超聲波法提取鐵甲草中黃酮的工藝研究

陳梓云

超聲波法提取鐵甲草中黃酮的工藝研究

陳梓云

（嘉應(yīng)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 梅州 514015）

以蘆丁為標(biāo)樣，采用分光光度法定量測出鐵甲草中總黃酮含量，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用正交試驗(yàn)法L9（34）對鐵甲草中黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選。其最佳工藝條件為：乙醇濃度60%，液固比20∶1，超聲時間40min，超聲溫度40℃。在此條件下，黃酮提取率為12.52%。

超聲波；鐵甲草；黃酮

鐵甲草，本名為圣蕨（Dietyocline gliffithii More），又名含羞草決明（或山扁豆，Cassia Mimosoides Linn），屬蕨類金星蕨科植物，主要分布于東北、華北、西北、華東、中南、西南和臺灣等地。據(jù)記載，鐵甲草是民間用于防治肝炎、肝硬化的常用草藥，具有清熱解毒、消炎、祛暑、祛濕、利尿、解酒、化積之功效，人們稱之為“肝病的克星”。因此，研究開發(fā)鐵甲草的藥用及食用價值很有意義。我們以產(chǎn)于梅州市本地的鐵甲草為原料，研究用超聲波法提取鐵甲草中有效成分——黃酮的工藝，旨在探索一種簡單、低成本、快速、有效的方法，為鐵甲草的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

KUDOS SK2510HP超聲儀，SHB-B95真空泵，F(xiàn)A1004電子天平，Human Power Ⅱ+超純水器，SHIMADZU UV-2401PC紫外可見光分光光度計等。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（AR），鐵甲草（梅州市蕉嶺縣），乙醇（AR），硝酸鋁（AR），亞硝酸鈉（AR），氫氧化鈉（AR）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取經(jīng)真空60℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)試劑0.02g，用60%（體積比）乙醇于60℃水浴中溶解，并定量轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，用60%乙醇定容，搖勻，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2 測定波長的確定

準(zhǔn)確移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0mL于50mL容量瓶中，加入60%乙醇定容至25.0mL，然后加入5% NaNO2溶液1.5mL，搖勻，放置6min。再加入10% Al（NO3）3溶液1.5mL，搖勻，再放置6min。加1.0mol·L-1NaOH溶液20.0mL，用去離子水稀釋定容至50.0mL，搖勻，放置10～15min后，以空白試劑作參比，使用分光光度計對工作溶液在波長350～600nm區(qū)間進(jìn)行連續(xù)方式掃描［1-3］，讀取吸光值，確定最大吸收峰，從而可以確定本實(shí)驗(yàn)的測定波長為508.80nm。

1.2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取1.2.1項(xiàng)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5、5.0、10.0、15.0、20.0mL于5個50mL容量瓶中，分別準(zhǔn)確加入60%乙醇稀釋成25.0mL。先加入5% NaNO2溶液1.5mL，搖勻，放置6min；再加入10% Al（NO3）3溶液1.5mL，搖勻，再放置6min；加1.0 mol·L-1NaOH溶液20.0mL，用水稀釋至50.0mL，搖勻，放置10～15min后，在最大吸收波長處測定吸光度A，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，作蘆丁溶液濃度-吸光度圖（圖1），得出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線y=11.407x+0.0140。

2 結(jié)果與討論

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度-吸光度圖Fig.1 Absorbance of Rutin standard solution

采用超聲波法提取鐵甲草中黃酮，具體實(shí)驗(yàn)步驟為：取鐵甲草，搗碎，烘干磨成粉末（過0.42mm篩），準(zhǔn)確稱取1.0g于100mL圓底燒瓶中，以乙醇為溶劑按一定液固比浸潤，將圓底燒瓶置于超聲儀中用59kHz超聲波處理一定時間后抽濾，得鐵甲草中總黃酮提取物的樣品溶液，用所對應(yīng)濃度的乙醇定容至50mL，放置一段時間后，取上層清液5.00mL于50mL容量瓶中，按1.2.3項(xiàng)下所用的方法，以空白試劑為參比，用1cm比色皿在最大吸收波長處測其吸光度，并計算樣品溶液的濃度及黃酮含量。

因超聲波法提取鐵甲草中黃酮類化合物，受到乙醇濃度、液固比、超聲時間、超聲溫度等幾個重要因素的影響，為此，先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，然后再采用L9（34）正交表設(shè)計實(shí)驗(yàn)，從而探討最佳實(shí)驗(yàn)條件以獲得最大提取率。

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度的確定

準(zhǔn)確稱取l.0g鐵甲草粉末，液固比20∶1，分別以20%、40%、60%、80%、95%的乙醇在60℃下超聲提取30min，抽濾，按1.2.3項(xiàng)的方法定容到50mL容量瓶中，測定其黃酮提取率，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖，結(jié)果見圖2。

從圖2可知，乙醇濃度在40%～80%時， 有較高的提取率，其中，80%乙醇下的提取率最大，當(dāng)乙醇濃度大于80%以后，黃酮提取率降低。較高乙醇濃度有利于提高黃酮提取率，但高濃度乙醇使其他醇溶性雜質(zhì)的溶出增多，有效成分溶出減少。

2.1.2 液固比的確定

圖2 乙醇濃度對提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction rate

準(zhǔn)確稱取1.0g鐵甲草粉末，液固比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，在60℃下以60%乙醇超聲波提取30min，抽濾，按1.2.3項(xiàng)的方法定容到50mL容量瓶中，測定其黃酮提取率，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖，結(jié)果見圖3。

圖3 液固比對提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate

從圖3可知，液固比在20∶1和25∶1時，有較高的提取率，其中，液固比在25∶1下的提取率最大，當(dāng)液固比在10∶1、15∶1、25∶1時，有明顯的上升趨勢，當(dāng)液固比為30∶1時，黃酮提取率有所降低?？赡苁怯捎邳S酮基本溶出完全，增加溶劑量反倒使得某些醇溶性物質(zhì)溶出影響黃酮的提取率。

2.1.3 超聲時間的確定

液固比20∶1，在60℃下以60%乙醇分別超聲回流10、20、30、40、50min，抽濾，按1.2.3項(xiàng)的方法定容到50mL容量瓶中，測定其黃酮提取率，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖，結(jié)果見圖4。

圖4 超聲時間對提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction rate

從圖4可知，超聲時間在10、20、40、50min時對提取率的影響不大，當(dāng)超聲時間在30min時，提取率最大。這可能是黃酮類化合物在某一時間段細(xì)胞內(nèi)外已達(dá)平衡，但是隨著時間的增加，其他物質(zhì)溶出從而影響黃酮的提取率。

2.1.4 超聲溫度的確定準(zhǔn)確稱取l.0g鐵甲草粉末，液固比20∶1，分別于40、50、60、70、80℃下以60%乙醇超聲提取30min，抽濾，按1.2.3項(xiàng)的方法定容到50mL容量瓶中，測定其黃酮提取率，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖，結(jié)果見圖5。

圖5 超聲溫度對提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate

從圖5可知，超聲溫度在50℃時，有較高的提取率，當(dāng)超聲溫度在40～50℃時，有明顯的上升趨勢，當(dāng)超聲溫度超過50℃，黃酮提取率有所降低。這可能是由于溫度的升高，部分黃酮類化合物被氧化，此外，溫度升高，易導(dǎo)致其它易溶物溢出量增加，同樣可導(dǎo)致總黃酮提取率的降低。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

設(shè)計4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，選擇乙醇濃度、液固比、超聲時間和超聲溫度為實(shí)驗(yàn)因素，以黃酮提取率為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，選用L9（34）正交組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，具體因素水平見表1。

表1 因素水平表Table 1 The form of factors level

2.3 最佳提取工藝條件的確定

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖，得出超聲波法最佳實(shí)驗(yàn)條件的區(qū)域，從而采用L9（34）正交法設(shè)計因素水平表（表2）。

超聲波法提取鐵甲草中黃酮含量的條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄見表2。

表2 L9（34）正交設(shè)計表Table 2 L9（34）Orthogonal design table

極差分析表明，超聲波法影響黃酮提取率的主次因素為超聲時間＞超聲溫度＞乙醇濃度＞液固比，所以最佳提取工藝為A2B2C3D1，即60%乙醇，液固比20∶1，時間40min，超聲溫度40℃。

2.4 鐵甲草中黃酮含量分析

以蘆丁為標(biāo)樣，在最佳工藝條件下獨(dú)立平行測定5次，計算黃酮類化合物的總量，得出鐵甲草黃酮提取液測定結(jié)果見表3。

表3 黃酮含量的平行實(shí)驗(yàn)Table 3 The parallel experiments of Flavonoids Content

從表3的數(shù)據(jù)可知，在該條件下測定的黃酮提取率基本穩(wěn)定，相對平均偏差較小，可信度較高，由此可以判定，在超聲波最佳工藝條件下測定黃酮的含量為12.52%。

3 結(jié)論

以蘆丁為標(biāo)樣，采用分光光度法定量測出鐵甲草中總黃酮含量，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用正交試驗(yàn)法L9（34）對鐵甲草中黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選。超聲波法影響黃酮提取率的主次因素為超聲時間＞超聲溫度＞乙醇濃度＞液固比，其最佳工藝條件為60%乙醇，液固比20∶1，時間40min，超聲溫度40℃，在最佳工藝條件下，超聲波提取法對鐵甲草的黃酮提取率為12.52%。分析認(rèn)為，超聲波技術(shù)對遇熱不穩(wěn)定、易水解或氧化的黃酮有效成分具有保護(hù)作用，有利于后期的分離和純化。如今超聲波技術(shù)發(fā)展較為成熟，設(shè)備的維護(hù)和保養(yǎng)比較方便，操作簡單易行，其作為一種先進(jìn)的提取方法，應(yīng)用在鐵甲草中黃酮的提取和純化，具有廣闊的前景［4-5］。

［1]呂幫玉，楊新河.超聲波提取山楂葉總黃酮的工藝研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（3）：845-846.

［2]劉振南.用正交法探討山楂葉中黃酮類化合物的乙醇提取工藝［J］.廣西民族學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)版，1999（3）：27-28.

［3]汪洪武，劉艷清.正交試驗(yàn)法優(yōu)選水澤蘭總黃酮提取工藝研究［J］.中藥材，2006，29（9）：977-979.

［4]齊麗霞，鄭彥峰，談鋒.銀杏葉總黃酮提取方法的比較研究［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007，19（1）：80-83.

［5]張珊珊，趙曉紅.不同提取方法對北京市早園竹葉黃酮提取效率比較［J］.食品科技，2008（3）：167-170.

Ultrasonic Extraction of Flavonoids in Dietyocline Gliffithii More

CHEN Zi-yun
（School of Chemistry and Environment， Jiaying University， Meizhou 514015， China）

As a quantitative analysis method， spectrophotometer was used to measure the total flavonoids content in dietyocline gliffithii more. Based on single-factor tests， the conditions of flavonoids extraction were optimized by orthogonal method L9（34）. The optimum conditions were as followed： ethanol concentrations 60%， liquid-solid ratio was 20：1， ultrasonic time was 40min and ultrasonic temperature was 40℃. Under such conditions， the extraction rate of flavonoids was up to 12.52%.

ultrasonic； dietyocline gliffithii more； flavonoids

R 284.2

A

1671-9905（2016）03-0018-04

陳梓云（1963-），男，漢，重慶云陽人，教授，碩士，主要從事應(yīng)用化學(xué)教學(xué)與研究，電話：18607530829，E-mail：chenzy@ jyu.edu.cn

2016-01-07