厭氧處理對(duì)桑葉GABA含量的影響

龔 鑠， 周防震

(湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北恩施 445000)

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厭氧處理對(duì)桑葉GABA含量的影響

龔 鑠， 周防震*

(湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北恩施 445000)

摘要[目的]探討厭氧處理對(duì)桑葉中γ-氨基丁酸(GABA)含量的影響，為桑葉中功能性成分的開發(fā)利用提供參考。[方法]分別采用CO2厭氧和真空厭氧處理桑葉鮮葉，經(jīng)殺青、烘干和粉碎后，利用丙酮和AlCl3去除桑葉色素，分光光度法測(cè)定桑葉中GABA的含量。[結(jié)果]未厭氧處理的桑葉中GABA含量為0.915 mg/g；而CO2厭氧處理4 h，GABA含量達(dá)到最高值1.214 mg/g；真空厭氧處理8 h，GABA含量達(dá)到最高值1.453 mg/g。[結(jié)論]一定時(shí)間的CO2厭氧或真空厭氧處理均能顯著提高桑葉中GABA含量，真空厭氧處理可得到更高GABA含量的桑葉。

關(guān)鍵詞桑葉；γ-氨基丁酸；厭氧處理

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[1]，廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，具有降血壓、保持神經(jīng)安定、改善大腦機(jī)能和增強(qiáng)記憶等多種藥理作用[2]，具有較大的開發(fā)和利用價(jià)值。將普通的鮮茶葉經(jīng)過一定時(shí)間的厭氧處理使谷氨酸在谷氨酸脫羧酶作用下脫去羧基，生成GABA，國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道，并已有產(chǎn)品銷售。如日本學(xué)者通過厭氧和應(yīng)激處理，使普通春茶中GABA的含量達(dá)到2.02 mg/g(干重)，夏茶GABA的含量達(dá)到0.86～1.14 mg/g(干重)[3]，而普通加工的茶葉雖然谷氨酸的含量豐富，達(dá)到1.78～4.95 mg/g，但GABA含量只為0.2～2.0 μmol/g(干重)[4]，相當(dāng)于0.02～0.22 mg/g(干重)。

桑葉是?？浦参锷５母稍锶~，現(xiàn)代中、西醫(yī)把桑葉和桑葉生物制劑作為改善糖尿病及其他各種疑難雜癥的藥物而使用，認(rèn)為其藥效極為廣泛。研究表明，桑葉干品中GABA平均含量為2 260 mg/kg[5-7]，但有關(guān)厭氧處理對(duì)桑葉GABA含量影響的研究尚少見報(bào)道。筆者以桑葉為材料，探討厭氧處理對(duì)桑葉中GABA含量的影響，以期為桑葉中功能成分的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1.1原料與試劑。桑葉，2015年9月中旬采自湖北民族學(xué)院實(shí)驗(yàn)示范中心，樹齡30年左右。PET/PE透明真空包裝袋，河北東光縣立新塑料包裝有限公司；CO2厭氧產(chǎn)氣袋及2.5 L密封罐，日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社。丙酮、無水三氯化鋁和氫氧化鉀，天津市福晨化學(xué)試劑廠；無水乙醇、次氯酸鈉和γ-氨基丁酸標(biāo)品，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；重蒸酚，北京索萊寶科技有限公司；四硼酸鈉，天津市天達(dá)凈化材料精細(xì)化工廠。以上試劑均為分析純。

1.1.2主要儀器設(shè)備。小型高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司；精密pH計(jì)(PHS-4C型)，成都方舟科技開發(fā)公司；恒溫水浴鍋(HH-4)，金壇市科興儀器廠；粉碎機(jī)，廣東天際電器有限公司；電子天平，上海精天電子儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；電熱恒溫干燥箱，上海一恒科技有限公司；移液槍，Eppendorf公司；DZ-280/DZ-300A小型真空包裝機(jī)，溫州卓越機(jī)電有限公司。

1.2方法

1.2.1桑葉的處理。分別取新鮮桑葉100 g，室溫、真空和CO2厭氧條件下處理0、4、8和12 h。微波(110～115 ℃)殺青1～2 min，每30 s拌勻1次。然后80 ℃干燥至恒重，粉碎后過40目篩，置干燥器備用。各處理重復(fù)4次。

1.2.2桑葉中GABA的提取。稱取0.5 g桑葉干樣，加入裝有7 mL丙酮的離心管中，室溫振蕩15 min，8 000 r/min離心15 min，棄上清。分別再加7 mL和5 mL丙酮，重復(fù)上述過程，沉淀靜置干燥。待完全干燥后，加水5 mL，50 ℃水浴中振蕩提取2 h，8 000 r/min離心15 min，小心取出上清液(體積為V)，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3桑葉中GABA的含量測(cè)定。分別取1 mL樣品提取液，加入2 mol/L的AlCl3溶液50 μL，混勻后室溫振蕩15 min，12 000 r/min離心5 min，取上清0.5 mL加入1 mol/L的KOH溶液300 μL，室溫振蕩5 min，12 000 r/min離心5 min。分別取上清液300 μL，加0.1 mol/L的四硼酸鈉緩沖溶液500 μL(pH 10.0)，6%的重蒸酚400 μL，混勻后再加入600 μL 5%的NaClO溶液，充分混勻。于沸水浴中加熱10 min，立即置水浴中5 min，待溶液出現(xiàn)藍(lán)綠色后，加入2.0 mL 60%乙醇，于645 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。桑葉中GABA的含量按下式計(jì)算：

GABA質(zhì)量比(mg/g)=C×V/m

式中，C為由直線方程計(jì)算的值(mg/mL)；V為樣品提取液的總體積(mL)；m為樣品質(zhì)量(g)。

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。準(zhǔn)確稱取GABA標(biāo)準(zhǔn)品0.010 g，用蒸餾水溶解，定容至10 mL，配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取1 mL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，同“1.2.3”處理。以吸光值為縱坐標(biāo)，GABA的濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2結(jié)果與分析

2.1CO2厭氧處理對(duì)桑葉GABA含量的影響圖1顯示，CO2厭氧處理桑葉0～12 h，桑葉中GABA含量呈現(xiàn)先增加后減少又少量增加的趨勢(shì)，其中處理4 h時(shí)GABA含量達(dá)到最高值，處理8 和12 h時(shí)GABA含量顯著低于處理4 h的GABA含量。

圖1　CO2厭氧處理對(duì)桑葉GABA含量的影響Fig. 1　Effects of CO2 anaerobic treatment on the GABA content in mulberry leaf

2.2真空厭氧環(huán)境下桑葉GABA的含量及其變化圖2顯示，真空厭氧處理桑葉0～12 h，桑葉中GABA含量呈現(xiàn)先減少后增加，然后又減少的趨勢(shì)，其中處理4 h時(shí)GABA含量最低，處理8 h時(shí)GABA含量達(dá)到最高。

圖2　真空厭氧處理對(duì)桑葉中GABA含量的影響Fig.2　Effects of vacuum anaerobic treatment on the GABA content in mulberry leaf

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以GABA的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖3可見，GABA含量在0.062 5～1.000 0 mg/mL范圍內(nèi)，濃度與645 nm波長(zhǎng)下的吸光值之間具有良好的線性關(guān)系：Y=0.692 88X+0.090 71，決定系數(shù)R2=0.995 58。

圖3　GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3　GABA standard curve

2.4桑葉中GABA含量的測(cè)定根據(jù)圖3標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，未厭氧處理桑葉中GABA的含量為0.915 mg/g ；CO2厭氧處理4 h后桑葉中GABA的含量1.214 mg/g，真空厭氧處理8 h后桑葉中的GABA含量為1.453 mg/g(表1)。

表1厭氧處理桑葉中GABA的含量

Table 1The GABA content of mulberry leaf in anaerobic treatments

處理TreatmentOD645GABAmg/g未厭氧Noanaerobictreatment0.1860.915CO2厭氧4hCO2anaerobictreatmentfor4h0.2251.214真空厭氧8hVacuumanaerobictreatmentfor8h0.2611.453

3結(jié)論與討論

高等植物中GABA的合成主要由L-谷氨酸脫羧而來，這一反應(yīng)由L-谷氨酸脫羧酶催化。研究表明，厭氧處理可激活L-谷氨酸脫羧酶的活性[5]，進(jìn)而可間接增加植物中GABA的含量。從該試驗(yàn)結(jié)果可以看出，未厭氧處理桑葉中GABA含量為0.915 mg/g，這與夏玉玲等報(bào)道的目前生產(chǎn)上主要栽培的23個(gè)桑樹品種的GABA含量基本一致[1]。其他文獻(xiàn)報(bào)道桑葉中GAGA的含量(2.260 mg/g干重)[6-7]，而該研究中桑葉GABA的含量明顯偏低，原因可能與桑葉品種、樹齡、采摘季節(jié)等因素有關(guān)系。該研究顯示，真空厭氧處理8 h時(shí)桑葉中GABA的含量為1.453 mg/g，CO2厭氧處理4 h時(shí)桑葉中GABA的含量為1.214 mg/g，表明這2種厭氧處理均可增加L-谷氨酸脫羧酶的活性，進(jìn)而顯著增加桑葉中的GABA含量。

有研究指出，當(dāng)植物受到厭氧、冷激和機(jī)械傷害等逆境條件時(shí)，體內(nèi)GABA 含量將顯著增加，其中以低氧厭氧逆境效果最佳[5]。該研究中CO2厭氧條件下，桑葉中GABA含量先增加后減小，可能與CO2厭氧產(chǎn)氣袋吸收密封罐中O2，釋放CO2過程中，早期尚有低濃度O2有關(guān)。低氧脅迫條件下，植物通過磷酸戊糖途徑減少有毒物質(zhì)的積累，生成谷氨酸和GABA以抵御逆境脅迫，調(diào)節(jié)細(xì)胞酸度，在此條件下，谷氨酸脫羧酶活性得到激活，促使谷氨酸向GABA的轉(zhuǎn)化[8]。而真

空厭氧條件下，桑葉中GABA含量呈現(xiàn)先減少后增加再減少的趨勢(shì)，則可能與真空包裝袋中缺氧、低壓、無氧呼吸代謝等諸多因素有關(guān)。林智等研究發(fā)現(xiàn)，采用真空或CO2處理普通茶，對(duì)增加茶葉中GABA含量的效果明顯優(yōu)于N3厭氧處理，其中真空處理最優(yōu)，最佳條件為：真空、25 ℃、8 h[9]。綜合比較可以看出，利用CO2厭氧產(chǎn)氣袋吸收密封罐中O2，能較快地提高桑葉中GABA含量；而通過真空包裝袋抽真空造成厭氧環(huán)境的處理方式，提高桑葉中GABA含量則可能需要更長(zhǎng)的時(shí)間，但其提高潛力優(yōu)于CO2厭氧處理。

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基金項(xiàng)目國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201310517007)；2014年度湖北省本科高?！皩I(yè)綜合改革”試點(diǎn)項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介龔鑠(1994- )，男，湖北恩施人，本科生，專業(yè)：生物工程。*通訊作者，副教授，博士，從事天然產(chǎn)物開發(fā)研究。

收稿日期2016-04-25

中圖分類號(hào)S 888.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)15-071-02

Effects of Anaerobic Treatment on GABA Content in Mulberry Leaves

GONG Shuo, ZHOU Fang-zhen*

(School of Biological Science and Technology, Hubei University for Nationalities, Enshi, Hubei 445000)

Abstract[Objective] To research the effects of anaerobic treatment on GABA content in mulberry leaves, and to provide references for the development and utilization of functional components in mulberry leaves. [Method] Fresh leaves of mulberry were processed by CO2 anaerobic treatment and vacuum anaerobic treatment. After mulberry leaves were fixed, dried and shattered, acetone and AlCl3 were used to eliminate the pigments effectively. GABA content in mulberry leaves was detected by spectrophotometry method. [Result] GABA content in mulberry leaves without anaerobic treatment was 0.915 mg/g; while after CO2 anaerobic treatment for 4 h, GABA content reached the maximum value of 1.214 mg/g. After vacuum anaerobic treatment for 8 h, GABA content reached the maximum value of 1.453 mg/g. [Conclusion] CO2 anaerobic treatment and vacuum anaerobic treatment in a given time can both significantly enhance the GABA content in mulberry leaves. And vacuum anaerobic treatment make a GABA content more than CO2 anaerobic treatment..

Key wordsMulberry leaf; GABA; Anaerobic treatment