分子印跡預處理在紅霉素檢測中的應用研究

胡 琪，姚衛(wèi)蓉，謝云飛，2*　(.江南大學食品學院，江蘇無錫 2422；2.江蘇康之源糧油有限公司，江蘇宿遷 223600)

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分子印跡預處理在紅霉素檢測中的應用研究

胡 琪1，姚衛(wèi)蓉1，謝云飛1，2*(1.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122；2.江蘇康之源糧油有限公司，江蘇宿遷 223600)

摘要[目的]建立1種在實際樣品中快速檢測殘留紅霉素的方法。[方法]采用沉淀聚合法制備紅霉素分子印跡聚合物，考察了不同分散相對分子印跡聚合物制備及其對吸附性能的影響，并通過Scatchard模型進一步評價了聚合物的吸附特性，探究了紅霉素分子印跡聚合物在其結(jié)構(gòu)類似物及實際食品樣品中常見抗生素的吸附特異性，并對牛奶和雞蛋樣品進行了加標回收試驗。[結(jié)果]當模板分子、功能單體、交聯(lián)劑的比例為1∶4∶20時，印跡聚合物的吸附性能最好，印跡因子能達到3.45，該方法制得的印跡聚合物達到吸附平衡的時間只需要5 h，平衡時的吸附量達到56 μg/g，大大縮短了沉淀聚合法制得的聚合物所需的平衡時間。在實際樣品中的平均回收率為82.99%～98.09%。[結(jié)論]該研究為紅霉素的快速檢測提供了新方法，簡化了檢測步驟，提高了檢測效率，具有廣闊的應用前景。

關鍵詞紅霉素；分子印跡；富集特異性

紅霉素(Erythromycin，EM)屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，對耐青霉素金黃葡萄球菌及其他敏感菌所致的各種感染有一定的療效，是1種我國常用的獸藥。但是，由于紅霉素在動物體內(nèi)代謝時間較長，過量使用將會導致動物體內(nèi)的藥物殘留[1]。人在食用紅霉素后，可能會引起胃腸道反應和過敏反應，嚴重時將引起肝臟損傷，出現(xiàn)黃疸等，對人類的健康造成嚴重威脅[2]。目前，世界各國規(guī)定大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在動物性食品中的允許殘留最大值為40～1 500 μg/kg[3]，因此食品中紅霉素的殘留檢測顯得尤為重要。目前紅霉素的檢測方法主要有液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用和毛細管電泳法等，但這些檢測方法通常存在價格昂貴、操作復雜、檢測周期較長等缺點。

分子印跡技術是用化學方法制備的對目標分子具有特異性識別能力的聚合材料[4]，這種聚合材料被稱為分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymer， MIP)。MIP對目標分子有“記憶”功能，具有選擇性好和靈敏度高等特點，已在蛋白質(zhì)的提取分離、藥物分析、環(huán)境污染物的去除與檢測以及食品安全檢測等領域中顯示出良好的應用前景。目前的聚合方法主要有本體聚合法[5]、分散聚合法[6]、懸浮聚合法[7]、原位聚合法[8]以及沉淀聚合法[9]。沉淀聚合法存在制備簡單、成本低、印跡效果好等特點，而其他的聚合方法存在著費時、產(chǎn)率低、制備過程復雜等缺點。

近年來，分子印跡技術被越來越多地應用在抗生素檢測中，作為樣品富集的手段與固相萃取[10]或者高效液相色譜聯(lián)用[11]來測定食品中抗生素的殘留限量。Sun等[12]制備了新的氟喹諾酮類假分子印跡聚合物，將其作為高選擇性吸附劑，并通過配備有熒光檢測器的高效液相色譜對魚樣品中氟喹諾酮類藥物進行分析，回收率達到64.4%～102.7%，精度(相對標準偏差)為1.7%～8.5%。Ji等[13]研究了制備氨基糖甙類抗生素(AA)-選擇性分子印跡聚合物固相萃取，通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法有效確定蜂蜜樣品中4個模型氨基酸的殘基，回收率達到90%～110%。

目前，已有用沉淀聚合法制備紅霉素分子印跡聚合物的少量報道，但該些研究中制備的紅霉素分子印跡聚合物達到吸附平衡的時間較長，需要18 h，不能滿足快速檢測預處理的要求[14]。筆者采用沉淀聚合法制備紅霉素分子印跡聚合物，通過對聚合物制備條件和吸附條件的優(yōu)化，以達到減少聚合物吸附平衡時間的目的，并將制備的聚合物與紫外-可見光譜檢測相結(jié)合，旨在建立1種在實際樣品中快速檢測殘留紅霉素的方法，為其現(xiàn)場快速篩查提供可選技術。

1材料與方法

1.1試驗材料紅霉素(EM)、四環(huán)素鹽酸鹽(TC)、氯霉素(CAP)，純度均為98%，購自梯希愛上海公司；琥乙紅霉素(EES)、羅紅霉素(ROX)，純度均為98%，購自百靈威公司；頭孢拉定(CEP)，純度98%，購自Sigma公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、偶氮二異丁腈(AIBN)，純度均為99%，購自百靈威公司；甲基丙烯酸(MAA)、甲醇、冰醋酸、乙酸乙酯、正己烷均購自上海國藥集團。

1.2紅霉素分子印跡聚合物的制備采用沉淀法制備分子印跡聚合物。稱取0.1 mmol紅霉素標準品，加入3 mL甲醇/乙腈(體積比為2∶3)，溶解后再加入一定量的MAA，室溫靜置1 h，使紅霉素與MAA通過氫鍵和靜電力充分作用，然后再加入2 mmol EGDMA和20 mg AIBN，超聲15 min后通氮氣除氧10 min，密封后置于60 ℃水浴鍋中反應24 h。反應結(jié)束后用甲醇/醋酸溶液(體積比為9∶1)洗滌至無模板分子，再用甲醇洗滌至無醋酸殘留，真空干燥至恒重后備用。

同時，制備非印跡聚合物(Non-imprinting polymer， NIP)作為空白對照，NIP的制備除了不加入模板分子外，其余同上。

1.3實際樣品的預處理將加標后的牛奶和雞蛋清樣品進行脫脂處理，并在0～500 μg/mL的檢測范圍內(nèi)繪制樣品中紅霉素的標準工作曲線。取處理后的樣品4 mL，分別加入到25 mg MIP與NIP中，靜置5 h后，3 000 r/min離心10 min，保留上清液，備用。同一加標水平重復3次(n=3)，取平均值，計算回收率。

2結(jié)果與分析

2.1紅霉素分子印跡聚合物的制備及印跡效果評價選用MAA為功能單體，以EGDMA為交聯(lián)劑，以AIBN為引發(fā)劑，采用沉淀聚合法制備紅霉素分子印跡聚合物，并考察了不同分散相對分子印跡聚合物制備及吸附性能的影響。Li等[15]研究表明模板分子與交聯(lián)劑的最佳比例為1∶20，所以選擇先在此比例下對MAA的最佳用量進行探究。由表1可知，當EM與MAA比例為1∶4時，印跡因子最大，印跡效果最好。

表1　模板分子與功能單體摩爾比對印跡效果的影響

注：印跡因子=MIP吸附容量/ NIP吸附容量

Note: Imprinting factor=MIP adsorption capacity/adsorption capacity.

當確定功能單體的用量后，對交聯(lián)劑EGDMA的最佳使用量進行探究。由表2可知，當EM與EGDMA的比例為1∶20時，印跡效果最好。

由表1和表2可知，當EM∶MAA∶EGDMA為1∶4∶20時，

表2　模板分子與交聯(lián)劑摩爾比對印跡效果的影響

分子印跡聚合物的吸附性能最好。在此比例下，MIP的吸附量最大，NIP的吸附量也相對較小，印跡因子值能達到3.45。因此，選擇EM∶MAA∶EGDMA的最佳比例為1∶4∶20來制備紅霉素分子印跡聚合物。

2.2紅霉素分子印跡聚合物的表征通過掃描電子顯微鏡觀察MIP與NIP的表觀形貌。從圖1可以看出，制備的MIP是一種蜂窩狀的高度交聯(lián)的聚合物，與NIP相比，MIP的表面孔隙較多，立體效果更加明顯。MIP的印跡效果明顯優(yōu)于NIP，可能是因為MIP表面凹凸不平，具有更大的比表面積，并且在這些凹凸不平的空穴中含有更多能與目標分子結(jié)合的印跡位點，加強了其對紅霉素的吸附，增強了其對紅霉素的印跡效果。

注：a為MIP掃描電鏡圖，b為NIP掃描電鏡圖。Note: a. MIP SEM; b. NIP SEM. 圖1　MIP與NIP掃描電鏡觀察結(jié)果(20 000×)Fig.1　SEM observation results of MIP and NIP(20 000×)

圖2　不同溶劑對印跡聚合物印跡效果的影響Fig.2　Effect of the different solvents on imprinting performance

圖3　MIP與NIP的等溫吸附曲線Fig.3　Static equilibrium adsorption isotherms of MIP and NIP nanoparticles

2.3紅霉素分子印跡聚合物吸附溶劑的選擇為了考察紅霉素分子印跡聚合物在不同溶劑中對紅霉素的吸附效果，對MIP吸附時使用的溶劑進行了研究，在紅霉素的水溶液、乙醇溶液、甲醇溶液以及不同比例的甲醇水溶液中對比MIP對EM的吸附效果。從圖2可以看出，將水或甲醇∶水(體積比1∶9)為溶劑，NIP的吸附量很大，聚合物在此溶劑中表現(xiàn)出很強的非特異性吸附，不宜被選作吸附溶劑；當溶劑分別為甲醇、乙醇、甲醇∶水(體積比8∶2)或者甲醇∶水(體積比9∶1)時，雖然NIP的非特異性吸附不大，但MIP的吸附量也相對較小，也不宜被選為吸附溶劑；當以甲醇∶水(體積比2∶8)為溶劑時，NIP的吸附量不大，而MIP的吸附量則相對較大，此時聚合物的IF值最大。因此，采用甲醇∶水(體積比2∶8)作為吸附溶劑來測定紅霉素分子印跡聚合物的吸附性能。2.4紅霉素分子印跡聚合物的靜態(tài)吸附性能利用靜態(tài)吸附研究分子印跡聚合物的吸附特性。當紅霉素濃度為100～1 000 μg/mL時，比較了MIP和NIP的吸附效果。從圖3可以看出，當紅霉素濃度為100～1 000 mg/mL時，MIP和NIP對EM的吸附量都隨著EM濃度的增加而增大，并且在相同濃度下MIP的吸附量遠遠大于NIP的吸附量。這表明制備的紅霉素分子印跡聚合物對紅霉素有較好的印跡效果。這主要是因為MIP中存在與EM結(jié)合的功能基團，并且有與EM立體結(jié)構(gòu)互補的特定形狀的空穴，使MIP具有“記憶”功能，從而對紅霉素有特異性吸附能力，而NIP對EM的吸附則主要是非特異性物理吸附。

一般采用Scatchard方程[16]對分子印跡聚合物的結(jié)合特性和吸附性能進行分析，其模型可以簡化為Q/C=(Qmax-Q)/Kd。式中，Q表示印跡聚合物達到平衡時的吸附量，Qmax為結(jié)合位點的飽和吸附量，而Kd表示吸附達到平衡時的解離常數(shù)。將聚合物靜態(tài)吸附數(shù)據(jù)進行整理，以Q/C對Q作圖，得到直線的斜率及截距為Kd和Qmax。

從圖4可以看出，直線線性較好，回歸方程為Q/C=-0.001 59Q-0.793 27，求得聚合物的解離常數(shù)Kd=628.93 μg/mL，飽和吸附容量為Qmax=498.91 μg/g。這說明在試驗濃度范圍內(nèi)，印跡聚合物對紅霉素呈現(xiàn)均勻的親和力，間接證實了印跡聚合物對紅霉素的識別是在一定大小的空穴中進行的。該試驗結(jié)果表明合成的印跡聚合物對紅霉素具有一定的結(jié)合能力，聚合過程中形成了較為顯著的空穴結(jié)合位點。

圖4　MIP的Scatchard方程分析Fig.4　The Scatchard equation analysis chart of MIPs

2.5紅霉素分子印跡聚合物的動態(tài)吸附性能從圖5可以看出，紅霉素分子印跡聚合物對紅霉素的吸附在5 h左右達到吸附平衡，平衡時的吸附量為56 μg/g，遠大于空白對照NIP的吸附量(約24 μg/g)。

圖5　MIP與NIP的吸附動力學曲線Fig.5　Adsorption kinetics curves of MIP and NIP nanoparticles

從圖5可以看出，前300 min內(nèi)，MIP對紅霉素的吸附量隨著時間的增加而迅速增加，300 min左右達到吸附平衡。這是由于在吸附開始之初聚合物表面有大量空穴，吸附紅霉素的傳質(zhì)阻力小，所以吸附速度較快，而隨著越來越多的紅霉素分子被吸附，聚合物表面的空穴被結(jié)合并達到飽和，紅霉素分子向MIP內(nèi)部的深孔傳質(zhì)，阻力增大，吸附速度明顯下降，并最終達到飽和，此時吸附量將不再隨著時間的變化而變化。NIP由于沒有特異性的結(jié)合空穴，只有表面的物理吸附，所以在120 min左右就能達到吸附平衡。

2.6紅霉素分子印跡聚合物吸附特異性為進一步考察紅

霉素分子印跡聚合物的吸附特異性，選擇紅霉素的結(jié)構(gòu)類似物羅紅霉素和琥乙紅霉素以及在實際食品體系中常見的四環(huán)素、氯霉素和頭孢拉定來進行驗證。從圖6可以看出，制備的MIP對紅霉素具有較強的印跡效果，而對其結(jié)構(gòu)類似物羅紅霉素和琥乙紅霉素的印跡效果較弱，這是因為制備的紅霉素分子印跡聚合物中具有與模板分子的空間結(jié)構(gòu)和官能基團結(jié)合位點互補的孔穴，而這些空穴能夠很好地與紅霉素發(fā)生親和作用。MIP對氯霉素、四環(huán)素和頭孢拉定無明顯吸附，是因為其主要依靠非特異性吸附發(fā)生作用。由此可見，將制備的MIP用于實際樣品檢測時，不易受到食品體系中其他常見抗生素的干擾。

圖6　印跡聚合物的吸附特異性研究Fig.6　Adsorption specificity of the imprinted polymer

2.7實際樣品的檢測測定實際樣品中紅霉素的工作曲線，得到牛奶樣品中的標準曲線為y=0.001 95x+0.034 29(R2=0.999 22)；雞蛋樣品中的標準工作曲線為y=0.001 48x+0.052 07(R2=0.997 95)。由此可見，經(jīng)過預處理的實際樣品中的紅霉素在0～500 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關系良好，可用于樣品的定量檢測。在50、100、250和500 μg/mL 4個濃度水平上分別進行加標回收試驗。由表3可知，用紅霉素分子印跡聚合物結(jié)合紫外檢測的方法來測定牛奶和雞蛋中殘留紅霉素的回收率，牛奶中紅霉素的回收率為82.74%～94.97%，而雞蛋中紅霉素的回收率為88.40%～97.80%。

表3　實際樣品中紅霉素萃取試驗(n=3)

3結(jié)論

該研究采用沉淀聚合法制備紅霉素分子印跡聚合物，通過考察不同比例的模板分子與功能單體及交聯(lián)劑組成對分子印跡聚合物印跡效果的影響，確定在模板分子與功能單體比例為1∶4∶20時，分子印跡聚合物的印跡效果最好，印跡因子能達到3.45。對合成的紅霉素分子印跡聚合物進行吸附性能研究，得出此聚合物能在5 h左右達到吸附平衡，大大減

少了平衡時間。通過Scatchard模型來評價MIP的吸附特性，比較了紅霉素分子印跡聚合物在其結(jié)構(gòu)類似物以及食品中常見抗生素中的印跡效果，顯示出此方法制備的聚合物對紅霉素有較好的特異性吸附能力。該研究建立了一種在實際樣品中快速檢測殘留紅霉素的方法，該方法結(jié)合分子印跡聚合物的富集特異性以及紫外光譜檢測快速高效的特點，在牛奶和雞蛋的實際食品樣品檢測中得到了較好的檢測效果，在紅霉素檢測相關研究中有重要意義，具有廣闊的應用前景。

參考文獻

[1] 張志剛.動物性食品中獸藥殘留的原因分析及對策[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2008(13):300-301.

[2] 何方洋,郗日沫,萬宇平,等.紅霉素藥物殘留檢測技術的研究進展[J].四川畜牧獸醫(yī),2010,37(3):31-33.

[3] LEAL C,CODONY R,COMPAR,et al.Determination of macrolide antibiotics by liquid chromatography[J].Journal of chromatography A,2001,910(2):285-90.

[4] YANG Y Z,LIU X G,XU B S.Recent advances in molecular imprinting technology: Current status,challenges and highlighted applications[J].Chemical Society reviews,2011,40(5):2922-2942.

[5] UEKAMA K,HIRAYAMA F,IRIE T.Chemlnform abstract: Cyclodextrin drug carrier systems[J].Cheminform,1998,29(39):2045-2076.

[6] BRESLOW R,DONG S D.ChemInform abstract: Biomimetic reactions catalyzed by cyclodextrins and their derivatives[J].Chemical reviews,1998,98(5):1997-2012.

[7] HAN X,ZHONG Q,YUE D,et al.Separation of enantiomers of isochromene derivatives by HPLC using cyclodextrin-based stationary phases[J].Chromatographia,2005,61(5):205-211.

[8] 陳慧,王琴孫.環(huán)糊精類高效液相色譜固定相的研究進展[J].色譜,1999(6):533-538.

[9] GATTUSO G,NEPOGODIEV S A,STODDART J F.Synthetic cyclic oligosaccharides[J].Chemical reviews,1998,98(5):1919-1958.

[10] GIOVANNOLI C,ANFOSSI L,BIAGIOLI F,et al.Solid phase extraction of penicillins from milk by using sacrificial silica beads as a support for a molecular imprint[J].Microchimica acta,2013,180(15/16):1371-1377.

[11] TANG W J,ZHAO T,ZHOU C H,et al.Preparation of hollow molecular imprinting polymer for determination of ofloxacin in milk[J].Analytical methods,2014,6(10):3309-3315.

[12] SUN X,WANG J,LI Y,et al.Novel dummy molecularly imprinted polymers for matrix solid-phase dispersion extraction of eight fluoroquinolones from fish samples[J].Journal of chromatography A,2014,1359(15):1-7.

[13] JI S,ZHANG F,XI L,et al.Synthesis of molecularly imprinted polymer sorbents and application for the determination of aminoglycosides antibiotics in honey[J].Journal of chromatography A,2013,1313(19):113-118.

[14] Song S,Wu A,Shi X,et al.Development and application of molecularly imprinted polymers as solid-phase sorbents for erythromycin extraction[J].Analytical & bioanalytical chemistry,2013,3(8):42-68.

[15] LI H,GONG G L,CHEN S.Preparation and evaluation of molecular imprinted polymers of erythromycin[J].Key engineering materials,2012,561(3):1009-1015.

[16] SERENA A,SELIM B,KARSTEN H,et al.Solid-phase synthesis of molecularly imprinted nanoparticles for protein recognition[J].Chemical communications,2013,49(60):6746-6748.

基金項目國家自然科學基金項目(21203076)；江蘇省雙創(chuàng)人才計劃項目。

作者簡介胡琪(1990- )，女，四川綿陽人，碩士研究生，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制。*通訊作者，副教授，博士，碩士生導師，從事食品安全檢測工作。

收稿日期2016-04-13

中圖分類號S 851.34+7

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)15-001-04

Research on Application of Molecular Imprinting Pre-treatment in Erythromycin Detection

HU Qi1, YAO Wei-rong1, XIE Yun-fei1,2*

(1. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122; 2. Jiangsu Kangzhiyuan Grain and Oil Co. Ltd., Suqian, Jiangsu 223600)

Abstract[Objective]The aim was to establish a method for rapid detection of erythromycin in samples. [Method] Based on the precipitation method to prepare the molecularly imprinted polymer(MIP), the effects of different dispersed phases on preparation and adsorption properties of MIP were investigated. The adsorption properties of the polymer was further evaluated by Scatchard model. The erythromycin MIP adsorption specific in its structural analogs as well as common antibiotics in actual food samples were explored and the spiked recovery experiments with milk and egg samples were conducted. [Result] The results showed that when the ratio of template molecule, functional monomer and cross linking agent was 1∶4∶20, the adsorption properties of MIP was the best and the imprinting factor could reach 3.45. The imprinted polymer which obtained by this method reached the adsorption equilibrium only need 5 h, and the maximum adsorption capacity could reach 56 μg/g, greatly reducing the polymer balanced time. The average recovery ratio in milk and egg samples could reach 82.99%-98.09%. [Conclusion] This study provides a new method for rapid detection of erythromycin, simplifies the detection steps and improves the detection efficiency. This new method has broad application prospects．

Key wordsErythromycin; Molecular imprinting; Enrichment specific