地中海貧血實(shí)驗(yàn)室篩查指標(biāo)評價(jià)

陳熙　肖克林　羅茗月　麥光興　夏勇

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地中海貧血實(shí)驗(yàn)室篩查指標(biāo)評價(jià)

陳熙肖克林★羅茗月麥光興夏勇

［摘要］目的探討多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)用于篩查地中海貧血（簡稱地貧）基因攜帶者的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法選取在深圳市寶安區(qū)婦幼保健院體檢、婚檢和產(chǎn)檢的人員1 373例，對其均進(jìn)行血常規(guī)血細(xì)胞分析、血紅蛋白成份分析和地貧基因診斷。以基因診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，對已明確診斷的α?地貧組548例、β?地貧組248例、α?合并β?地貧組33例和非地貧組544例，進(jìn)行紅細(xì)胞參數(shù)［紅細(xì)胞數(shù)量（red blood cell count，RBC）、血紅蛋白（hemoglobin，HB）含量、紅細(xì)胞壓積（hematocrit，HCT）、平均紅細(xì)胞體積（mean corpuscular volume，MCV）、平均血紅蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）、平均血紅蛋白濃度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）和血紅蛋白A2（hemoglobin A2，HbA2）含量］比較；計(jì)算MCV、MCH和HbA23項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)聯(lián)合篩查結(jié)果的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值。結(jié)果地貧組與非地貧組比較，地貧組HB、HCT、MCV、MCH和MCHC均減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與非地貧組相比較，β地貧組HbA2值明顯升高（P<0.05）。MCV與MCH 2項(xiàng)平行聯(lián)合篩查地貧的靈敏度及特異度分別為94.0%和82.9%；MCV、MCH和HbA2?HPLC 3項(xiàng)平行聯(lián)合篩查地貧的靈敏度及特異度為97.7%和39.2%。結(jié)論HbA2定量分析是篩查β?地貧極有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，但對于篩查α?地貧敏感性較差，漏檢率高。MCV、MCH兩者平行聯(lián)合或與HbA2?HPLC三者平行聯(lián)合篩查有較高的檢測靈敏度，但特異度不甚理想。因此在進(jìn)行地貧篩查時(shí)，需綜合分析實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)指標(biāo)，以降低漏診率。

［關(guān)鍵詞］地中海貧血；平均紅細(xì)胞體積；平均血紅蛋白含量；血紅蛋白

地中海貧血（簡稱地貧）是由于珠蛋白基因突變導(dǎo)致肽鏈表達(dá)失衡而產(chǎn)生的單基因常染色體隱性遺傳性貧血病［1］。根據(jù)生成減少的珠蛋白鏈種類將地貧分為α?、β?、δβ?和δ?型地貧等類型，其中α?和β?地貧較為常見。本病高發(fā)于地中海沿岸和東南亞各國，在我國多分布于廣東、廣西、海南、四川等省區(qū)［2］。該病危害大［3］，重型地貧患者絕大多數(shù)于兒童期死亡。目前通過實(shí)驗(yàn)室方法對地貧進(jìn)行篩查和產(chǎn)前基因診斷是杜絕重型地貧患兒出生的有效措施。地貧的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室篩查項(xiàng)目主要為血液學(xué)檢查內(nèi)容，包括紅細(xì)胞參數(shù)、血紅蛋白分析等［4］。地貧基因診斷則是確診該病的金標(biāo)準(zhǔn)［5］，一般基于PCR、核酸雜交、基因芯片和DNA測序等技術(shù)。為合理選擇實(shí)驗(yàn)室檢查項(xiàng)目和方法進(jìn)行地貧篩查，本研究對篩查地貧的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)［紅細(xì)胞數(shù)量（red blood cell count，RBC）、血紅蛋白（hemoglobin，HB）含量、紅細(xì)胞壓積（hematocrit，HCT）、平均紅細(xì)胞體積（mean corpuscular volume，MCV）、平均血紅蛋白含量（mean corpuscular hemo?globin，MCH）、平均血紅蛋白濃度（mean corpuscu?lar hemoglobin concentration，MCHC）、血紅蛋白A2（hemoglobin A2，HbA2）含量］進(jìn)行系統(tǒng)分析，評價(jià)其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取從2012年1月至2013年12月在深圳市寶安區(qū)婦幼保健院體檢、婚檢和產(chǎn)檢的人員1 373例，年齡17~48歲，平均年齡為26.9歲，所選研究對象均進(jìn)行血細(xì)胞分析、血紅蛋白成份分析和地貧基因診斷?；蛟\斷確診地貧基因攜帶者829例，非地貧患者544例。

1.2儀器與試劑

Coulter LH750血細(xì)胞分析儀（Beckman，美國），VariantTMⅡ血紅蛋白分析儀（Bio?Rad，美國），Mastercycler5331梯度PCR儀（Eppendorf，德國），凝膠成像分析系統(tǒng)（UVI，英國），電泳儀（北京六一儀器廠DYC系列），雜交儀（UVP，美國），全血DNA快速提取試劑盒（深圳亞能生物技術(shù)有限公司），α?/β?地中海貧血基因檢測試劑盒（深圳亞能生物技術(shù)有限公司），電泳緩沖液：0.5×TBE（深圳亞能生物技術(shù)有限公司），瓊脂糖（solarbio，西班牙）。

1.3方法

1.3.1紅細(xì)胞參數(shù)檢測

采用全自動血細(xì)胞分析儀檢測紅細(xì)胞參數(shù)，嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控檢測。設(shè)定成人MCV、MCH正常參考值范圍分別為80~95 fL和27~31 pg，取MCV<80 fL、MCH<27 pg為陽性截?cái)嘀怠?/p>

1.3.2血紅蛋白分析

采用離子交換高效液相色譜（high perfor?mance liquid chromatography，HPLC）方法分離紅細(xì)胞中的血紅蛋白成份［6］，根據(jù)出峰時(shí)間（保留時(shí)間）和出峰面積大小來分析不同血紅蛋白的成份和含量。實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果分析均按說明書進(jìn)行。設(shè)定成人HbA2的正常參考值范圍為2.5%~3.5%，取HbA2<2.5%或HbA2>3.5%為陽性截?cái)嘀怠?/p>

1.3.3地中海貧血基因診斷

首先通過柱式分離法提取全血DNA。再采用gap?PCR方法檢測中國人群中常見的3種缺失型α?地貧（??SEA、?α3.7與?α4.2），采用PCR?反向斑點(diǎn)雜交（PCR?reverse dot blot，PCR?RDB）技術(shù)檢測常見的3種突變型α?地貧（αcsα、αQsα、αwsα）和17種突變型β?地貧｛CD41?42（?TTCT），IVS?Ⅱ?654（C→T），?28（A→G），?29（A→G），?30（T→C），?32（C→A），CD17（A→T），CD31（?C），CD43（G→T），CD71?72（+A），βE（GAG→AAG），CD14?15（+G），CD27/28（+C），IVS?Ⅰ?1（G→A，G→T），IVS?Ⅰ?5 （G→C），CAP［CAP+1（A→C）/5’UTR；+43to+40（?AAAC）］，Int（ATG→AGG）｝。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料以x±s表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1地中海貧血基因攜帶率

選取的1 373例產(chǎn)檢、婚檢及健康體檢者中共檢出829例地貧基因攜帶者。其中單純α?地貧基因攜帶者548例，攜帶率為39.9%；β?地貧基因攜帶者248例，攜帶率為18.1%；α合并β地貧基因攜帶者33例，攜帶率為2.4%。

2.2地中海貧血基因突變類型

α?地貧基因突變類型包括??SEA、?α3.7、?α4.2、αcsα、αQsα、αwsα，其中??SEA型最為常見，占66.8%。β?地貧共檢出11種基因突變類型，其中CD41?42（?TTCT）和IVS?Ⅱ?654（C→T）為最常見的突變類型。

2.3血常規(guī)紅細(xì)胞參數(shù)比較

統(tǒng)計(jì)紅細(xì)胞6項(xiàng)參數(shù)：紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、血紅蛋白含量（HB）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、平均血紅蛋白含量（MCH）、平均血紅蛋白濃度（MCHC）。α?、β、α合并β地貧組的MCV、MCH、MCHC、HB、HCT與非地貧組比較均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1　地貧患者與健康者紅細(xì)胞參數(shù)測定結(jié)果比較（x±s）Table 1　The erythrocyte parameters of thalassemia patients and normal subjects（x±s）

2.4HbA2測定結(jié)果

與非地貧組比較，β?地貧組和α合并β地貧組HbA2值明顯升高（P<0.05），α?地貧組HbA2輕度降低（P<0.05），見表2。

表2　非地貧組和地貧組HbA2結(jié)果比較（x±s）Table 2　HbA2of thalassemia patients and normal subjects（x±s）

2.5MCV、MCH、HbA2聯(lián)合實(shí)驗(yàn)檢測

本研究采用MCV、MCH兩者平行聯(lián)合或與HbA2?HPLC三者平行聯(lián)合實(shí)驗(yàn)來篩查地貧攜帶率，當(dāng)三者平行聯(lián)合篩查時(shí)，靈敏度可達(dá)97.7%，但特異度較低，見表3、表4。

表3MCV、MCH、HbA2?HPLC平行聯(lián)合實(shí)驗(yàn)篩查地貧陽性例數(shù)（n）Table 3　The positive cases of the parallel test for MCV，MCH，HbA2?HPLC on screening thalassemia（n）

表4MCV、MCH、HbA2?HPLC平行聯(lián)合實(shí)驗(yàn)檢測地貧的評價(jià)指標(biāo)（%）Table 4　The effectiveness of the parallel test for MCV，MCH，HbA2?HPLC on screening thalassemia（%）

3　討論

重型地貧患者需終生靠輸血和去鐵治療維持，因此通過選擇性引產(chǎn)是預(yù)防重型地貧患兒出生的有效對策［7］。深圳是個移民城市，城市人員來自不同地區(qū)，為做好地貧基因產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢工作，首先需了解這一區(qū)域地貧基因的常見缺失和突變類型。在本研究所選受檢對象中，α?地貧攜帶率最高的為東南亞缺失型，這也是我國南方最主要缺失型［8］；CD41?42（?TTCT）和IVS?Ⅱ?654（C→T）為常見β?地貧基因突變類型，同廣東省其他地區(qū)報(bào)道的類似［9］；α合并β復(fù)合型地貧的攜帶率為2.4%，高于廣州報(bào)道的0.37%［10］，可能與選擇的人群不同有關(guān)。

目前，實(shí)驗(yàn)室地貧篩查項(xiàng)目一般包括紅細(xì)胞參數(shù)檢測，紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)、血紅蛋白組分分析和血清鐵代謝檢測等。為建立準(zhǔn)確、快速地篩查模式，本研究系統(tǒng)評價(jià)實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)地貧篩查指標(biāo)，以簡化診斷策略。紅細(xì)胞參數(shù)檢測對發(fā)現(xiàn)貧血有重要意義，一般患者M(jìn)CV<80 fL，MCH<27 pg提示其可能是患缺鐵性貧血或?yàn)榈刎毣驍y帶者，并且MCV和MCH的減低程度與地貧類型和貧血嚴(yán)重性相關(guān)［11］。MCV及MCH等紅細(xì)胞參數(shù)在地貧篩查中日益受到重視，已被國內(nèi)外普遍應(yīng)用于地貧篩查。本研究中地貧基因攜帶者和正常對照組的紅細(xì)胞參數(shù)各項(xiàng)指標(biāo)有明顯差異，地貧組的MCV和MCH均降低（P<0.001），β?地貧組、α合并β復(fù)合型地貧組較α?地貧組降低更為明顯。但需要注意，缺鐵性貧血同樣可能造成小細(xì)胞低色素性貧血，MCV、MCH值也會降低，這會造成地貧篩查時(shí)假陽性增高，臨床中可以通過檢測血清鐵和鐵蛋白進(jìn)行排除。

血紅蛋白組分分析是地貧篩查中重要檢查項(xiàng)目［12］。常用的血紅蛋白分析技術(shù)有瓊脂糖凝膠電泳、高效液相色譜法（HPLC）、毛細(xì)管電泳（capil?lary electrophoresis，CE）等。HPLC重復(fù)性好、操作簡便是定量檢測HbA2及HbF和分離鑒定異常血紅蛋白的優(yōu)良方法［13］。HbA2是篩查地貧極有價(jià)值的指標(biāo)，當(dāng)HbA2大于3.5%提示攜帶β?地貧可能性大，而α?地貧的HbA2值一般小于2.5%。本研究中，β?地貧組HbA2值明顯高于非地貧組，靈敏度、特異度、準(zhǔn)確率較高。α?地貧組HbA2值相對非地貧組輕度降低，且有30.5%的α?地貧基因攜帶者HbA2含量正常，因此HbA2定量分析用于α?地貧篩查時(shí)敏感性差，漏檢率高。此外，在研究中發(fā)現(xiàn)α合并β地貧組的HbA2值相對正常對照組顯著增高，篩查如果僅靠HbA2單項(xiàng)指標(biāo)評估會造成漏診，實(shí)驗(yàn)室人員不能因?yàn)镠bA2值升高而忽視了β合并α的復(fù)合型地貧類型，需結(jié)合其他指標(biāo)進(jìn)行分析，避免漏診。

本研究中采用MCV、MCH兩者平行聯(lián)合或與HPLC三者平行聯(lián)合篩查地貧，可以降低單項(xiàng)檢測的假陰性率，提高檢測陽性病例的靈敏度，用于地貧篩查時(shí)漏診率低，但特異度相對較差，進(jìn)一步確診需要做基因分析?；蛟\斷方法因地貧的不同類型而異。對于已知的地貧基因檢測，實(shí)驗(yàn)室常用技術(shù)為gap?PCR、PCR?RDB、實(shí)時(shí)PCR熔解曲線分析等［14］。gap?PCR可以檢測缺失和重排，是診斷缺失型地貧的常規(guī)方法。PCR?RDB能同時(shí)檢測多個位點(diǎn)突變，多用作突變型地貧診斷。近年來實(shí)時(shí)PCR熔解曲線分析正逐漸受到人們的關(guān)注，其主要有熒光標(biāo)記探針熔解曲線和高分辨熔解曲線2種分析技術(shù)，具有靈敏度高，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適合臨床應(yīng)用推廣。而DNA測序技術(shù)用來檢測未知地貧突變基因結(jié)果準(zhǔn)確，但操作繁瑣，成本較高，可以選擇作為罕見病例確證的方法。

綜上所述，在進(jìn)行地貧篩查時(shí)，需綜合分析實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測的數(shù)據(jù)，以降低漏診率和假陽性率［15］。血常規(guī)紅細(xì)胞參數(shù)聯(lián)合血紅蛋白成分分析是目前最為簡單、經(jīng)濟(jì)的地貧篩查方案，適用于各基層醫(yī)療單位；根據(jù)篩查結(jié)果再進(jìn)一步行基因診斷則可有效地避免重型地中海貧血患兒出生，極大地提高社會人口質(zhì)量。

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作者單位：深圳市寶安區(qū)婦幼保健院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東，深圳518133★通訊作者：肖克林，E?mail：lcxkl@163.com

Evaluation of laboratory index for screening thalassemia

CHEN Xi，XIAO Kelin★，LUO Mingyue，MAI Guangxing，XIA Yong
（Central Laboratory，Bao’an Maternal and Child Health Hospital，Shenzhen，Guangdong，China，518133）

［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the value of several laboratory indexes(RBC,HB,HCT,MCV, MCH,MCHC and HbA2)for screening thalassemia.Methods1 373 cases were recruited from Shenzhen Bao’an Maternity and Child Health Hospital,including 548 α?thalassemia,248 β?thalassemia,33 α?and β?combined thalassemia and 544 normal,all have been tested for routine blood erythrocyte parameters(red blood cell count,RBC;hemoglobin,HB;hematocrit,HCT;mean corpuscular volume,MCV;mean corpuscular hemo?globin,MCH;mean corpuscular hemoglobin concentration,MCHC)and hemoglobin A2(HbA2)quantitative, a?and b?thalassemia associated genes.The sensitivity,specific,positive predictive value and negative predic?tive value of MCV,MCH and HbA2for screening thalassemia were calculated by using gene examination re?sults as the golden standard.ResultsIn comparison with normal subjects,RBC,HB,HCT,MCV,MCH and MCHC of thalassemia cases declined(P<0.05),HbA2of β?thalassemia increased significantly(P<0.05). The sensitivity and specificity of parallel test of MCV and MCH were 94.0%and 82.9%;The sensitivity and specificity of parallel test of MCV,MCH and HbA2?HPLC were 97.7%and 39.2%.ConclusionHbA2quan?titaty is a reliable index for screening β?thalassemia,but not good for screening α?thalassemia because of thelower sensitivity and high misdiagnosis risk.The parallel tests of MCV,MCH and HbA2?HPLC were of higher detection sensitivity,but specificity of that was not ideal.So the laboratory indexes of screening thalassemia should be analyzed comprehensively,in order to reduce the rate of misdiagnosis.

［KEY WORDS］Thalassemia;Mean corpuscular volume;Mean corpuscular hemoglobin;Hemoglobin