DnaK的兩個(gè)突變體在SDS-PAGE條件下呈現(xiàn)單獨(dú)的電泳帶，純度達(dá)85%，以上.

圖5 DnaK突變蛋白質(zhì)純化結(jié)果Fig. 5 Purified DnaK mutant proteins

2.4 蛋白質(zhì)交聯(lián)結(jié)果

為了研究ATP和ADP對(duì)DnaK二聚體的影響，將兩種蛋白質(zhì)等量混合后，采用銅-鄰菲羅啉氧化DnaK蛋白之間的二硫鍵，通過特殊二硫鍵的形成來研究二聚體的狀態(tài).兩個(gè)DnaK突變體在沒有ATP或ADP存在下，以相對(duì)分子質(zhì)量約為7.0×104的蛋白質(zhì)單體形式存在（圖6，泳道1—3）.在ADP條件下，DnaK-A303C形成相對(duì)分子質(zhì)量約為2.2×105同二聚體，DnaK-H541C形成相對(duì)分子質(zhì)量約為1.6× 105同二聚體（圖6，泳道4、5）.當(dāng)兩種突變體混合氧化后，同二聚體沒有變化，分別形成2.2×105和1.6×105兩條電泳帶（圖6，泳道6）.DnaK-A303C和DnaK-H541C之間二硫鍵氧化后形成的異二聚體結(jié)構(gòu).

圖6 Dnak蛋白質(zhì)交聯(lián)結(jié)果Fig. 6 Crosslinked Dnak protein

3 結(jié) 語(yǔ)

DnaK是原核生物中的熱休克蛋白質(zhì)，具有分子伴侶功能，需要從ATP水解過程獲取能量，以結(jié)合多肽底物并執(zhí)行正常功能.本文通過構(gòu)建兩個(gè)DnaK的突變體，研究在ATP或ADP條件下，對(duì)DnaK二聚體性質(zhì)的影響.研究表明兩個(gè)DnaK突變體在ADP的存在下以同二聚體的形式存在，但是在ATP條件下能夠形成異二聚體，ATP能夠影響DnaK蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu).已有研究報(bào)道了ATP結(jié)合熱休克蛋白后，誘導(dǎo)其發(fā)生變構(gòu)效應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)底物的結(jié)合［8］.本文通過兩個(gè)DnaK突變體在ATP條件下生成異二聚體，從生物化學(xué)的角度驗(yàn)證了該理論，對(duì)于揭示蛋白正確折疊和維持蛋白內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有重要意義.DnaK突變體蛋白質(zhì)經(jīng)IPTG高效誘導(dǎo)表達(dá)后，Ni親和層析柱純化與陰離子交換柱純化后可得到純度達(dá)85%，以上的蛋白質(zhì)，符合生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求.

DnaK突變體純化是整個(gè)實(shí)驗(yàn)中最為基礎(chǔ)，也最為關(guān)鍵的一步，因此需要在最大程度上提高蛋白的純度，并且保持蛋白活性.具體應(yīng)注意：蛋白質(zhì)對(duì)理化因素的影響特別敏感，特別是pH、溫度等.因此應(yīng)根據(jù)蛋白質(zhì)自身的等電點(diǎn)，結(jié)合所用層析柱的特性，選擇合適pH的緩沖液.同時(shí)，為了最大程度降低蛋白的變性和降解，整個(gè)純化過程都在4，℃層析柜中進(jìn)行.

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責(zé)任編輯：郎婧

Purification of DnaK Mutants and the Characteristics of DnaK Dimer

LIU Qingdai1，2，SU Jiayue1，TIAN Xueli1，YANG Ying1，ZHAO Fei1，2，SHENG Changzhong1，3
（1.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Tianlong Seeds Science and Technology Co.，Ltd，Tianjin 300457，China；3.Dynamiker Biotechnology（Tianjin）Co.，Ltd，Tianjin 300457，China）

Two DnaK mutants were constructed by site-directed mutagenesis to study the effect of ATP or ADP on heat shocked protein.DnaK-A303C and DnaK-H541C were expression through induction.Then the recombined proteinswere purified by using sulfate nickel affinity chromatography and anion exchange chromatography.The same amount of proteins was oxidized and the protein cross-linking was detected by SDS-PAGE.The results show that DnaK mutants formed dimmer in the presence of ADP.However，the heterodimer was found under the condition of ATP.This study provides an experimental basis for understanding the synergism between the two subunits of heat shocked protein.

DnaK；ATP；dimer；mutant

TS201

A

1672-6510（2016）03-0011-05

10.13364/j.issn.1672-6510.20150071

2015-06-07；

2015-09-06

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31571029）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目（15JCYBJC30300，15JCQNJC46300，15JCTPJC55400）

劉清岱（1975—），男（滿），河北保定人，副研究員，lqd@tust.edu.cn.

數(shù)字出版日期：2015-12-10；數(shù)字出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1355.N.20151210.1045.002.html.