野生一粒小麥根干旱響應(yīng)蛋白的篩選與鑒定

李鮮花，劉永華，劉 輝，劉翠英

(1.榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，陜西榆林 719000；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，貴州貴陽 550006)

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野生一粒小麥根干旱響應(yīng)蛋白的篩選與鑒定

李鮮花1，劉永華1，劉 輝2，劉翠英1

(1.榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，陜西榆林 719000；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，貴州貴陽 550006)

摘要：為解析野生一粒小麥根響應(yīng)干旱脅迫的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，用20%(w/v) PEG6000處理兩葉一心期野生一粒小麥，通過對小麥根蛋白質(zhì)的分離和鑒定，分析了干旱脅迫下野生一粒小麥根中的蛋白質(zhì)變化。結(jié)果共分離、鑒定得到85個表達(dá)差異倍數(shù)在1.5以上的蛋白質(zhì)。這些差異蛋白主要涉及碳代謝(27%)、氨基酸代謝(15%)、解毒與防御(11%)、分子伴侶(8%)、能量代謝(8%)、信號傳導(dǎo)(6%)、蛋白質(zhì)代謝(5%)、脂代謝(4%)、轉(zhuǎn)錄與翻譯(4%)、核苷酸代謝(2%)以及骨架蛋白(1%)。對這些表達(dá)差異蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的功能分析，發(fā)現(xiàn)大部分信號傳導(dǎo)相關(guān)蛋白上調(diào)表達(dá)；碳代謝途徑中的糖酵解相關(guān)蛋白下調(diào)表達(dá)，而磷酸戊糖途徑相關(guān)蛋白上調(diào)表達(dá)。同時下調(diào)表達(dá)的還包括蛋白質(zhì)代謝相關(guān)蛋白。大部分氨基酸代謝相關(guān)蛋白質(zhì)下調(diào)表達(dá)，但是谷氨酸脫羧酶及甲硫氨酸合酶含量上升。結(jié)果表明，干旱脅迫增強(qiáng)了野生一粒小麥根中信號傳導(dǎo)與磷酸戊糖途徑代謝，促進(jìn)了谷氨酸與甲硫氨酸的生物合成，降低了糖酵解與蛋白質(zhì)代謝等過程。研究結(jié)果豐富了野生一粒小麥根響應(yīng)干旱脅迫機(jī)制信息。

關(guān)鍵詞：干旱脅迫；野生一粒小麥；蛋白質(zhì)組學(xué)；雙向電泳

作為世界主要糧食作物之一，小麥的生產(chǎn)很容易受到全球氣候變化與水分虧缺環(huán)境的影響[1]。干旱是導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)最主要的非生物逆境脅迫因子[2]，而全球氣候變暖，更加深了干旱對農(nóng)作物產(chǎn)量的影響[3]。因此，有必要從分子水平揭示小麥響應(yīng)干旱脅迫的機(jī)制，為干旱耐受新品種的培育提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

植物配備有復(fù)雜而精細(xì)的響應(yīng)機(jī)制以適應(yīng)干旱缺水環(huán)境，這種復(fù)雜的響應(yīng)機(jī)制是由植物感應(yīng)干旱脅迫信號引起的轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制而起始，繼而導(dǎo)致解剖結(jié)構(gòu)、生理生化狀態(tài)的改變，如氣孔關(guān)閉、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與抗氧化劑的合成等[1-2]。普通小麥的祖先有很多具優(yōu)良的耐旱性，如山羊草(Aegilopstauschii)、烏拉爾圖(T.urartu)、野生一粒小麥(T.boeoticum)[4-6]，這些小麥近源物種是改良普通小麥耐旱性的重要基因庫。野生一粒小麥可以耐受各種環(huán)境脅迫因子，包括鹽脅迫、病蟲害等[7]，其耐旱性顯著強(qiáng)于野生二粒小麥、普通小麥[6]，是當(dāng)前改善小麥品種耐旱性有效、重要的潛在基因庫。

通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，在野生二粒小麥中，多種脅迫耐受基因的篩選與鑒定獲得成功[8]。然而，由于基因轉(zhuǎn)錄、翻譯成蛋白質(zhì)需要經(jīng)歷復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄、翻譯后修飾，使得基因與蛋白質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)性較低，而蛋白質(zhì)是脅迫信號感應(yīng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、解毒防御、生物大分子結(jié)構(gòu)保護(hù)等的直接作用因子，因此，比較蛋白質(zhì)組學(xué)是揭示植物響應(yīng)干旱脅迫強(qiáng)有力的研究技術(shù)[9]。已經(jīng)有研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析了野生小麥與普通小麥葉片在干旱脅迫下的蛋白質(zhì)變化[10]。在小麥根蛋白質(zhì)組學(xué)方面，Nasser等[11]分別比較了在較高和較低氮營養(yǎng)水平下兩個小麥品種蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，結(jié)果顯示硝酸還原酶和谷氨酸脫氫酶相關(guān)蛋白與氮營養(yǎng)水平正相關(guān)。Kong等[12]利用凝膠和LC-MS-MS生物質(zhì)譜法鑒定了水澇脅迫下小麥根系細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)組，推測小麥幼苗通過限制細(xì)胞生長來應(yīng)對水澇脅迫，以避免能量消耗。然而，對干旱脅迫下野生一粒小麥根中蛋白質(zhì)組變化的研究較少，目前只有一篇文獻(xiàn)有報導(dǎo)[13]，野生一粒小麥根的干旱響應(yīng)機(jī)制仍然不明確。

為揭示耐寒性較強(qiáng)的野生一粒小麥響應(yīng)干旱脅迫的分子機(jī)制，本研究采用2-DE和MALDI-TOF-TOF-MS生物質(zhì)譜鑒定法對20%PEG6000處理24 h、48 h的野生一粒小麥根蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，以明確表達(dá)差異蛋白質(zhì)與野生一粒小麥抗旱性的相關(guān)性，并對其功能與代謝途徑進(jìn)行進(jìn)一步分析，以期從蛋白質(zhì)組水平揭示野生一粒小麥響應(yīng)干旱脅迫的分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料與干旱處理

試驗材料為野生一粒小麥(Triticumboeticum)，由西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥改良中心提供。種子在室溫黑暗條件下于濕潤濾紙上發(fā)芽后，在光/暗比16 h/8 h、溫度23～25 ℃、相對濕度65%～75%條件下培養(yǎng)；兩葉期時轉(zhuǎn)移到1/4 Hoagland培養(yǎng)液中，每3 d更換一次培養(yǎng)液；三葉期用20% PEG6000分別處理24 h、48 h后收集根，于-80 ℃下冷凍。3個重復(fù)。

1.2蛋白質(zhì)提取

根蛋白樣品制備參照Liu等[13]的方法，稍有修改。將冷凍根在液氮中用預(yù)冷的研缽研磨成粉末。取粉末500 mg，加入10 mL含有10%檸檬酸和0.07%β-巰基乙醇沉淀蛋白的冷丙酮，-20 ℃過夜后于4 ℃、19 000 r·min-1離心1 h，沉淀用含有0.07% β-巰基乙醇沉淀蛋白的冷丙酮清洗三次。將沉淀凍干以除去殘留的丙酮，即為提取蛋白。

將提取蛋白溶解于1 mL裂解緩沖液(7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，4% CHAPS，65 mmol·L-1Dithiothreitol( DTT)，微量蛋白質(zhì)抑制劑)中，4 ℃靜置1.5 h；4 ℃、19 000 r·min-1離心1 h，上清液即為蛋白樣品。以BSA(1 mg·mL-1)為標(biāo)準(zhǔn)，用2-D Quant Kit定量試劑盒(GE公司)測定樣品濃度，并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3雙向電泳、圖像分析與MALDI-TOF-TOF生物質(zhì)譜分析

雙向電泳操作參考Liu等[13]的方法進(jìn)行。采用17 cm IPG膠條(pH 4～7)，上樣量為250 μg。SDS-PAGE電泳在11.25%聚丙稀酰胺凝膠上進(jìn)行。蛋白點用銀染顯色。

圖像分析采用PDQuest 8.0.1軟件(Bio-Rad公司，Hercules,CA)。以未脅迫處理為對照樣品，自動檢測匹配和歸一化后，人工進(jìn)行進(jìn)一步處理。表達(dá)差異倍數(shù)在1.5以上、P≤0.01的蛋白點為差異蛋白。

從2-DE膠中把差異蛋白點切出，膠內(nèi)酶解及Ziptip脫鹽，然后進(jìn)行4800 Plus MALDI-TOF-TOF-MS(AB SCIEX，USA)質(zhì)譜分析，所得數(shù)據(jù)在NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，詳細(xì)步驟及各種參數(shù)設(shè)置參照Liu 等[13]的方法。蛋白質(zhì)評分C. I.%超過95%的蛋白質(zhì)認(rèn)定為鑒定成功的蛋白。

2結(jié)果與分析

2.1干旱脅迫下野生一粒小麥蛋白質(zhì)組的總體變化

從圖1可以看出 ，處理間的膠圖重復(fù)性較好，表明2-DE結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性較高。通過雙向電泳和MALDI-TOF-TOF生物質(zhì)譜分析共鑒定出了85個差異蛋白，其中有5組蛋白質(zhì)點確定為相同的蛋白質(zhì)(圖2)。85個差異蛋白中有49個下調(diào)表達(dá)，36個上調(diào)表達(dá)。其中，有40個差異蛋白點在24 h和48 h兩個處理中均下調(diào)表達(dá)，30個蛋白點均上調(diào)表達(dá)。處理24 h的根蛋白表達(dá)水平的變化顯著強(qiáng)于48 h處理，表明24 h處理的野生一粒小麥根系對干旱脅迫的響應(yīng)比48 h更嚴(yán)重，可能受干旱脅迫24 h后野生一粒小麥開啟了適應(yīng)機(jī)制。

2.2干旱脅迫下野生一粒小麥差異蛋白質(zhì)的MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定及功能分類

對已鑒定的85個差異蛋白質(zhì)按功能分類，其中77個功能確定蛋白分別為碳代謝(27%)、氨基酸代謝(15%)、解毒與防御(11%)、分子伴侶(8%)、能量代謝(8%)、信號傳導(dǎo)(6%)、蛋白質(zhì)代謝(5%)、脂代謝(4%)、轉(zhuǎn)錄與翻譯(4%)、核苷酸代謝(2%)以及骨架蛋白(1%)，大約有一半以上蛋白質(zhì)參與碳代謝、氨基酸代謝和解毒防御。結(jié)果表明，干旱脅迫主要影響了野生一粒小麥根的解毒和防御、碳代謝及氨基酸代謝等過程。

為了獲得8個未知差異蛋白的更多信息，應(yīng)用BLASTP工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，利用未知蛋白質(zhì)序列作為供體序列，查詢其同源蛋白。結(jié)果表明有5個未知蛋白的氨基酸序列與已知蛋白的相似度達(dá)到90%以上，表明它們可能具有相似的功能；3個蛋白質(zhì)的功能有待進(jìn)一步研究驗證(表1)。

2.3干旱脅迫下野生一粒小麥根信號傳導(dǎo)相關(guān)蛋白的變化

通過2-DE及MALDI-TOF-TOF分離鑒定，在干旱脅迫下的野生一粒小麥根中，共發(fā)現(xiàn)5個信號相關(guān)的差異蛋白，其中有3個在干旱處理24 h、48 h均上調(diào)表達(dá)，2個在24 h、48 h均下調(diào)表達(dá)。上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)為pyrabactin resistance 1(R62)、14-3-3-like protein GF14-B-like(R63)、robable calcium-binding protein CML28-like(R64)，均是植物體內(nèi)信號傳導(dǎo)相關(guān)的關(guān)鍵蛋白。2個下調(diào)蛋白質(zhì)中包含有RAB-GDP解離抑制因子(R61)，可抑制GTP的合成，對細(xì)胞感應(yīng)逆境信號起負(fù)調(diào)控作用。結(jié)果表明，干旱脅迫可促進(jìn)野生一粒小麥根的信號傳導(dǎo)能力。

A:對照樣品的2-DE圖譜；B:20%PEG6000處理24 h的2-DE圖譜;C:20% PEG6000處理48 h的2-DE圖譜

A:2-DE gel of the control sample; B:2-DE gel of sample treated with 20% PEG6000 for 24 h;C:2-DE gel of sample treated with 20% PEG6000 for 48 h

圖1干旱脅迫下野生一粒小麥根蛋白質(zhì)2-DE圖譜

Fig.1Representative 2-DE gels of identified proteins in root ofT.boeoticumwith drought

2.4干旱脅迫下野生一粒小麥根抗氧化和防御相關(guān)蛋白的變化

通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共有9個差異蛋白參與野生一粒小麥根抗氧化與防御過程，其中有8個在干旱脅迫24 h、48 h后均上調(diào)表達(dá)，以過氧化物酶和谷胱甘肽合成相關(guān)酶為主，這些蛋白質(zhì)是去除過量活性氧過程中的關(guān)鍵酶；只有1個蛋白在干旱處理24 h、48 h后下調(diào)表達(dá)。綜合結(jié)果表明，干旱脅迫處理野生一粒小麥可促使根的解毒和防御能力增強(qiáng)。

2.5干旱脅迫下野生一粒小麥根碳代謝和能量代謝相關(guān)蛋白的變化

通過比較干旱脅迫與對照組中的野生一粒小麥根中的差異蛋白質(zhì)組變化，發(fā)現(xiàn)有23個差異蛋白涉及碳代謝過程，其中有19個是糖酵解過程中的關(guān)鍵蛋白；16個蛋白質(zhì)在干旱脅迫24 h、48 h后下調(diào)表達(dá)，包括葡萄糖磷酸變位酶、烯醇酶等；1個蛋白在干旱處理24 h、48 h后均上調(diào)表達(dá)，1個蛋白質(zhì)在干旱處理24 h變化不大，而在干旱脅迫48 h后上調(diào)表達(dá)。說明干旱脅迫抑制了野生一粒小麥根的糖酵解過程。有2個蛋白是磷酸戊糖途徑相關(guān)蛋白，在干旱處理24 h、48 h后均上調(diào)表達(dá)，這些蛋白質(zhì)豐度的上調(diào)，可增強(qiáng)干旱脅迫下野生一粒小麥根的磷酸戊糖途徑。沒有發(fā)現(xiàn)TCA循環(huán)相關(guān)蛋白。

在糖酵解、TCA循環(huán)、磷酸戊糖途徑等過程中，通常伴隨著能量的消耗或產(chǎn)生。對7個能量代謝相關(guān)蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3個蛋白在干旱脅迫24 h、48 h后均上調(diào)表達(dá)，4個下調(diào)表達(dá)，他們在各自的代謝途徑中起主要作用，表明干旱脅迫導(dǎo)致根中能量代謝較為復(fù)雜的變化。

綜合上述結(jié)果，可以推測，在干旱脅迫下的野生一粒小麥根中，可能主要通過磷酸戊糖途徑供應(yīng)野生一粒小麥根生長所需的物質(zhì)和還原力。

A 和B為干旱處理0 h 和24 h 后根蛋白圖。有5組共10個明顯變化的蛋白點

A and B,root proteins after 0 and 24 h of drought treatment. A total of 10 differentially changed protein spots corresponding to 5 unique proteins are shown

圖2干旱脅迫下2-DE法檢測野生一粒小麥根蛋白的同源異構(gòu)體蛋白點

Fig.2Close-up of possible isoforms detected by 2-DE of proteins in root ofT.boeoticumunder drought stress

2.6干旱脅迫下野生一粒小麥根氨基酸、蛋白質(zhì)代謝相關(guān)蛋白的變化

干旱脅迫野生一粒小麥根中，共發(fā)現(xiàn)13個與氨基酸和氮代謝相關(guān)的差異蛋白質(zhì)，其中有8個蛋白質(zhì)在干旱處理24 h、48 h后下調(diào)表達(dá)，包括谷氨氨酰胺合酶、精氨酸合酶等，只有5個在干旱處理24 h、48 h后上調(diào)表達(dá)，包括甲硫氨酸合酶與谷氨酸脫羧酶等。表明干旱脅迫降低了野生一粒小麥根中的谷氨酰胺、精氨酸的合成，而增強(qiáng)了甲硫氨酸、谷氨酸的合成。

表1　未知蛋白的同源blast分析結(jié)果

蛋白質(zhì)代謝通常包括蛋白質(zhì)的生物合成、蛋白質(zhì)折疊與蛋白質(zhì)降解等過程。本研究共發(fā)現(xiàn)有5個差異蛋白與蛋白質(zhì)生物合成相關(guān)，其中3個蛋白在干旱處理24 h、48 h后上調(diào)表達(dá)，2個下調(diào)表達(dá)，表明干旱脅迫導(dǎo)致小麥根蛋白質(zhì)生物合成受到較大的干擾。分子伴侶蛋白與蛋白質(zhì)折疊相關(guān)， 研究發(fā)現(xiàn)有7個分子伴侶蛋白，其中6個在干旱處理24 h、48 h后下調(diào)表達(dá)，只有1個上調(diào)表達(dá)，表明干旱脅迫導(dǎo)致野生一粒小麥根的蛋白質(zhì)折疊過程受到抑制。干旱脅迫下，有5個差異蛋白參與野生一粒小麥根的蛋白質(zhì)降解過程，其中只有1個蛋白質(zhì)在干旱處理24 h、48 h后上調(diào)表達(dá)，另外4個下調(diào)表達(dá)。綜合結(jié)果表明，干旱脅迫降低了野生一粒小麥根中氨基酸和氮代謝、蛋白質(zhì)生物合成、蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)降解等過程。

3討 論

3.1差異蛋白質(zhì)的2-DE與MALDI-TOF-TOF鑒定結(jié)果的比較

總的來說，在第二向SDS-PAGE 電泳后，蛋白點分子量實測值與理論值的誤差大約為±10%。發(fā)現(xiàn)兩個蛋白點(點編號為R72,R84)的分子量比理論值明顯偏小，表明這些蛋白質(zhì)可能是完整蛋白質(zhì)的部分降解產(chǎn)物。5組蛋白質(zhì)(點編號為 R48 和 R49,R10 和 R14,R11和 R16,R30 和 R36,R20 和 R23)確定為相同蛋白質(zhì)，但是在雙向電泳中顯示不同的位點，這可能是由于轉(zhuǎn)錄后修飾等原因，如磷酸化和糖基化等。鹽脅迫下的鹽生草中有類似的發(fā)現(xiàn)[14]，表明脅迫因子可能影響植物體內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化與糖基化水平，以適應(yīng)外界環(huán)境的變化。

3.2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白

植物通常通過激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)開始干旱脅迫響應(yīng)，通過改變信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白含量來適應(yīng)水分脅迫。本試驗中獲得的pyrabactin resistance 1(PYR1) 蛋白可與2C型蛋白磷酸酶(PP2Cs)相互作用，降低ABA通路中PP2Cs磷酸酶的活性，對ABA信號通路進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)[15]。蛋白點R62屬于PYR/PYLs，它的豐度上升使得野生一粒小麥根具有較高的抗旱性。

蛋白點R61是RAB-GDP解離抑制因子(RAB-GDI)，在RAB / YPT蛋白的GTP酶循環(huán)中有重要作用，可將GDP與RABs綁定，通過抑制GDP釋放，維持GDP鍵的非活性狀態(tài)[16]。這種蛋白可下調(diào)通過GDP釋放引起新一輪GTP酶循環(huán)，使野生一粒小麥根系在干旱脅迫下觸發(fā)了不同的跨膜信號傳導(dǎo)系統(tǒng)。

兩種鈣結(jié)合蛋白(點編號R60，R64)則表現(xiàn)出相反的表達(dá)模式，R64蛋白上調(diào)，R60蛋白下調(diào)。當(dāng)使用鈣調(diào)蛋白拮抗劑后，非生物脅迫中鈣調(diào)蛋白或類鈣調(diào)蛋白直接導(dǎo)致了脅迫阻力下降和基因的表達(dá)[17]。鈣調(diào)蛋白或類鈣調(diào)蛋白與Ca2+在EF-手形結(jié)構(gòu)域結(jié)合，改變了與靶蛋白相互作用的構(gòu)象，導(dǎo)致靶蛋白的激活或失活[18]。R60和R64分別被確定為類鈣調(diào)蛋白49亞型1(CML49-like isoform 1)和類鈣調(diào)蛋白28(CML28-like)，它們在干旱脅迫下鈣通道內(nèi)的功能仍不能確定。由于R60蛋白豐度下調(diào)，R64蛋白豐度上調(diào)，其功能可能是使蛋白表達(dá)激活。

野生一粒小麥根系在干旱脅迫24 h和48 h后均誘導(dǎo)出了14-3-3 蛋白，它與GF14-B-like(R50)相類似。14-3-3蛋白可以結(jié)合大量的功能不同的蛋白質(zhì)，包括激酶、磷酸酶和跨膜受體等，從而使14-3-3蛋白在諸如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控等許多重要調(diào)節(jié)過程中起重要作用[19]。當(dāng)植物受到非生物脅迫時，這些蛋白還通過調(diào)節(jié)ATP酶保持細(xì)胞離子平衡[20]。在水稻的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)組中也觀察到類似的蛋白質(zhì)GF14-C和GF14-B[21]。

總之，GF14-B-like 蛋白 和 CML28-like 蛋白的豐度上調(diào)，PYR1,RAB-GDI 和 CML49-like isoform 1蛋白豐度下調(diào)，增強(qiáng)了干旱脅迫下野生一粒小麥根系的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。

3.3碳、能量、氨基酸和氮代謝相關(guān)蛋白

糖酵解可將葡萄糖轉(zhuǎn)換成丙酮酸與質(zhì)子H+，代謝過程所釋放的自由能被轉(zhuǎn)換成高能化合物ATP與NADPH。TCA循環(huán)是細(xì)胞呼吸過程中的第二階段，可在有氧環(huán)境中將丙酮酸降解成二氧化碳與水，并伴隨著能量的產(chǎn)生以供植物體正常生長所需，同時，TCA循環(huán)過程中產(chǎn)生的衍生物是氨基酸、次生代謝物等生物合成的底物，而磷酸戊糖途徑可以生成5-磷酸核糖與能量物質(zhì)NADPH，以供植物生長所需[22]。大多數(shù)與碳代謝相關(guān)的蛋白參與糖酵解，且多數(shù)在干旱脅迫下下調(diào)表達(dá)。而磷酸戊糖途徑相關(guān)蛋白(UDP-葡萄糖/GDP-甘露糖脫氫酶、轉(zhuǎn)酮醇酶、3-磷酸核糖異構(gòu)酶等)則在干旱處理24 h、48 h后上調(diào)表達(dá)，表明干旱脅迫下野生一粒小麥根中形成了新的代謝平衡，以減少能量消耗，增強(qiáng)能量形成，保證生長所需，與Liu等[13]的研究結(jié)果一致。

為了響應(yīng)干旱脅迫，植物體內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)會改變，ATP酶能幫助植物細(xì)胞維持其離子平衡。本研究發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫24h和48h后，有3個蛋白點(R53,R54,R55)豐度下調(diào)。Huseynova等[23]發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下2種小麥giymatli-2/17(干旱敏感)和azamatli-95(耐旱)的ATP合酶β亞基豐度下調(diào)。氨基酸代謝是植物體內(nèi)重要的代謝過程，且極易受干旱脅迫影響。本研究發(fā)現(xiàn)，根中大部分氨基酸代謝相關(guān)蛋白在干旱處理后下調(diào)表達(dá)，部分蛋白的豐度在干旱處理后上升，如谷氨酸脫羧酶(R65)，在γ-氨基丁酸(GABA)的代謝過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，對維持干旱脅迫下野生一粒小麥根中碳氮平衡具有重要作用[24]。

3.4解毒和防御相關(guān)蛋白

植物主要采用兩種機(jī)制來消除外界脅迫產(chǎn)生的有害物質(zhì)，一種是非酶抗氧化劑，包括抗壞血酸和谷胱甘肽，另一種是酶途徑，如超氧化物歧化酶、抗壞血酸過氧化物酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶[25]。本研究發(fā)現(xiàn)有9種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)(DEPS)與細(xì)胞防御相關(guān)，其中8種蛋白質(zhì)在干旱處理后24 h、48 h上調(diào)表達(dá)，只有1種蛋白質(zhì)下調(diào)表達(dá)，表明干旱脅迫導(dǎo)致野生一粒小麥根的抗氧化和防御能力提升，與干旱脅迫下野生一粒小麥葉片中抗氧化相關(guān)蛋白的變化模型一致[13]。

3.5蛋白質(zhì)的生物合成和代謝相關(guān)蛋白

本研究發(fā)現(xiàn)有3種差異蛋白質(zhì)參與了轉(zhuǎn)錄和翻譯，分別為雙鏈DNA結(jié)合蛋白Alba(R74),假定的核酸酶HARBI1-like(R75)，肌苷單磷酸脫氫酶(R76)。這3種蛋白的過度表達(dá)，反映了對核苷酸營養(yǎng)的更高需求，增強(qiáng)了干旱脅迫下小麥根系基因的轉(zhuǎn)錄活性[26]。

真核生物翻譯起始因子3(eIF3)的2個亞基(R72 和 R73)下調(diào)表達(dá)抑制了翻譯過程，因為eIF3幫助mRNA與40 S核糖體亞基結(jié)合，使eIF2-GTP-Met-tRNAiMet三元絡(luò)合物與40 S亞基更加穩(wěn)定，另外，它還在掃描和識別AUG起始密碼子中起作用[27]。因此，它的下調(diào)表達(dá)增加了野生一粒小麥根在干旱環(huán)境中錯誤蛋白質(zhì)的合成和折疊。

植物可以通過產(chǎn)生分子伴侶糾正錯誤折疊的蛋白質(zhì)。本試驗結(jié)果顯示，5個熱休克蛋白(R46,R47,R48,R49 和R51) 和1個TCP-1蛋白為重要的分子伴侶，它們在干旱脅迫時顯著下調(diào)。熱休克蛋白主要參與其他蛋白質(zhì)的折疊和展開，在植物遭受非生物逆境脅迫時一般含量增加，以重建正常的蛋白質(zhì)構(gòu)象和保持植物細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，如干旱脅迫下的普通小麥葉片[28]與水稻根[29]中，熱休克蛋白均上調(diào)表達(dá)。本試驗中所檢測的分子伴侶蛋白大部分下調(diào)表達(dá)，與前人的研究結(jié)果不一致，具體原因有待進(jìn)一步研究。

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收稿日期：2015-12-26修回日期：2016-03-23

基金項目：陜西省科技廳科技攻關(guān)項目(2013K01-16); 榆林市產(chǎn)學(xué)研項目(2014CXY-11-11)

通訊作者：劉永華(E-mail:liuyonghuaa@126.com)

中圖分類號：S512.1；S312

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-1041(2016)06-0721-07

Screening and Identification of the Proteins Related to Drought in Root ofT.boeoticum

LI Xianhua1,LIU Yonghua1,LIU Hui2,LIU Cuiying1

(1.College of Life Science,College of Yulin,Yulin,Shaanxi 719000,China; 2.Institute of Biotechnology,Guizhou Academy of Agricultural Sciences,Guiyang,Guizhou 550006,China)

Abstract:To uncover the regulation network of Triticum boeoticum under drought stress,a proteomic approach was applied to identify the proteins relative to drought response in root of Triticum boeoticum. About two-week old seedlings of Triticum boeoticum(at three leaves stage) were treated with 20%(w/v) PEG6000. Proteins in root were isolated through two dimensional electrophoresis and indentified by mass spectrum. Eighty-five differential expressed proteins(DEPs) with at least 1.5-fold change in abundance were detected on the 2-DE gels. These proteins were mainly associated with carbon metabolism(27%),amino acid metabolism(15%),detoxification and defense(11%),chaperones(8%),energy metabolism(8%),signal transduction(6%),protein metabolism(5%),lipid metabolism(4%),transcription and translation(4%),nucleotide metabolism(2%),and cytoskeleton and cytokinesis(1%). Further functional analysis revealed that signal sensing and transduction-associated proteins were greatly up-regulated in the root. Glycolysis was down-regulated but PPP pathway enhanced in the root,resulting in the occurrence of complex changes in energy metabolism.Protein metabolism was down-regulated in the root,as well as most of amino acid metabolism associated proteins. However,the intensity of glutamate decarboxylase and methionine synthase was increased after drought stress. These results would contribute to the existing knowledge on the complexity of root protein changes that occur in response to drought.

Key words:Drought stress; T.boeoticum; Proteomics; 2-DE

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-05-30

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160530.1535.010.html

第一作者E-mail:lxhua0321@126.com