尾巨桉3個(gè)無(wú)性系外植體誘導(dǎo)技術(shù)研究

石 前， 梁秀莉， 李飛宇， 鄧冬麗， 李麗芳， 李 俏*

(1.廣西壯族自治區(qū)國(guó)有東門林場(chǎng)，廣西扶綏 532108；2. 中種國(guó)際種子有限公司，北京 100028)

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尾巨桉3個(gè)無(wú)性系外植體誘導(dǎo)技術(shù)研究

石 前1， 梁秀莉1， 李飛宇2， 鄧冬麗1， 李麗芳1， 李 俏1*

(1.廣西壯族自治區(qū)國(guó)有東門林場(chǎng)，廣西扶綏 532108；2. 中種國(guó)際種子有限公司，北京 100028)

摘要[目的]研究尾巨桉3個(gè)無(wú)性系的外植體誘導(dǎo)相關(guān)技術(shù)。[方法]篩選最佳采集季節(jié)、最優(yōu)取材部位、最佳消毒時(shí)間和最優(yōu)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(6-BA)濃度，提高尾巨桉無(wú)性系外植體的萌芽率。[結(jié)果] 3個(gè)無(wú)性系最佳誘導(dǎo)季節(jié)為春秋兩季；外植體誘導(dǎo)取材的最佳部位是半木質(zhì)化的枝條；DH32-26、DH32-28外植體的最佳消毒時(shí)間為7 min、DH32-29外植體的最佳消毒時(shí)間為5 min；適宜外植體誘導(dǎo)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合為6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L，此時(shí)誘導(dǎo)萌芽率高。[結(jié)論]要提高外植體誘導(dǎo)的成功率，需從采集季節(jié)、取材部位、消毒時(shí)間以及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合方面綜合考慮，該研究為尾巨桉苗木快速繁殖提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞尾巨桉；無(wú)性系；外植體誘導(dǎo)

尾巨桉是尾葉桉和巨桉的雜交種，具有較強(qiáng)的抗病、抗蟲(chóng)、抗風(fēng)等能力，目前在造林中推廣應(yīng)用較多的無(wú)性系是尾巨桉系列的優(yōu)良無(wú)性系品種。當(dāng)前已應(yīng)用于造林的尾巨桉優(yōu)良無(wú)性系主要有DH32-29、DH32-28、DH32-26、DH32-27、DH32-13等。在生產(chǎn)中尾巨桉無(wú)性系組培苗需求量增長(zhǎng)迅速，促進(jìn)了組培育苗技術(shù)的快速發(fā)展和日趨完善。然而組培育苗技術(shù)各環(huán)節(jié)中最核心的外植體誘導(dǎo)技術(shù)存在污染率高、萌芽率低、繁殖倍數(shù)低和馴化時(shí)間較長(zhǎng)等問(wèn)題，極大地影響了工廠化組培育苗生產(chǎn)的速度和質(zhì)量，也增加了育苗成本。筆者對(duì)尾巨桉3個(gè)優(yōu)良無(wú)性系進(jìn)行外植體誘導(dǎo)技術(shù)研究，探索桉樹(shù)不同無(wú)性系在組培技術(shù)上的差異性，尋求最佳的技術(shù)途徑，提高誘導(dǎo)成功率和縮短誘導(dǎo)時(shí)間，有利于提高無(wú)性系組培育苗速度以及降低生產(chǎn)成本，同時(shí)也能完善補(bǔ)充尾巨桉的快繁技術(shù)，為尾巨桉苗木快速繁殖提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)地概況試驗(yàn)地位于崇左市扶綏縣廣西國(guó)營(yíng)東門林場(chǎng)林科所國(guó)家良種繁育中心苗圃，地理坐標(biāo)為107°15′～108°00′E、22°17′～22°30′N，東西長(zhǎng)80 km，南北寬20 km，屬于南亞熱帶地區(qū)，季風(fēng)氣候明顯，年日照時(shí)數(shù)1 634～1 719 h，年平均氣溫22 ℃，極端最高溫40 ℃，極端最低溫-4 ℃, 年霜降3.1 d，位于十萬(wàn)大山的雨影區(qū)，雨量偏少，年降雨量1 100～1 300 mm，相對(duì)濕度74%～83%。

1.2材料供試材料為東門林場(chǎng)優(yōu)良無(wú)性系DH32-26、DH32-28、DH32-29。DH32-26、DH32-28取自東門林場(chǎng)雷卡分場(chǎng)13林班內(nèi)，DH32-29取自華僑分場(chǎng)22林班內(nèi)，試驗(yàn)時(shí)間為2010～2013年。

1.33個(gè)無(wú)性系無(wú)菌培養(yǎng)繁殖體系的建立

1.3.1外植體采集。在同一無(wú)性系的林分內(nèi)按優(yōu)樹(shù)選擇的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)樹(shù)高、胸徑，排除邊緣木和孤立木，選好優(yōu)樹(shù)伐倒，待伐樁上萌發(fā)出枝條，經(jīng)不斷對(duì)萌芽修剪和防蟲(chóng)防菌的藥物處理，枝條達(dá)到半木質(zhì)化時(shí)便可剪取伐樁上萌發(fā)的枝條，外植體采集選擇在連續(xù)5 d左右晴朗的天氣之后，不能在清晨取材，因?yàn)?0：00之前露水未干，空氣濕度大，病菌易滋生，污染率增大，10：00之后經(jīng)過(guò)陽(yáng)光中的紫外線照射，減少了環(huán)境中真菌、細(xì)菌數(shù)量，以及外植體表面的病菌。外植體采集前要根據(jù)需要做好誘導(dǎo)前的準(zhǔn)備工作，在伐樁上選取半木質(zhì)化的芽條，剪去葉片只留葉柄后，立即放入裝有水的桶里，防止蒸騰作用對(duì)外植體的影響，將不同無(wú)性系分別做好標(biāo)記并捆扎好，對(duì)伐樁上剩下的生長(zhǎng)過(guò)旺的枝條要進(jìn)行修剪，以便下一批枝條萌發(fā)和成長(zhǎng)。

1.3.2外植體預(yù)處理。采集回外植體，用毛刷輕輕刷洗枝條表面，放入清水中沖洗30～60 min，再用飽和的洗衣粉溶液浸泡，不停振蕩，洗去枝條表面的灰塵，再反復(fù)用清水沖洗2～3遍，干凈后進(jìn)入接種室進(jìn)行下一步處理。在超凈臺(tái)上將枝條剪成2 cm左右?guī)?～2個(gè)腋芽的莖段，并裝入無(wú)菌瓶?jī)?nèi)，用75%乙醇浸泡約30 s，立即用無(wú)菌水沖洗3～5次，選用“二步消毒法”對(duì)枝條進(jìn)行處理，先用1%氯化汞處理后，用無(wú)菌水沖洗3～5次，接著進(jìn)行氯化汞第2次處理，再用無(wú)菌水沖洗3～5次；用干凈的濾紙吸干水分，剪去枝條被褐化的部分，插入培養(yǎng)基中。

1.3.3外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)條件。接種后先用深色的布遮蓋，在全暗條件下培養(yǎng)15 d，待出芽后置散射光下培養(yǎng)30 d。

1.43個(gè)無(wú)性系外植體誘導(dǎo)的研究

1.4.13個(gè)無(wú)性系在不同季節(jié)外植體誘導(dǎo)的研究。于春(3～5月)、夏(6～8月)、秋(9～11月)、冬(12月～次年2月)4個(gè)季節(jié)，將經(jīng)過(guò)消毒劑滅菌后的不同材料接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)，統(tǒng)計(jì)尾巨桉3個(gè)無(wú)性系誘導(dǎo)的萌芽率、褐化率、污染率。

1.4.23個(gè)無(wú)性系不同外植體部位誘導(dǎo)對(duì)比研究。選取3個(gè)無(wú)性系枝條的上段(幼嫩部分)、中段(半木質(zhì)化部分)、下段(完全木質(zhì)化部分)進(jìn)行誘導(dǎo)，對(duì)比尾巨桉3個(gè)無(wú)性系誘導(dǎo)的萌芽率、褐化率、污染率。

1.4.3氯化汞不同消毒時(shí)間對(duì)3個(gè)無(wú)性系外植體誘導(dǎo)的影響。設(shè)置氯化汞不同消毒時(shí)間(3、5、7、10 min)，研究3個(gè)無(wú)性系枝條在不同消毒時(shí)間下外植體誘導(dǎo)變化，設(shè)3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)10瓶，每瓶1支，共30枝，統(tǒng)計(jì)尾巨桉3個(gè)無(wú)性系誘導(dǎo)的萌芽率、褐化率、污染率。

1.4.4 6-BA不同濃度對(duì)3個(gè)無(wú)性系外植體萌芽率的影響。使用改良的MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，NAA濃度為0.4 mg/L，分別添加3個(gè)濃度(1.3、1.0、0.7 mg/L)6-BA，設(shè)3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)10瓶，每瓶1支，共30枝，對(duì)比尾巨桉3個(gè)無(wú)性系誘導(dǎo)的萌芽率。

2結(jié)果與分析

2.13個(gè)無(wú)性系在不同季節(jié)外植體誘導(dǎo)情況一般來(lái)說(shuō)，采集外植體的時(shí)間比較關(guān)鍵，在不同季節(jié)誘導(dǎo)的結(jié)果不同。3～5月正是萬(wàn)物復(fù)蘇、萌動(dòng)的季節(jié)，伐樁上容易萌發(fā)出大量的枝條，15～20 d可取1次枝條，這時(shí)期的桉樹(shù)枝條已蓄積了充足的內(nèi)源激素，所含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也較豐富，枝條的抗病性最強(qiáng)，因此3～5月是最適合做外植體誘導(dǎo)的季節(jié)。6～8月是汛期和旱期并存，高濕和高溫天氣交替，是病蟲(chóng)活躍期，這時(shí)候采集枝條帶菌量大，誘導(dǎo)難度高。9～11月進(jìn)入秋高氣爽的秋季，天氣比較干燥，也是誘導(dǎo)的好季節(jié)，由于一般選擇在6～8月砍樹(shù)伐樁，伐樁上萌芽量還比較少。12月～次年2月天氣寒冷，枝條萌動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)，萌芽率不高。由表1可知，3個(gè)無(wú)性系在各季節(jié)的萌芽率和污染率稍有差異，但其表現(xiàn)是基本一致的，在春秋季誘導(dǎo)的萌芽率比較高，夏冬季誘導(dǎo)的萌芽率比較低?？傮w來(lái)說(shuō)，DH32-29無(wú)性系在各季節(jié)誘導(dǎo)的萌芽率優(yōu)于DH32-28和DH32-26。

表1　3個(gè)無(wú)性系在不同季節(jié)外植體誘導(dǎo)情況

2.23個(gè)無(wú)性系的不同部位外植體誘導(dǎo)情況外植體的生理年齡對(duì)誘導(dǎo)成功率有一定的影響，越靠近伐樁基部的枝條生理年齡越老，越遠(yuǎn)離伐樁基部的枝條生理年齡越小。由表2可知，雖然3個(gè)無(wú)性系的不同部位誘導(dǎo)的結(jié)果稍有差別，但在不同部位有共同的規(guī)律，即選取半木質(zhì)化部位誘導(dǎo)效果是最好的，此部位萌芽枝數(shù)多，污染率較低，褐化率也較低；而上段的枝條太嫩，腋芽容易被消毒劑殺死，褐化嚴(yán)重，又因其遠(yuǎn)離樹(shù)樁，接觸到的微生物少，所以污染率比較低；下部枝條已完全木質(zhì)化，腋芽不易萌發(fā)，萌芽率低，萌出的芽質(zhì)量不好，枝條又靠近樹(shù)樁，容易感染微生物，誘導(dǎo)率低，褐化率也高。由于3種無(wú)性系的遺傳物質(zhì)不同，其外植體誘導(dǎo)也稍有差別，DH32-29誘導(dǎo)可選取的枝條多，誘導(dǎo)的萌芽數(shù)較多，是一個(gè)比較容易誘導(dǎo)的無(wú)性系，DH32-26、DH32-28伐樁上的萌芽較少，誘導(dǎo)萌動(dòng)率相對(duì)DH32-29較低，誘導(dǎo)比DH32-29難。

2.3氯化汞不同消毒時(shí)間對(duì)3個(gè)無(wú)性系外植體成活率的影響用于誘導(dǎo)的外植體所處的環(huán)境比較復(fù)雜，灰塵及許多微生物附著在其表面，使得外植體攜帶的菌落多，容易造成污染，所以外植體誘導(dǎo)時(shí)要對(duì)其進(jìn)行表面滅菌處理，消毒時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)誘導(dǎo)結(jié)果有不同的影響。

由表3可知，消毒時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)的結(jié)果有影響，3 min的消毒時(shí)間較短，雖然枝條褐化輕，但枝條中的內(nèi)生菌未被殺死，造成嚴(yán)重污染，影響了腋芽的萌發(fā)；5～7 min的消毒時(shí)間比較合適，此時(shí)污染輕，萌芽多；10 min的消毒時(shí)間太長(zhǎng)，已殺死了腋芽芽點(diǎn)，使腋芽難以萌發(fā)。隨著消毒時(shí)間的加長(zhǎng)，各無(wú)性系接種枝條褐化越來(lái)越嚴(yán)重。綜合分析可知，DH32-26和DH32-28外植體的最佳消毒時(shí)間是7 min，DH32-29外植體的最佳消毒時(shí)間是5 min。

表2　3個(gè)無(wú)性系的不同部位外植體誘導(dǎo)情況

表3　氯化汞不同消毒時(shí)間對(duì)3個(gè)無(wú)性系外植體成活率的影響

2.46-BA不同濃度對(duì)3個(gè)無(wú)性系外植體萌芽率的影響由表4可知，3個(gè)無(wú)性系在6-BA為1.0 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)萌芽率最高，此時(shí)DH32-29外植體誘導(dǎo)萌芽率為80.0%、DH32-28為71.1%、DH32-26為68.9%。

表46-BA不同濃度對(duì)3個(gè)無(wú)性系外植體萌芽率的影響

Table 4Effects of different 6-BA concentrations on explant germination rate of three clones

無(wú)性系Clones6-BA濃度6-BAconcentration∥mg/L萌芽率Germinationrate∥%DH32-261.367.81.068.90.760.0DH32-281.370.01.071.10.762.2DH32-291.375.61.080.00.771.1

3結(jié)論與討論

該研究結(jié)果表明，春秋兩季是誘導(dǎo)尾巨桉外植體萌發(fā)的最佳取材季節(jié)，此時(shí)可供選擇萌芽條多，污染率少，誘導(dǎo)成功率高。對(duì)莖段取材部位的研究表明，半木質(zhì)化的枝條誘導(dǎo)效果是最好的。由于各無(wú)性系生理特性不同，采集的地理環(huán)境不同，帶菌量也不同，用于外植體消毒的藥劑種類也不同，該試驗(yàn)先用75%酒精處理外植體表面后，再用0.1%的氯化汞作為消毒劑，通過(guò)對(duì)4個(gè)不同時(shí)間的消毒處理進(jìn)行研究，結(jié)果表明3個(gè)無(wú)性系中，DH32-29外植體用HgCl2消毒5 min可取得較高的萌芽率，DH32-26、DH32-28外植體用氯化汞消毒7 min可取得較高的萌芽率。采用3個(gè)濃度的6-BA處理各無(wú)性系外植體，結(jié)果表明適宜外植體誘導(dǎo)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合為6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L，誘導(dǎo)萌芽率最高。

在尾巨桉3個(gè)無(wú)性系的繼代培養(yǎng)中，培養(yǎng)材料由于繼代繁殖時(shí)間長(zhǎng)、次數(shù)多，染色體變異可能性會(huì)增大，再生繁殖能力下降，因此要及時(shí)更換材料。植物種類不同，繼代次數(shù)對(duì)其影響也不同，植物能保持原有的再生能力代數(shù)也不同，如除蟲(chóng)菊在5代后出現(xiàn)生長(zhǎng)不佳的現(xiàn)象[1]，百合多次繼代繁殖出現(xiàn)變異現(xiàn)象[2]，黑木耳菌種隨著繼代次數(shù)的增加而逐漸退化[3]，桉樹(shù)隨著繼代次數(shù)的增加，樹(shù)高及地徑生長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，抗病力減弱[4]。經(jīng)檢測(cè)，桉樹(shù)在30代內(nèi)DNA水平上未發(fā)生變異[5]，要根據(jù)桉樹(shù)這一特點(diǎn)，及時(shí)重新誘導(dǎo)，獲得新的植株，以保持繁殖材料的活力。

污染是尾巨桉無(wú)性系組織培養(yǎng)中一個(gè)難題，培養(yǎng)物受到污染，則不能正常生長(zhǎng)，既浪費(fèi)了材料和時(shí)間，又增加了成本，因此要提高外植體誘導(dǎo)的成功率，必須把控制污染放在第1位[6]。取材時(shí)要考慮是否在合適的季節(jié)和天氣、植物材料的部位、選取消毒劑種類和濃度、消毒時(shí)間、接種操作過(guò)程等因素，從而減少外植體污染的可能性，取得誘導(dǎo)成功。

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作者簡(jiǎn)介石前(1982- )，女，湖南衡陽(yáng)人，工程師，碩士，從事林木良種繁育研究。*通訊作者，從事桉樹(shù)遺傳改良和無(wú)性系開(kāi)發(fā)工作。

收稿日期2016-04-03

中圖分類號(hào)S 723.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)15-164-03

Study on Explant Induction of Different Hybrids ofEucalyptusurophylla×E.grandisClones

SHI Qian1, LIANG Xiu-li1, LI Fei-yu2, LI Qiao1*et al

(1. Guangxi Zhuang Autonomous Region Dongmen Forest Farm, Fusui, Guangxi 532108; 2. China Seed International Seed Co. Ltd., Beijing 100028)

Abstract[Objective] The aim was to study explant induction relevant technology of Eucalyptus urophylla × E. grandis three clones. [Method] The optimal collection season, sampling part, disinfection time and concentration of plant growth regulator(6-BA) was selected, so as to improve germination rate of explants of Eucalyptus urophylla × E. grandis clones. [Result] The spring and autumn were the optimal seasons for the explant induction, semi-lignified branches was the most suitable part of explant sampling, the most appropriate disinfection duration with mercuric chloride is 7 minutes for DH32-26 and DH32-28, and 5 minutes for DH32-29. 6-BA1.0 mg/L and NAA0.4 mg/L as plant growth regulator combination was good for explant induction which with the best germination rate. [Conclusion] In order to improve the successful rate of explant induction, a comprehensive consideration should be made in terms of the collection season, sampling part, disinfection time and plant growth regulator combination. The study can provide theoretical basis for rapid propagation of Eucalyptus urophylla × E. grandis seedlings.

Key wordsEucalyptus urophylla × E. grandis; Clone; Explant induction