湖北青磚茶對IBS-D模型大鼠腸道敏感性的影響

李世剛，鄭倩倩，何建剛，肖長義，柳蔚，王慧，3，劉錦程

湖北青磚茶對IBS-D模型大鼠腸道敏感性的影響

李世剛1，2，鄭倩倩2，何建剛1，肖長義1，2，柳蔚1，2，王慧1，3，劉錦程1

1. 湖北長盛川青磚茶研究所， 湖北 宜昌 443002；2. 三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002；3. 三峽大學(xué)生物工程與制藥工程學(xué)院，湖北 宜昌 443002

摘要：研究了湖北青磚茶對腹瀉型腸易激綜合征（IBS-D）模型大鼠腸道的影響。結(jié)果表明，與正常組相比，模型組的痛閾值明顯降低，血清中炎癥因子前列腺素 2（PGE2）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、類胰蛋白酶的含量明顯增加；與模型組比較，湖北青磚茶低劑量組、高劑量組能夠顯著升高痛閾值，而血清中炎癥因子 PGE2、TNF-α、類胰蛋白酶的含量顯著降低，且具有劑量依賴性。由此表明湖北青磚茶可降低IBS-D模型大鼠的腸道敏感性，其作用機制可能與血清中PGE2、TNF-α和類胰蛋白酶含量的降低有關(guān)。

關(guān)鍵詞：湖北青磚茶；IBS-D；腸道敏感性；結(jié)腸組織；炎癥因子

腸易激綜合征（Irritable bowel syndrome，IBS）是一種常見的功能紊亂性腸道疾病，腹部不適和排便習(xí)慣改變?yōu)槠渲饕卣鳎?］，其中，腹瀉型腸易激綜合征（IBS-D）較為常見。近年來，隨著對IBS-D的深入研究，發(fā)現(xiàn)大部分IBS-D患者具有腸道感覺高敏的病理特征。研究表明，炎癥因子如前列腺素 2 （PGE2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、類胰蛋白酶等表達(dá)水平的升高與腸道敏感性增強密切相關(guān)［2-4］。Powell等［5］發(fā)現(xiàn)茶葉對胃腸道功能具有顯著改善作用。本文就青磚茶進(jìn)行了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)湖北青磚茶能夠顯著抑制炎癥因子的產(chǎn)生且對IBS-D模型大鼠腸道高敏具有良好的改善作用。

本實驗采用冰醋酸誘導(dǎo)建立IBS-D大鼠模型［6］，然后，使用不同劑量的湖北青磚茶進(jìn)行干預(yù)，檢測其對IBS-D模型大鼠直腸擴張腹壁撤退反射（AWR）評分為 4分時的痛閾值、結(jié)腸形態(tài)學(xué)變化和血清中 PGE2、TNF-α、類胰蛋白酶的含量，探討青磚茶對IBS-D腸道敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

40只雌性SD大鼠，體質(zhì)量（250±20）g，SPF級，由湖北省實驗動物中心提供；青磚茶，由湖北省宜昌市鑫鼎生物科技有限公司提供，按照傳統(tǒng)方法水提，濃縮至粉末，臨用前配成相應(yīng)濃度的溶液；8F導(dǎo)尿管，購自浙江康康醫(yī)療器械有限公司；魚躍牌血壓計，購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；PGE2、TNF-α、類胰蛋白酶的 ELISA試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

將40只雌性SD大鼠隨機分為4組，每組10只，分為正常組、模型組、青磚茶總提物低劑量組（100 mg·kg-1）、青磚茶總提物高劑量組（200 mg·kg-1）。禁食24 h后，使用灌胃針經(jīng)肛門插入直腸約 5 cm處進(jìn)行灌注，正常組灌注雙蒸水，其他組則灌注 0.5%的冰醋酸，5 mL·kg-1，每天1次，灌注后使大鼠頭部朝下，肛門朝上，持續(xù) 20 s，連續(xù)造模 6 d。造模成功后，連續(xù) 3 d，正常組和模型組灌胃雙蒸水，用藥組灌胃相應(yīng)劑量的青磚茶提取物，10 mL·kg-1，每天 1次，末次給藥后 1 h，進(jìn)行腸道敏感性評估。實驗結(jié)束時，處死大鼠，眼球取血，取結(jié)腸組織。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 腸道敏感性評估

各組大鼠末次給藥后 1 h，采用國際通用的 AWR評分標(biāo)準(zhǔn)評估腸道敏感性。將大鼠固定，使其無法移動或轉(zhuǎn)身，將注射器與 8F導(dǎo)尿管相連后經(jīng)肛門插入，深度約 5 cm，用棉線將導(dǎo)尿管固定鼠尾根部。待其穩(wěn)定后，緩慢推注生理鹽水，引起導(dǎo)尿管頂端球囊擴張腸道，觀察引起大鼠背部拱起，AWR評分為 4分時的閾值。通過比較正常組、模型組及用藥組的痛閾值大小，進(jìn)而反應(yīng)出腸道敏感性強弱。重復(fù)進(jìn)行3次擴張，取均值。

1.3.2 結(jié)腸組織炎性因子表達(dá)水平的檢測

眼球取血后，血液靜置30 min，設(shè)定轉(zhuǎn)速3 500 r·min-1，離心 10 min，取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測各組血清中TNF-α、PGE2、類胰蛋白酶的含量。

1.3.3 結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)檢測

采集結(jié)腸組織，進(jìn)行結(jié)腸組織病理觀察和評價：進(jìn)行常規(guī)病理切片 HE染色，在顯微鏡下觀察結(jié)腸的病理形態(tài)學(xué)變化。

1.4 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)經(jīng) SPSS18.0軟件處理，實驗各個指標(biāo)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（±s），以單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行多組間差異比較，以 Dunnett-t檢驗進(jìn)行兩組間均數(shù)差異的比較，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1總提物對大鼠IBS腸道敏感性的影響

各組大鼠AWR評分為4分時的痛閾值比較見圖 1。從圖中可以看出，與正常組相比，模型組大鼠的痛閾值顯著下調(diào)（P＜0.05）。與模型組相比，湖北青磚茶提取物組的痛閾值發(fā)生上調(diào)，且高劑量組具有顯著性差異（P＜0.05）。

2.2 總提物對大鼠結(jié)腸組織的影響

各組大鼠結(jié)腸黏膜組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果見圖 2。顯微鏡下觀察，正常組、模型組及用藥組大鼠結(jié)腸黏膜組織結(jié)構(gòu)排列緊密、規(guī)則，無明顯損傷。

2.3 對大鼠血清中PGE2、TNF-α、類胰蛋白酶

含量的影響

各組大鼠血清中 PGE2、TNF-α、類胰蛋白酶含量檢測結(jié)果見圖 3。與正常組相比，模型組大鼠血清中 PGE2、TNF-α、類胰蛋白酶的含量明顯增加。與模型組相比，低、高劑量組青磚茶提取物均可降低血清中炎癥介質(zhì)PGE2、TNF-α和類胰蛋白酶的含量，且除低劑量組 TNF-α含量與模型組間無顯著差異外，其余各處理與模型組間均存在顯著差異。

圖1 湖北青磚茶總提物對大鼠IBS腸道敏感性的影響Fig. 1 Effects of Hubei Qingzhuan tea on intestinal sensitivity of IBS-D micey

圖2 湖北青磚茶總提物對大鼠結(jié)腸組織的影響Fig. 2 Effects of Hubei Qingzhuan tea total extract on colonic tissue of mice

圖3 湖北青磚茶總提物對各組大鼠血清中PGE2、TNF-α、類胰蛋白酶含量的影響Fig. 3 Effects of Hubei Qingzhuan tea total extract on the serum PGE2， TNF alpha， tryptase contents of mice in each group

3 小結(jié)與討論

IBS是一種常見的胃腸功能紊亂性疾病，其患病率逐年上升，已嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。目前認(rèn)為，腸道高敏是引起IBS-D的一種重要病理特征，而IBS-D的病因與發(fā)病機制尚不明確。許多研究表明，炎癥介質(zhì)如PGE2、TNF-α、類胰蛋白酶等通過調(diào)控腸黏膜神經(jīng)系統(tǒng)，引起痛閾值降低，導(dǎo)致腸道高敏。PGE2是由花生四烯酸產(chǎn)生的一種生物活性脂質(zhì)，它在炎癥和結(jié)腸癌中起到非常重要的調(diào)節(jié)作用［7］。Nakanishi等［2］研究報道，IBS-D患者黏膜促炎因子 PGE2的含量與疼痛程度緊密相關(guān)。TNF-α作為一種促炎癥因子，對自發(fā)性疼痛與痛覺超敏具有潛在的調(diào)節(jié)作用［3］。促炎介質(zhì)類胰蛋白酶主要通過激活細(xì)胞表面蛋白酶激活受體（PAR-2），持續(xù)興奮傷害神經(jīng)元發(fā)揮致敏作用，隨著體內(nèi)類胰蛋白酶含量的增加，造成腸道敏感性增強，導(dǎo)致IBS-D癥狀反復(fù)發(fā)生［4，8］。

本實驗結(jié)果顯示，結(jié)腸組織形態(tài)無異常病變，可以排除化學(xué)刺激對結(jié)腸黏膜組織可能造成的損傷，同時也證實IBS-D大鼠模型模擬了IBS-D具有慢性功能性腸道疾病的特征；各組大鼠產(chǎn)生同一行為反應(yīng)時，模型組所需要的刺激強度最小，即模型組大鼠的痛閾值最低，腸道最為敏感，而湖北青磚茶提取物低、高劑量組的痛閾值較模型組高，即低、高劑量組大鼠的腸道敏感性低。研究發(fā)現(xiàn)，模型組血清中炎癥因子 PGE2、TNF-α、類胰蛋白酶含量上調(diào)，可能使腸道敏感性增強。而青磚茶提取物可以抑制這3種炎癥因子含量的上調(diào)。

綜上所述，湖北青磚茶可抑制IBS-D模型大鼠的腸道敏感性，其機制可能與血清中炎癥因子含量的降低有關(guān)，確切作用機制有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

［1]Thompson W， Longstreth G， Drossman D， et al. Functional bowel disorders and functional abdominal pain ［J］. Gut，1999， 45（3）: II43-II47.

［2]Nakanishi M， Menoret A， Tanaka T， et al. Selective PGE（2）suppression inhibits colon carcinogenesis and modifies local mucosal immunity ［J］. Cancer Prevention Research， 2011，4（8）: 1198-1208.

［3]Veek P P J V D， Marlies V D B， Kroon Y E D， et al. Role of tumor necrosis factor-α and interleukin-10 gene polymorphisms in irritable bowel syndrome ［J］. American Journal of Gastroenterology， 2005， 100（11）: 2510-2516.

［4]郭朝書， 王承黨. 肥大細(xì)胞及類胰蛋白酶在腸易激綜合征內(nèi)臟敏感性中的作用［J］. 國際消化病雜志， 2010， 30（1）: 4-5.

［5]Georgiades P， Pudney P D， Rogers S， et al. Tea derived galloylated polyphenols cross-link purified gastrointestinal mucins ［J］. Plos One， 2014， 9（8）: 1-11.

［6]Minaiyan M， Ghannadi A， Mahzouni P， et al. Comparative study of berberis vulgaris fruit extract and berberine chloride effects on acetic acid-induced colitis in rats ［J］. Iranian Journal of Pharmaceutical Research Ijpr， 2011， 10（1）: 97-104.

［7]Masako Nakanishi， Antoine Menoret， Takuji Tanaka， et al. Selective PGE2 suppression colon carcinogenesis and modifies local mucosal immunity ［J］. Cancer Prevention Research， 2011， 4（8）: 1198-1208.

［8]胡敏鸝， 華宏軍， 楊小云， 等. IBS-D患者直腸乙狀結(jié)腸交界黏膜MC活化及類胰蛋白酶的變化及作用研究［J］. 中國現(xiàn)代醫(yī)生， 2015， 53（24）: 1-4.

中圖分類號：S571.1；O614.23+1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-369X（2016）03-245-05

收稿日期：2015-12-21

修訂日期：2016-01-28

作者簡介：李世剛，男，博士，副教授，主要從事中藥藥效與新藥研究。E-mail: fox201@163.com

The Effects of Hubei Qingzhuan Tea on Intestinal Sensitivity in IBS-D Mouse Model

LI Shigang1，2， ZHENG Qianqian2， HE Jiangang1， XIAO Changyi1，2，LIU Wei1，2， WANG Hui1，3， LIU Jincheng1
1. Long Cheng Chuan Qingzhuan Tea Research Institute of Hubei Province， Yichang 443002， China；2. Medical College of China Three Gorges University， Yichang 443002， China；3. Biotechnology and Pharmaceutical Engineering College of China Three Gorges University， Yichang 443002， China

Abstract:The effects of Hubei Qingzhuan tea on intestinal sensitivity in IBS-D mouse model were investigated. The results showed， compared with the normal group， the control group had a significant reduction in the pain threshold， and marked increase in the serum level of inflammatory cytokines PGE2， TNF-alpha， tryptase. Compared with the control group， both the low and high dose of Qingzhuan tea significantly increased the pain threshold and markedly decreased the serum level of inflammatory cytokines PGE2， TNF-alpha， tryptase by a dose dependent manner. It is concluded that Qingzhuan tea could significantly decrease the intestinal sensitivity of IBS-D mice，which might be related to the inhibition of serum PGE2， TNF-alpha and tryptase levels.

Keywords:Hubei Qingzhuan tea， IBS-D， visceral sensitivity， colon tissue， inflammatory cytokines