中國(guó)型Gγ+(Aγδβ)0地中海貧血的基因診斷和臨床特征分析

王繼成　秦丹卿　駱明勇　何天文

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中國(guó)型Gγ+(Aγδβ)0地中海貧血的基因診斷和臨床特征分析

王繼成秦丹卿駱明勇何天文★

［摘要］目的對(duì)42例中國(guó)型Gγ+(Aγδβ)0地中海貧血患者進(jìn)行基因診斷并分析其臨床特征。方法所有患者的外周血標(biāo)本進(jìn)行血紅蛋白毛細(xì)管電泳和包括平均紅細(xì)胞體積（mean corpuscular volume，MCV），平均血紅蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）等紅細(xì)胞參數(shù)的分析，應(yīng)用Gap?PCR、PCR ?RDB的方法進(jìn)行地中海貧血基因檢測(cè)。結(jié)果40例患者為中國(guó)型Gγ+(Aγδβ)0雜合子，血紅蛋白正?；蜉p度下降，血紅蛋白分析顯示HbF為10.6%～20.6%；2例為中國(guó)型Gγ+(Aγδβ)0合并其它常見(jiàn)的β地中海貧血，表現(xiàn)為中重度的貧血，HbF為80.8%～93.1%。結(jié)論中國(guó)人群中中國(guó)型Gγ+(Aγδβ)0是比較常見(jiàn)的缺失型β地中海貧血類(lèi)型，其雜合子臨床癥狀較輕，當(dāng)合并其他地中海貧血時(shí)可改變?cè)械难簩W(xué)表現(xiàn)。

［關(guān)鍵詞］β地中海貧血；δβ地中海貧血；基因診斷

地中海貧血簡(jiǎn)稱地貧，又稱海洋性貧血，是我國(guó)南方常見(jiàn)的遺傳性血液學(xué)疾病，主要分α地中海貧血（簡(jiǎn)稱α地貧）和β地中海貧血（簡(jiǎn)稱β地貧）2種類(lèi)型。β地貧主要是由β珠蛋白基因的點(diǎn)突變引起，少數(shù)是由于β珠蛋白基因簇的大片段缺失所致。δβ地貧是一類(lèi)累及δ和β珠蛋白基因的缺失型地貧。這種缺失導(dǎo)致胎兒期的γ珠蛋白基因在成人期重新開(kāi)放和持續(xù)表達(dá)，從而導(dǎo)致HbF的異常升高［1］。目前全世界已發(fā)現(xiàn)多種不同缺失類(lèi)型的δβ地貧。在我國(guó)人群中，中國(guó)型、云南型和廣州型的δβ地貧已被報(bào)道，這些類(lèi)型都是Gγ+（Aγδβ）0地貧，其中中國(guó)人最常見(jiàn)的是中國(guó)型Gγ+（Aγδβ）0地貧［2-5］。這種地貧首先由Mann等［6］人在上世紀(jì)70年代報(bào)道。我們對(duì)42例中國(guó)型Gγ+（Aγδβ）0地貧患者進(jìn)行基因診斷并分析其臨床特征，報(bào)告如下。

1　對(duì)象與方法

1.1對(duì)象

2012年至2015年來(lái)我院就診，血紅蛋白電泳顯示HbF增高（>5%）且經(jīng)基因檢測(cè)確診為中國(guó)型Gγ+（Aγδβ）0地貧的42例的患者。所有患者均為廣東籍居民，年齡為18~38歲，平均年齡為27.6歲。取其外周血用于血常規(guī)和血紅蛋白電泳分析，提取外周血基因組DNA用于珠蛋白基因檢測(cè)。

1.2方法

1.2.1紅細(xì)胞參數(shù)和血紅蛋白分析

提取EDTA抗凝靜脈血2 mL，用深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司的BC?2000血液分析儀對(duì)外周血進(jìn)行紅細(xì)胞參數(shù)分析。抽取檸檬酸鈉抗凝靜脈血2 mL，應(yīng)用法國(guó)SEBIA公司的se?bia capillary2毛細(xì)管電泳分析系統(tǒng)進(jìn)行血紅蛋白分析。

1.2.2地貧基因診斷

使用QIAmp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取外周血基因組DNA。應(yīng)用亞能生物技術(shù)有限公司的地貧基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行基因檢測(cè)，包括3種最常見(jiàn)的缺失型α地貧（??SEA/、?α4.2、?α3.7）、3種最常見(jiàn)的點(diǎn)突變型α地貧（CS、WS、QS）以及17種常見(jiàn)的β地貧，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用裂隙聚合酶鏈反應(yīng)（gap polymerase chain reaction,Gap?PCR）的方法檢測(cè)中國(guó)型Gγ+（Aγδβ）0地貧，Gap?PCR引物委托鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系是3條引物雙重Gap?PCR，3條引物的序列分別為：共同上游引物5′?CCAGCCTCATGGTAGCAGAATC?3′，缺失下游引物5′?TGGTATCTGCAGCAGTTGCC?3′，正常內(nèi)對(duì)照下游引物5′?GTGATTGTTGAGTTGCAG?GATCG?3′。中國(guó)型Gγ+（Aγδβ）0地貧缺失擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為211 bp，正常內(nèi)對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為298 bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min，瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2　結(jié)果

2.1血液學(xué)和血紅蛋白電泳

40例中國(guó)型Gγ+（Aγδβ）0雜合子患者的血液學(xué)指標(biāo)表現(xiàn)差別較大，血紅蛋白正?；蜉p度降低；MCV和MCH有不同程度的下降，提示小細(xì)胞低色素性貧血的特征。血紅蛋白電泳分析顯示HbA2為2.3%~3.1%，HbF為10.6%～20.6%；2例為中國(guó)型Gγ+（Aγδβ）0復(fù)合其它常見(jiàn)的β地中海貧血，表現(xiàn)為中重度貧血，HbF大幅增高到80.8%～93.1%（表1）。

表1　紅細(xì)胞參數(shù)、血紅蛋白電泳及基因檢測(cè)結(jié)果Table 1　Results of hemotological parameters and gene diagnosis

2.2基因檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用基于反向斑點(diǎn)雜交方法的β?地貧基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)到2例突變，分別為?28和CD17純合突變，PCR?RDB結(jié)果見(jiàn)圖1。用Gap?PCR法共檢測(cè)，42例為中國(guó)型Gγ+（Aγδβ）0缺失型地貧。PCR瓊脂糖凝膠電泳圖見(jiàn)圖2，其中298 bp為正常對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物，211 bp為缺失型條帶。

3　討論

中國(guó)型Gγ+（Aγδβ）0地貧的缺失范圍約100 kb，包括部分Aγ珠蛋白基因、全部的δ和β珠蛋白基因以及β珠蛋白基因下游較遠(yuǎn)的具有調(diào)控功能的DNA序列［7-8］。這種缺失致使Gγ珠蛋白基因的高表達(dá)，從而使HbF在胎兒出生后的持續(xù)性升高（5%~20%）和小細(xì)胞低色素性貧血成為中國(guó)型Gγ+（Aγδβ）0特征性的臨床表現(xiàn)［9］。HbF是胎兒期表達(dá)的血紅蛋白。出生6個(gè)月后，HbA（α2β2）成為紅細(xì)胞中主要的血紅蛋白，HbF含量則低于1%。但HbF在成人時(shí)期增高性的表達(dá)可以緩解α肽鏈和類(lèi)β肽鏈比例失衡的程度從而起到代償性的作用。從本研究40例確診為中國(guó)型Gγ+（Aγδβ）0雜合型患者的血細(xì)胞參數(shù)和血紅蛋白電泳結(jié)果可知，雜合子患者的血紅蛋白的值為102~154 g/L，表現(xiàn)較輕的貧血或無(wú)貧血。但MCV<80 fL和MCH< 27 pg均提示地貧的可能。雜合子患者的HbA2是正常的或輕微下降，而HbF值為10.6%～20.6%，分布范圍比較集中。但當(dāng)合并其他常見(jiàn)的β地貧基因突變時(shí)，表現(xiàn)為明顯的中度或重度貧血（Hb顯著降低），HbF也上升為80.8%～93.1%，這與文獻(xiàn)報(bào)道的相類(lèi)似［10-14］。所以進(jìn)行血液學(xué)分析時(shí)，若紅細(xì)胞指標(biāo)提示為小細(xì)胞低色素性貧血，而HbF有相應(yīng)程度的升高，且也未檢測(cè)到中國(guó)人常見(jiàn)的17 種β地貧，需考慮缺失型β地貧的可能。當(dāng)然這首先要與中國(guó)人常見(jiàn)的SEA?HPFH相鑒別，后者常有更高水平的HbF和很少有小細(xì)胞低色素性貧血樣改變［15］。

雖然中國(guó)人群中，β地貧主要是因β珠蛋白基因的點(diǎn)突變所致，但李志琴等［16］的調(diào)查顯示在中國(guó)南方人群分別有10%和13%的中間型地貧的基因構(gòu)成為中國(guó)型Gγ+（Aγδβ）0地貧和SEA?HPFH，這提示這2種缺失型突變也是我國(guó)南方人群比較常見(jiàn)的類(lèi)型。目前國(guó)內(nèi)商業(yè)化的試劑盒普遍采用PCR?RDB的方法檢測(cè)β地貧最常見(jiàn)的17種點(diǎn)突變，并未常規(guī)檢測(cè)包括中國(guó)型Gγ+（Aγδβ）0在內(nèi)的中國(guó)人比較常見(jiàn)的缺失型β地貧。β地貧的臨床檢驗(yàn)過(guò)程中，當(dāng)發(fā)現(xiàn)基因檢測(cè)的結(jié)果與血液學(xué)分析的結(jié)果不相符時(shí)，需考慮其他未在檢測(cè)范圍內(nèi)的地貧類(lèi)型的可能。圖1A和B雜交膜條中的?28和CD17位點(diǎn)均無(wú)正常對(duì)照，顯示為此2個(gè)位點(diǎn)的純合突變。然而這與此2位點(diǎn)真實(shí)的純合突變的血液學(xué)表現(xiàn)明顯不同，包括HbF在內(nèi)的數(shù)值也明顯不一致。這些血液學(xué)表現(xiàn)與是否合并α地貧也有很大的相關(guān)性，故而常見(jiàn)α地貧的基因檢測(cè)也必不可少。

在我國(guó)南方這些β地貧的高發(fā)區(qū)，通常先以血常規(guī)和血紅蛋白電泳進(jìn)行地貧的篩查，疑似病例再進(jìn)行常規(guī)的基因檢測(cè)，這時(shí)不能忽視包括中國(guó)型Gγ+（Aγδβ）0在內(nèi)的缺失型β地貧存在的可能。這些缺失型地貧通常是大片段的缺失，斷裂位點(diǎn)也比較明確，都可以采用Gap?PCR的方法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)［17］。雜合缺失型β地貧的患者與常見(jiàn)β地中海貧血攜帶者結(jié)合有可能導(dǎo)致中重度β地貧患兒出生的可能，所以準(zhǔn)確的孕前基因檢測(cè)和產(chǎn)前診斷就非常有必要。總之，罕見(jiàn)β地貧的正確診斷和鑒別，對(duì)于遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷可以提供更好的依據(jù)。尤其當(dāng)不符合遺傳規(guī)律時(shí)，更具有指導(dǎo)性的價(jià)值。

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基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014A020212246）

作者單位：廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東，廣州511442★通訊作者：何天文，E?mail：love830415@126.com

Genetic research and clinical analysis of deletional ChineseGγ+(Aγδβ)0?thalassemia

WANG Jicheng,QIN Danqing,LUO Mingyong,HE Tianwen★
(Medical Genetics Center of Guangdong Women and Children Hospital,Guangzhou,Guangdong,China,511442)

［ABSTRACT］ObjectiveToinvestigatethegenotypeandclinicalfeaturesofdeletional ChineseGγ+(Aγδβ)0?thalassemia.MethodsBlood cell count and hemoglobin electrophoresis analysis were performed on the blood samples of all 42 subjects.Gap?PCR and PCR?reverse dot hybridization analysis were used to detect globin gene mutations.ResultsAmong all the subjects,40 cases were identified to be heterozygote of deletional ChineseGγ+(Aγδβ)0?thalassemia.Hemoglobin analysis showed normal or mild anaemia.And the value of HbF was about 10.6%~20.6%.The other 2 cases were of ChineseGγ+(Aγδβ)0accompanied by other β?thalassemia.The value of HbF was around 80.8%～93.1%.And showed symptoms of severe anemia.ConclusionChineseGγ+(Aγδβ)0?thalassemia is a common type of deletional β?thalassemia in Chinese people.The heterozygotes have mild clinical symptoms,when co?inherited with other thalassemia,it will change the hematological manifestations.

[KEY WORDS]β?thalassemia;δβ?thalassemia;Gene diagnosis