青霉胞外合成銀納米粒子及其表征

徐秋紅，黃梅穎，馮家勛，杜良偉

(1.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院， 廣西南寧530004；2.廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣西南寧530004；3.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 廣西南寧530004)

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青霉胞外合成銀納米粒子及其表征

徐秋紅1, 2，黃梅穎1, 2，馮家勛2, 3，杜良偉1, 2

(1.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院， 廣西南寧530004；2.廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣西南寧530004；3.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 廣西南寧530004)

摘要：為了尋求綠色高效的納米粒子合成方法，在模擬太陽(yáng)光的照射下，利用青霉濾液快速胞外合成了銀納米粒子。用肉眼觀察、紫外—可見(jiàn)吸收光譜、X射線衍射(XRD)和透射電鏡(TEM)對(duì)合成的銀納米粒子進(jìn)行表征。XRD結(jié)果表明合成了優(yōu)先沿著(111)面生長(zhǎng)的晶體結(jié)構(gòu)的銀納米粒子。TEM結(jié)果表明，大部分納米粒子以團(tuán)聚的狀態(tài)分散在溶液中，單個(gè)納米粒子的形貌呈球形，平均粒徑約為6 nm，團(tuán)聚物的形狀不規(guī)則，其粒徑在20～50 nm。該合成方法具有條件溫和、清潔、無(wú)毒、無(wú)污染的特點(diǎn)，是一種綠色化學(xué)和環(huán)境友好的合成方法。

關(guān)鍵詞：青霉；生物合成；銀納米粒子；光照

金屬納米粒子因其獨(dú)特的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性，被應(yīng)用于催化、生物傳感器、藥物載體和抗菌藥物等領(lǐng)域中，其廣闊的應(yīng)用前景已經(jīng)引起了人們廣泛的關(guān)注。發(fā)展無(wú)毒、生物相容和環(huán)境友好的方法來(lái)合成金屬納米粒子越來(lái)越重要。微生物合成金屬納米材料是一個(gè)新興的具有廣闊發(fā)展前景的研究領(lǐng)域。

許多微生物能夠合成納米材料，這些微生物被認(rèn)為是環(huán)境友好型的“納米工廠”。1999年，Klaus等[1]首次報(bào)道了使用施氏假單胞菌還原制備銀納米粒子，開(kāi)辟了制備納米材料的微生物合成法，此后，細(xì)菌合成納米粒子受到了較多的重視[2]。為了打破這種傳統(tǒng)，印度的國(guó)家化學(xué)實(shí)驗(yàn)室嘗試用真核生物代替原核生物合成納米粒子，經(jīng)過(guò)兩年的努力，在200多種屬的真菌中發(fā)現(xiàn)了輪枝菌和尖孢鐮刀菌可以合成納米粒子[3-4]。與細(xì)菌相比，真菌因培養(yǎng)條件溫和、胞外分泌物多和容易進(jìn)行下游處理等特點(diǎn)而被視為是更高效地合成納米粒子的資源。

早期微生物合成納米粒子的位點(diǎn)主要是在胞內(nèi)，然而，從分析和應(yīng)用的角度來(lái)說(shuō)，胞內(nèi)合成的納米粒子需通過(guò)超聲波破碎法[5]、去垢劑破碎法[6]或者加入細(xì)胞裂解液[7]等方法使納米粒子從細(xì)胞中釋放出來(lái)，這個(gè)過(guò)程復(fù)雜繁瑣且耗費(fèi)時(shí)間，因此，在溶液中進(jìn)行胞外合成比胞內(nèi)合成更實(shí)際可行。在胞外合成中，目前采用較多的是將菌體在無(wú)菌水中培養(yǎng)后收集到的濾液與前驅(qū)體離子反應(yīng)生成納米粒子。由于胞外分泌的濾液比較純凈，該合成方法更有利于研究納米粒子的合成。

目前已經(jīng)有許多微生物被用來(lái)合成銀納米粒子，但大多數(shù)的合成效率比較低，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)[8-9]。最近，文獻(xiàn)[10-11]報(bào)道，光能夠有效地促進(jìn)銀納米粒子的合成，而且能縮短合成時(shí)間。為此，本研究在模擬太陽(yáng)光照射的條件下，用真菌青霉1-208的濾液胞外合成銀納米粒子，并對(duì)合成的納米粒子進(jìn)行表征，旨在利用可再生的微生物資源快速合成納米粒子。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1實(shí)驗(yàn)試劑

硝酸銀(AgNO3)(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)；胰蛋白胨(北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司)；KH2PO4、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、HCl、可溶性淀粉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；CaCl2(生工生物工程有限公司)；FeSO4·7H2O(廣東汕頭新寧化工廠)。所有試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水，另有違規(guī)除外。

AgNO3儲(chǔ)備液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的AgNO3固體，用去離子水溶解并定容，配制成100 mmol/L的AgNO3溶液，用錫紙包裹避光于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要儀器

紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)(PerkinElmer Lambda 35，美國(guó))；透射電子顯微鏡(Hitachi H-500，日本)；X射線衍射儀(Rigaku D/MAX，日本)；光化學(xué)反應(yīng)儀(德洋意邦，中國(guó)上海)；往復(fù)式恒溫?fù)u床(Thermo Fisher，美國(guó))；GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；冷凍離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1青霉的培養(yǎng)

青霉1-208來(lái)自于亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，將保存在PDA平板上的青霉1-208接種于250 mL的可溶性淀粉培養(yǎng)基[12]中，在28 ℃，180 r/min的往復(fù)式恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3 d。

1.3.2細(xì)胞濾液的獲取

將培養(yǎng)3 d后的菌液用4層無(wú)菌紗布進(jìn)行過(guò)濾，并用足夠的無(wú)菌去離子水進(jìn)行沖洗，除掉培養(yǎng)基的成分，以免殘余成分對(duì)Ag+離子的還原產(chǎn)生影響。得到2 g新鮮濕重的菌體，向其中加入20 mL無(wú)菌去離子水，搖晃均勻，在28 ℃，180 r/min的條件下培養(yǎng)3 d后，6 000 r/min離心5 min，收集上清液。

1.3.3銀納米粒子的合成

在攪拌下將100 mL AgNO3溶液逐滴地加入到10 mL的細(xì)胞濾液中,使AgNO3的最終濃度為1 mmol/L。銀納米粒子合成反應(yīng)是在光輻射的條件下進(jìn)行，用氙燈(500 W)模擬自然界中的太陽(yáng)光。把同樣的反應(yīng)溶液置于黑暗處做對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.4納米粒子的表征方法

1.4.1紫外—可見(jiàn)吸收光譜

在不同的反應(yīng)時(shí)間取反應(yīng)溶液，將其用去離子水稀釋兩倍后注入石英比色皿中，以去離子水為參比，在200～900 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，用紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，觀察反應(yīng)過(guò)程中溶液吸收光譜的變化。

1.4.2X射線衍射

將反應(yīng)30 min后的納米銀溶液滴到潔凈的單晶硅片上，待溶液自然晾干后，以CuKα為輻射源，在40 kV電壓和30 mA電流下，在35～90°范圍內(nèi)以10°/min的速度掃描，進(jìn)行XRD分析。

1.4.3透射電鏡

用移液槍吸取少量反應(yīng)30 min后的溶液滴在稱(chēng)量紙上，呈液滴狀。用鑷子夾住銅網(wǎng)，使銅網(wǎng)浸入液滴，大約30 s后，用鑷子將銅網(wǎng)取下，讓銅網(wǎng)在空氣中自然晾干，在加速電壓120 kV下對(duì)樣品進(jìn)行TEM觀察。

2結(jié)果與討論

2.1肉眼觀察

為了合成銀納米粒子，在攪拌下將AgNO3溶液滴加到細(xì)胞濾液中，合成反應(yīng)是在500 W氙燈的照射下進(jìn)行。加入AgNO3溶液后，反應(yīng)溶液立即出現(xiàn)輕微渾濁，我們推斷細(xì)胞濾液中可能含有某些陰離子，容易與Ag+離子形成不溶鹽；反應(yīng)2 min后，溶液呈現(xiàn)微紅色；隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，溶液顏色逐漸加深至透明的紅褐色。圖1是濾液反應(yīng)前后的顏色對(duì)比圖，圖1(a)是細(xì)胞濾液的顏色，呈淡黃色；反應(yīng)30 min之后溶液顏色從淺黃色轉(zhuǎn)變?yōu)槌吻宓募t褐色(圖1(b))。紅褐色是銀納米粒子的特征顏色[13]。由于AgNO3溶液和細(xì)胞濾液顏色均很淺，根據(jù)顏色的變化初步斷定溶液中形成了銀納米粒子。相比以前報(bào)道的胞外生物合成銀納米粒子需幾小時(shí)，甚至是幾天[4]，本研究反應(yīng)所需的時(shí)間顯著縮短。將同樣的反應(yīng)溶液置于黑暗中進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同的時(shí)間內(nèi)，反應(yīng)溶液的顏色沒(méi)有任何變化，即沒(méi)有銀納米粒子的生成。由此推斷光在銀納米粒子的合成中起了關(guān)鍵作用。

(a) 細(xì)胞濾液顏色

(b) 與AgNO3溶液反應(yīng)后的顏色

圖1青霉1-208的細(xì)胞濾液反應(yīng)前后的顏色

Fig.1The colors of cell filtrate fromPenicilliumsp.1-208 before and after reaction with AgNO3solution

2.2紫外—可見(jiàn)吸收光譜表征

圖2展示了銀納米粒子合成過(guò)程中反應(yīng)溶液隨著時(shí)間變化的紫外—可見(jiàn)吸收光譜圖。從曲線1中可以看出，青霉1-208的細(xì)胞濾液在300～800 nm范圍內(nèi)沒(méi)有吸收峰。而AgNO3溶液與細(xì)胞濾液反應(yīng)10 min后，在400～430 nm出現(xiàn)了1個(gè)明顯的吸收峰(曲線4)。已有文獻(xiàn)證實(shí)銀納米粒子的特征峰即表面等離子共振(SPR)峰出現(xiàn)在這個(gè)區(qū)域[14-15]，說(shuō)明反應(yīng)溶液中生成了銀納米粒子。接著隨時(shí)間的增加，SPR峰逐漸升高，說(shuō)明反應(yīng)溶液中銀納米粒子的量也逐漸增加[16]。圖3反映了SPR峰的吸光度隨時(shí)間變化的關(guān)系圖。吸光度在反應(yīng)初期顯著增加，隨后緩慢上升，這表明在該反應(yīng)過(guò)程中前期反應(yīng)速度非?？?，后期相對(duì)緩慢，當(dāng)反應(yīng)到120 min時(shí)，吸光度不再增加，表明反應(yīng)基本完成。

曲線1對(duì)應(yīng)細(xì)胞濾液的吸收光譜，曲線2～13分別對(duì)應(yīng)2、5、10、15、20、30、40、60、80、100、120、140 min時(shí)反應(yīng)溶液的吸收光譜

圖2反應(yīng)溶液在銀納米粒子合成過(guò)程中吸收光譜隨時(shí)間的變化

Fig.2The absorption spectra of reactionsolution as a function of reaction time

圖3細(xì)胞濾液與AgNO3溶液反應(yīng)過(guò)程中吸光度隨時(shí)間的變化

Fig.3The absorbance changes against reactiontime during the cell filtrate interactingwith AgNO3solution

2.3XRD表征

圖中標(biāo)記的峰是元素銀的特征衍射峰圖4　合成的銀納米粒子的XRD圖譜Fig.4　XRD pattern of the synthesized AgNPs

為進(jìn)一步研究銀納米粒子的結(jié)構(gòu)特性，將反應(yīng)30 min后得到的銀納米粒子做XRD表征，結(jié)果如圖4所示。在銀納米粒子的XRD圖譜中，在38.1°和44.3°處的衍射峰分別對(duì)應(yīng)于面心立方(fcc)銀晶體的Bragg衍射峰(111)和(200)，這與大塊的具有面心立方結(jié)構(gòu)銀的特征相一致，證實(shí)生成了銀納米晶體[17-18]。該樣品中銀顆粒所產(chǎn)生的衍射峰相對(duì)較寬，表明樣品中所形成的銀顆粒粒徑較小。值得注意的是，(111)衍射峰的強(qiáng)度遠(yuǎn)高于(200)的衍射峰，這表明銀納米粒子優(yōu)先沿著(111)面的方向生長(zhǎng)[19]。同時(shí)，在46.2°、54.8°和57.4°處的衍射峰分別對(duì)應(yīng)于氯化銀的Bragg衍射峰(220)、(311)和(222)[20]，說(shuō)明在反應(yīng)過(guò)程中生成了氯化銀。由此推斷反應(yīng)初期出現(xiàn)的輕微渾濁可能是因?yàn)樯闪松倭康穆然y。

2.4TEM表征

TEM表征可以得到納米粒子的形貌、粒徑大小和分散情況的信息[21-22]。將反應(yīng)30 min后所得的銀納米粒子進(jìn)行TEM表征。圖5是具有代表性的銀納米粒子的電鏡圖。由圖5(a)中可以觀察到溶液中分布著大量的銀納米粒子，但納米粒子有明顯的團(tuán)聚，呈不規(guī)則的形狀，團(tuán)聚物的直徑約在20～50 nm，其中還有粒徑極小的納米粒子分散在溶液中。在放大倍數(shù)更高的情況下(圖5(b))，可以看到團(tuán)聚物是由球形或近似球形的單個(gè)納米粒子組成的。根據(jù)TEM圖對(duì)單個(gè)納米粒子進(jìn)行粒徑統(tǒng)計(jì)分析，為了確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，所統(tǒng)計(jì)的納米粒子的數(shù)目在200個(gè)以上，結(jié)果表明，合成的銀納米粒子的粒徑主要分布在3～12 nm，平均粒徑約為6 nm。

(a) 80 000放大倍數(shù)TEM圖

(b) 600 000放大倍數(shù)TEM圖

圖5胞外合成的銀納米粒子在不同放大倍數(shù)下的透射電鏡圖

Fig.5TEM images of the AgNPs at different magnifications

圖6　從TEM圖像中獲得的顆粒尺寸分布圖

3結(jié)語(yǔ)

本文在氙燈模擬太陽(yáng)光的照射下，利用青霉1-208的胞外濾液快速合成銀納米粒子，并對(duì)合成的產(chǎn)物進(jìn)行肉眼觀察、紫外—可見(jiàn)吸收光譜、XRD和TEM表征。結(jié)果表明，銀納米粒子是面心立方的晶體結(jié)構(gòu)，并且優(yōu)先沿著(111)面的方向生長(zhǎng)；部分合成的銀納米粒子以團(tuán)聚物的形式分散在溶液中，團(tuán)聚物的直徑約在20～50 nm，其中，還有粒徑極小的納米粒子分散在溶液中，單個(gè)納米粒子的粒徑主要分布在3～12 nm，平均粒徑約為6 nm。在整個(gè)反應(yīng)體系中，沒(méi)有加入額外的化學(xué)試劑和保護(hù)劑，合成條件溫和、無(wú)毒、無(wú)污染，反應(yīng)速度快，說(shuō)明該合成方法是一種綠色化學(xué)和環(huán)境友好的合成方法。

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(責(zé)任編輯張曉云裴潤(rùn)梅)

收稿日期：2015-11-30；

修訂日期：2016-04-15

基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012GXNSFGA060005，2013GXNSFBA019098)

通訊作者：杜良偉(198l—)，女，河南南陽(yáng)人，廣西大學(xué)副教授；E-mail：dulily@gxu.edu.cn。

doi:10.13624/j.cnki.issn.1001-7445.2016.0857

中圖分類(lèi)號(hào)：TB383

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-7445(2016)03-0857-06

Biosynthesis and characterization of extracellular silver nanonparticles assisted by Penicillium sp.

XU Qiu-hong1, 2, HUANG Mei-ying1, 2, FENG Jia-xun2, 3, DU Liang-wei1, 2

(1.School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China;2.State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources,Guangxi University, Nanning 530004, China;3.College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China)

Abstract:In order to explore green and efficient methods for the synthesis of nanoparticles, extracellular silver nanoparticles (AgNPs) were rapidly synthesized assisted by the cell filtrates of Penicillium sp. 1-208 under simulated sunlight. The synthesized AgNPs were characterized by means of visual observation, UV-Vis absorption spectroscopy, X-ray diffraction (XRD) and transmission electron microscopy (TEM). The XRD results showed that the synthesized AgNPs were crystalline in nature and preferentially oriented in (111) plane. The TEM results showed that most of the nanoparticles dispersed in solution in the form of agglomerated structure, in which the single nanoparticles were spherical in shape with average particle size of 6 nm and the diameter of agglomerated structure with irregular shape ranged from 20 to 50 nm. The approach used in this study is a green and environment-friendly synthesis method with the advantage of mild condition, clean, non-toxicity and non-polluting.

Key words:Penicillium sp.; biosynthesis; silver nanoparticles; light radiation

引文格式： 徐秋紅，黃梅穎，馮家勛，等.青霉胞外合成銀納米粒子及其表征[J].廣西大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2016，41(3)：857-862.