烤煙煙葉淀粉晶體結(jié)構(gòu)的光譜分析

朱曉蘭，徐迎波，周順，高蕓

（1.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)煙草與健康研究中心，安徽 合肥230052；2.安徽中煙工業(yè)公司技術(shù)中心，安徽 合肥230088）

烤煙煙葉淀粉晶體結(jié)構(gòu)的光譜分析

朱曉蘭1，徐迎波2，周順2，高蕓1

（1.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)煙草與健康研究中心，安徽 合肥230052；2.安徽中煙工業(yè)公司技術(shù)中心，安徽 合肥230088）

摘 要：利用固體核磁共振波譜儀（CP/MAS13C NMR）、粉末X-射線衍射儀（XRD）和掃描電子顯微鏡（SEC）研究了烤煙煙葉淀粉晶體的結(jié)構(gòu)特性。結(jié)果表明：烤煙煙葉淀粉晶體CP/MAS13C NMR波譜顯示在C1區(qū)域，在化學(xué)位移99.3和100.2處有2個明顯的結(jié)晶峰，同時，XRD波譜2θ在17 o處有較強的衍射峰，在5.6o、15o、20o、22o 和24o附近有較弱的衍射峰，均表現(xiàn)出典型的B-型晶體特征。根據(jù)CP/MAS13C NMR波譜計算出的煙葉淀粉晶體的相對結(jié)晶度和雙螺旋含量分別為36.1%和21.3%，其結(jié)晶度比采用XRD波譜計算值略高。

關(guān) 鍵 詞：烤煙；淀粉晶體；固體核磁共振波譜；結(jié)晶度

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植物淀粉顆粒分為直鏈淀粉（Am）和支鏈淀粉（Ap）2種類型。直鏈淀粉和支鏈淀粉中的支鏈部分形成了雙螺旋結(jié)構(gòu)，這些雙螺旋分子鏈通過分子間的相互作用力以一定的空間點陣在淀粉顆粒的某些區(qū)域形成不同的晶體結(jié)構(gòu)。雙螺旋結(jié)構(gòu)形成致密的結(jié)晶區(qū)，直鏈淀粉分子以松散的結(jié)構(gòu)形成無定形區(qū)。支鏈淀粉分子的聚合度和平均鏈長影響淀粉的結(jié)晶和晶體形式，與淀粉晶體類型密切相關(guān)。依據(jù)鏈長的不同，淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)分為A-型、B-型和C-型3種類型［1］。

烤煙中淀粉含量的高低對煙葉和卷煙品質(zhì)都有重要的影響［2］。鄧云龍等［3］研究了品質(zhì)、部位和成熟度對煙葉淀粉含量及評吸質(zhì)量的影響。王懷珠等［4］研究認為，烘烤過程中外加淀粉酶可有效降低烤煙中的淀粉含量。宮長榮等［5］研究了烘烤過程中變黃期溫度、時間對烤煙淀粉代謝的影響。這些研究主要側(cè)重于淀粉含量的分析和淀粉降解過程中其含量對煙草品質(zhì)的影響，很少涉及煙草中淀粉的

1 材料與方法

1.1 材料和主要儀器設(shè)備

直鏈淀粉（純度99.5%）和支鏈淀粉（純度95.5%）購自上海百靈威化學(xué)品公司。K326煙葉取自安徽中煙工業(yè)公司皖南煙葉基地，采摘成熟的青煙樣品，去除泥沙和主脈，一部分用于提取淀粉，另一部分同時測定煙葉中的水分。所有淀粉樣品在-20℃保存?zhèn)溆?，分析測試前置于恒溫恒濕機（25 ℃，相對濕度80%）平衡48 h。

主要儀器：AVANCE AV 400超導(dǎo)傅立葉數(shù)字化核磁共振譜儀（瑞士布魯克公司出品）；TTR-Ⅲ型18KW樣品水平型大功率X射線粉末衍射儀（日本瑪珂公司出品）；JSM-6700F型掃描電子顯微鏡（日本JEOL公司出品）。

1.2 方法

1.2.1 煙草淀粉的提取和分離

鮮煙葉樣品淀粉依照文獻［12］方法提取，無定形淀粉取直鏈淀粉樣品依照文獻［1］方法制備。

1.2.2 淀粉晶體的光譜測試

CP/MAS13C NMR光譜測試條件：場強9.40 T，7 mm魔角探頭，轉(zhuǎn)速15 kHz，脈沖寬度90°，交叉極化時間4 μs，接觸時間2 ms，采樣時間34 ms，采樣間隔時間2.0 s，掃描次數(shù)1 024，譜寬300，一級定標(biāo)用四甲基硅烷（CH3）4Si。CP/MAS13C NMR光譜化學(xué)位移、光譜峰面積及分解峰形擬合的計算采用MestReNova 6.1.1核磁軟件進行分析，淀粉分子中雙螺旋含量（有序部分）根據(jù)Atichokudomchai的方法［13］計算，相對結(jié)晶度的計算根據(jù)Paris的方法［14］計算。

XRD分析測試條件：淀粉樣品過孔徑 45 μm篩，采用乙醇涂片法制作試片，安放在玻璃樣品架上。Ni濾波，Cu靶Kα射線，管壓 40 kV，管電流200 mA，掃描速度2o/min，2θ掃描范圍3o～50o，波長0.154 184 1 nm。利用Origin軟件獲得XRD波譜圖，按照文獻［15］方法求相對結(jié)晶度。

SEC分析：淀粉標(biāo)樣和樣品按照常規(guī)方法，先進行噴金處理，再放入掃描顯微樣品室進行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草淀粉晶體的CP/MAS13C NMR光譜

煙草淀粉樣品和直鏈淀粉標(biāo)樣、支鏈淀粉標(biāo)樣、無定型淀粉樣品的CP/MAS13C NMR光譜如圖1所示。圖1-a為煙草淀粉樣品NMR光譜光譜吸收所對應(yīng)的化學(xué)位移歸屬圖。在化學(xué)位移100處附近對應(yīng)的為淀粉六元吡喃糖元中C1區(qū)域，有多重吸收峰，其中在化學(xué)位移102附近的寬峰是葡萄糖C1區(qū)域的無定形峰，與直鏈淀粉含量有關(guān)，另外的吸收峰為結(jié)晶結(jié)構(gòu)［14］，明顯可見直鏈淀粉的結(jié)晶結(jié)構(gòu)吸收明顯比支鏈淀粉弱。在化學(xué)位移 82處附近的寬峰為C4區(qū)域無定形結(jié)構(gòu)的吸收峰，其中無定形淀粉中此處吸收峰最強。在化學(xué)位移 68～76區(qū)域重疊的為C-2，3，5吸收峰。在化學(xué)位移61處為淀粉六元吡喃糖元中C6區(qū)域，吸收峰的位置穩(wěn)定，峰形對稱性較好，其峰面積與淀粉的存在量呈良好的線性關(guān)系，可實現(xiàn)煙草樣品中淀粉的定量固態(tài)分析。

圖1 煙草淀粉晶體的CP/MAS13C NMR光譜Fig.1 CP/MAS13C NMR spectra of starch sample extracted from tobacco

CP／MAS13C NMR光譜可見淀粉的NMR圖譜均有4個主要的波譜峰區(qū)域，分別為C1、C4、C2，3，5和C6區(qū)域，不同類型淀粉的主要區(qū)別在C1區(qū)域。A-型淀粉在C1區(qū)域處有3個典型的結(jié)晶峰［16］，在化學(xué)位移 102.2處有一弱的肩峰（無定形峰）；煙草淀粉在化學(xué)位移100.2和99.3處有2個典型的結(jié)晶峰，在化學(xué)位移102.5處有一無定形峰，具有B-型淀粉的典型特征［1］，因此，確定煙草淀粉屬于B-型淀粉結(jié)構(gòu)。

由NMR光譜化學(xué)位移、光譜峰面積及分解峰形擬合的峰面積，計算出的不同淀粉樣品的結(jié)構(gòu)信息（無定形淀粉比例、相對雙螺旋含量及相對結(jié)晶度）列于表1。以無定形淀粉為基準(zhǔn)，煙草淀粉和直鏈淀粉中無定形比例高于支鏈淀粉，其相對雙螺旋含量比例低于支鏈淀粉，相對結(jié)晶度也表現(xiàn)出類似的規(guī)律，支鏈淀粉的相對結(jié)晶度略高，為46.8%。

表1 由NMR光譜計算的不同來源的淀粉晶體的結(jié)構(gòu)信息Table 1 The structure information for starch sample from different sources by NMR data

2.2 煙草淀粉晶體的XRD光譜

淀粉標(biāo)樣（直鏈淀粉、支鏈淀粉和無定形淀粉）和煙草淀粉樣品的XRD波譜如圖2所示。支鏈淀粉在14.9o、17.0o、17.9o和22.9o附近有強的衍射峰，其中l(wèi)7o和17.9o附近的衍射峰為相連的雙峰，這是A-型晶體淀粉的XRD波譜特征，與文獻報道的禾谷類作物種子淀粉的波譜［17］相同。無定形淀粉在這些區(qū)域的衍射峰強度很弱。直鏈淀粉僅在 17.0o附近有一較強的衍射峰，在5.6o、22.0o和24.0o附近有較弱的衍射峰，具有B-型晶體淀粉的XRD波譜特征，但強度弱。煙草淀粉樣品的XRD波譜顯示在5.6o附近有B-型晶體淀粉的典型吸收峰，在17.0o處有一較強的衍射峰，在22.0o和24.0o附近有中等強度的衍射峰，因此，煙草淀粉屬于B-型晶體淀粉，與NMR分析結(jié)果相一致。按照XRD光譜也可計算出不同來源的淀粉樣品的相對結(jié)晶度 （表1），幾種樣品中支鏈淀粉的相對結(jié)晶度略高（＞30%），對比由NMR數(shù)據(jù)計算的相對結(jié)晶度，二者在趨勢上有明顯的一致性，但由于XRD計算的相對結(jié)晶度略低于 NMR數(shù)據(jù)計算的，這一點與文獻［13］相一致。與XRD相比，13C NMR 波譜測定的是大分子的短程有序，而長程有序才能被XRD測定；部分短程有序能被13C NMR測定，而XRD不能測定，因此，XRD測定的結(jié)晶度比13C NMR低［17］。由2種方法測定的不同來源的淀粉標(biāo)樣和樣品的2組數(shù)據(jù)具有明顯的相關(guān)性，其線性關(guān)系為y = 8.981 6 + 1.206 67x，其中x為由XRD數(shù)據(jù)計算的相對結(jié)晶度，y為由NMR數(shù)據(jù)計算的相對結(jié)晶度，二者之間的相關(guān)系數(shù)為0.985 9。

圖2煙草淀粉晶體的XRD波譜Fig.2 XRD spectra of starch samples from tobacco

2.3 煙葉淀粉SEC光譜分析

圖3為SEC觀察不同淀粉樣品的圖片，3種標(biāo)樣和煙草淀粉具有明顯不同的形狀特征、大小和微觀形貌：直鏈淀粉表面呈絮狀，顆粒界限不明；支鏈淀粉顆粒表面光滑，主要為圓柱狀和圓球形，其中個別呈現(xiàn)不規(guī)則形狀；無定形淀粉呈現(xiàn)明顯的分布不均的塊狀，屬于磨碎的表面；煙葉淀粉呈單粒狀，形狀與支鏈淀粉顆粒類似，表面光滑，主要為圓球形和長圓柱狀，且部分淀粉顆粒表面均存在明顯的內(nèi)陷凹槽。另外，煙草淀粉粒徑明顯較小，主要集中在3～4 μm，與塊莖和谷物類淀粉［17］相比，煙草淀粉粒是煙草葉片產(chǎn)生的瞬時淀粉粒。

圖3 煙草淀粉晶體掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果Fig.3 SEC spectra of different starch samples

3 結(jié)論與討論

淀粉是由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成的半晶體結(jié)構(gòu)，其中支鏈淀粉和直鏈淀粉的比例及支鏈淀粉的晶體結(jié)構(gòu)決定淀粉的特性［17］，進而影響煙葉的外觀質(zhì)量和內(nèi)在品質(zhì)。CP/MAS13C NMR波譜顯示煙草淀粉在C1區(qū)域化學(xué)位移100.2和99.3處有2個典型的淀粉結(jié)晶峰，屬于B-型淀粉結(jié)構(gòu)。NMR波譜定量研究淀粉的結(jié)晶度和雙螺旋含量結(jié)果表明，煙草淀粉中無定形比例較高，其相對雙螺旋含量比例和相對結(jié)晶度分別為21.3%和36.1%。XRD波譜也顯示煙草淀粉在5.6o附近有B-型晶體淀粉的典型吸收峰，在17.0o處衍射峰最強，在22.0o和24.0o附近有中等強度的衍射峰。由XRD波譜和CP/MAS13C NMR波譜計算出的相對結(jié)晶度具有顯著的相關(guān)性（R=0.985 9）。煙葉淀粉顆粒以圓球形和圓柱形為主，粒徑約3～4 μm。

淀粉在煙葉烘烤過程中發(fā)生急劇變化，淀粉的分解和轉(zhuǎn)化對烤后煙葉內(nèi)部化學(xué)成分之間的協(xié)調(diào)程度有重要影響。淀粉的水解和降解過程同時伴隨著淀粉結(jié)構(gòu)的變化［18］，雖然不同烤煙煙葉淀粉的顆粒表面特征基本一致，但內(nèi)部分子鏈結(jié)構(gòu)并不完全相同，在煙葉調(diào)制過程中，淀粉的降解過程也不盡相同，因此，應(yīng)用XRD和CP/MAS13C NMR波譜技術(shù)不僅為研究煙草淀粉晶體結(jié)構(gòu)提供重要手段，而且對于煙葉的烘烤合理調(diào)控、促進煙葉內(nèi)部的化學(xué)成分協(xié)調(diào)一致、向著提高煙葉品質(zhì)方向發(fā)展也有重要的意義。

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責(zé)任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅 維

中圖分類號：S572.01

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-1032（2016）01-0044-05

收稿日期：2015-09-28 修回日期：2015-12-02

基金項目：安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司項目（2015125）；重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司項目（JL/CYZYG SJ003-04）

作者簡介：朱曉蘭（1972—），女，安徽廬江人，博士，副研究員，主要從事分析化學(xué)和煙草化學(xué)研究，zxl8906@ustc.edu.cn晶型和結(jié)晶度等結(jié)構(gòu)特性。淀粉結(jié)構(gòu)的分析多采用XRD波譜研究［6-7］，賀帆等［8］用此法研究烤煙煙葉淀粉顆粒結(jié)構(gòu)特征和晶體特征，但由于淀粉是多晶結(jié)構(gòu)，用XRD計算淀粉結(jié)晶度有一定的困難。李統(tǒng)帥等［9］采用光學(xué)顯微鏡觀察了烘烤過程中非晶顆粒態(tài)煙草淀粉微生物降解特性和淀粉顆粒結(jié)構(gòu)的變化。He等［10］也采用掃描電鏡考察了上部煙葉在烘烤過程中淀粉顆粒晶體結(jié)構(gòu)的變化。近年來，固體核磁共振波譜儀（CP/MAS13C NMR）技術(shù)被用于研究淀粉的結(jié)構(gòu)［11］。筆者采用亞硫酸溶液提取了烤煙煙葉中的淀粉，利用CP/MAS 13C NMR和XRD光譜研究了煙草淀粉晶體的類型，并計算烤煙淀粉的雙螺旋含量和相對結(jié)晶度，結(jié)合SEC光譜考察了煙草淀粉顆粒的表面結(jié)構(gòu)和性狀，以期為煙草調(diào)制過程中淀粉的降解、烤后煙葉淀粉的結(jié)構(gòu)變化以及提升烤煙的質(zhì)量提供理論基礎(chǔ)。

Spectrum analysis of crystalline structure of flue-cured tobacco leaves

Zhu Xiaolan1， Xuyingbo2， Zhoushun2， Gao Yun1
（1.Research Center of Tobacco and Health， University of Science and Technology of China， Hefei 230052，China；2.Center of Technology， China Tobacco Anhui Industrial Corporation， Hefei 230088， China）

Abstract：The structure characteristics， crystalline characteristics and relative crystallinity of starches from flue-cured tobacco leaves were investigated with CP/MAS13C NMR， X-ray powder diffraction （XRD） and scanning electron microscopy （SEC）. The results indicated that there were typical doublets at about 99.3， 100.2 ppm in C1 spectrum of CP/MAS13C NMR from tobacco starch. The XRD spectra of tobacco starch showed the strongest diffraction peak at around 17 o 2θ， and a few small peaks at around 5.6o， 15o， 20o， 22o and 24o 2θ， which was the characteristic peaks of B-type starch. The percentage of the relative crystallinity and double helix content calculated from CP/MAS13C NMR in tobacco starches were 36.1% and 21.3%， respectively. The relative crystallinity obtained from CP/MAS13C NMR was higher than that from XRD.

Keywords：flue-cured tobacco； starch crystal； solid state nuclear magnetic resonance； crystallinity