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    載5-氟尿嘧啶殼聚糖/明膠微粒的制備及藥物釋放性能

    2016-07-26 09:52:51賀寶元張寶艷李珊薛海燕陜西科技大學資源與環(huán)境學院陜西西安700陜西科技大學食品與生物工程學院陜西西安700
    化工進展 2016年7期
    關鍵詞:釋藥載藥氟尿嘧啶

    賀寶元,張寶艷,李珊,薛海燕(陜西科技大學資源與環(huán)境學院,陜西 西安700;陜西科技大學食品與生物工程學院,陜西 西安 700)

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    研究開發(fā)

    載5-氟尿嘧啶殼聚糖/明膠微粒的制備及藥物釋放性能

    賀寶元1,張寶艷2,李珊2,薛海燕2
    (1陜西科技大學資源與環(huán)境學院,陜西 西安710021;2陜西科技大學食品與生物工程學院,陜西 西安 710021)

    摘要:殼聚糖及明膠是生物相容性良好的高分子藥物載體,制備載5-氟尿嘧啶殼聚糖/明膠微粒,并進行體外釋藥研究。以石蠟油為外相,殼聚糖/明膠為內相,用乳化交聯(lián)法制備微粒,以吸附藥量為指標,采用正交設計實驗優(yōu)化獲得最佳制備條件,用紅外光譜、SEM對最佳條件下制備的微粒進行表征。結果表明殼聚糖/明膠微粒的最佳制備條件如下:水油比1∶7,殼聚糖/明膠濃度比1∶3,乳化劑100.7mmol/L,乳化5min,乳化溫度60℃,交聯(lián)劑戊二醛用量5.5mmol/L,交聯(lián)時間1h。在此條件下,載藥微粒的載藥量為34.93%,包封率為38.36%。紅外光譜圖表明殼聚糖/明膠微粒已負載5-氟尿嘧啶,SEM表明微粒成球狀,表面較光滑。模擬胃腸釋放表明,微粒具有一定的緩釋性能。采用乳化交聯(lián)法制備載5-氟尿嘧啶殼聚糖/明膠微粒方法簡單,重現性好,且其體外釋放實驗顯示出明顯的緩釋作用。

    關鍵詞:制備;優(yōu)化設計;載體;殼聚糖;明膠;5-氟尿嘧啶;體外釋藥

    5-氟尿嘧啶是一種抗癌藥物,用于消化道惡性腫瘤的治療。目前已證實5-氟尿嘧啶對人舌鱗癌ca8113中腫瘤干細胞具有富集作用[1]。但由于5-氟尿嘧啶的血漿半衰期非常短,僅為10~20min,需要頻繁給藥,而且對人體毒副作用大[2]。近年來高分子載藥微球新劑型發(fā)展迅速,包囊后可提高藥物的生物利用率和生物穩(wěn)定性。明膠具有良好的水溶性、無毒、無抗原等特點,被應用于藥物載體,但是其質脆,難以成膜,不耐水,潮濕環(huán)境中易受細菌侵蝕而變質[3],殼聚糖具有良好的生物相容性及抗菌防腐的功能[4]。將殼聚糖和明膠共混,可以使兩種材料的生理功能協(xié)同增效以及材料自身的理化性質得以改善[5]。本研究以石蠟油為外相、殼聚糖/明膠為內相,采用乳化交聯(lián)法制備殼聚糖/明膠載5-氟尿嘧啶的微粒,以吸附藥量為指標,正交試驗優(yōu)化制備工藝條件,并且對載藥微粒的體外釋藥性能進行研究。

    1 材 料

    明膠,藥用,天津市天力化學試劑有限公司;殼聚糖,90%脫乙酰度,浙江金殼藥業(yè)有限公司;Span-80,化學純,天津市福晨化學試劑廠;5-氟尿嘧啶,98%純品,上海源葉生物科技有限公司;5-氟尿嘧啶標準品,國家藥品標準物質,中國食品藥品檢定研究院;磷酸氫二鈉,分析純,天津市紅巖化學試劑廠;蒸餾水,食品級,西安哇哈哈桶裝水有限公司;氯化鈉,分析純,天津市河東區(qū)紅巖試劑廠;磷酸二氫鉀,分析純,天津市河東區(qū)紅巖試劑廠;其余試劑均為分析純,天津市天力化學試劑有限公司。

    HH系列數顯恒溫水浴鍋,金壇市科析儀器有限公司;精密增力電動攪拌器,常州國華電器有限公司;電子天平,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;752型紫外分光光度計,上海光譜儀器有限公司;101-2A型電熱鼓風干燥箱,天津市泰斯特儀器有限公司;SC-3610低速離心機,科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;SHB-3型循壞水多用真空泵,鄭州杜甫儀器廠;倒置顯微鏡;恒溫震蕩器;VERTEX80傅里葉變換紅外光譜儀,德國布魯克公司;掃描電子顯微鏡,荷蘭FEI。

    2 方 法

    2.1 載藥微粒的制備

    稱取一定量的 5-氟尿嘧啶溶于殼聚糖的3%乙酸溶液,與明膠溶液混合,用該混合液作為水相。量取油相液體石蠟和表面活性劑span-80加入到三口燒瓶中,在60℃水浴恒溫中均勻攪拌,20min后,再滴加入水相,乳化至顯微鏡下液滴均勻穩(wěn)定,使溫度達到15℃以下,加入一定量戊二醛(50%)固化微球。產物在1000r/min下離心15min,去除上層油相,用異丙醇、丙酮分別潤洗3次,抽濾真空干燥即得到載藥微粒[6]。

    2.2 5-氟尿嘧啶標準曲線的測定

    精密稱取5-氟尿嘧啶對照品2.5mg,用0.1mol/L的鹽酸溶液溶解,稀釋定容50 mL,吸取0.75mL、1.0mL、1.25mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL于 10mL容量瓶中,用0.1mol/L的鹽酸溶液定容,以0.1mol/L的鹽酸溶液做空白,在265nm處用石英比色皿測定吸光度,經線性擬合得到標準曲線方程[7]。

    2.3 殼聚糖/明膠微粒最佳制備條件的正交試驗優(yōu)化

    水油比過大時分散在油相中的液滴增多,液滴之間的油層隔膜相對變薄,攪拌時容易打碎隔膜,制備的微粒相互之間發(fā)生碰撞,容易發(fā)生團聚和粘連,粒徑分布不均勻的現象;水油比過小時,黏度太大,會使載藥量和包封率下降且成本高。乳化時間太短反應不充分,但是乳化時間太長會使乳液黏度逐漸下降,不利于包載藥物。殼聚糖/明膠的濃度比直接影響到微粒壁的厚度從而影響包封率和載藥量,所以對微粒制備工藝條件影響比較大的因素水油比(A)、乳化時間(B)和殼聚糖/明膠濃度比(C)3個因素,每個因素做3水平,采用L9(34)正交試驗以吸附藥量作為評價指標,優(yōu)化制備條件,其中戊二醛用量 5.5mmol/L,交聯(lián)時間 1h,表面活性劑span-80用量100.7mmol/L。

    2.4 載藥量和包封率測定

    精密稱取 20 mg載藥微粒于燒杯中,加入0.1mol/L鹽酸溶液 20mL,在 60℃水浴中充分反應[8],過濾,吸取濾液0.5mL用0.1mol/L鹽酸溶液定容至5mL,在265nm處測定吸光度,根據5-氟尿嘧啶標準曲線計算濃度。

    載藥量和包封率按式(1)、式(2)計算。

    2.5 顯微鏡和SEM檢測

    在最佳指標條件下,取乳化結束后的乳液滴加至載玻片上,使其分布均勻,用倒置顯微鏡觀察。取適量干燥后的微粒噴金處理后用 SEM進行分析檢測。

    2.6 紅外光譜檢測

    用無水酒精清洗瑪瑙碾具,將殼聚糖/明膠微粒與干燥的溴化鉀混合,載藥微粒和干燥的溴化鉀混合,分別研細后壓片,用傅里葉紅外色譜儀在400~4000cm–1處測樣[9]。

    2.7 體外釋藥試驗方法

    2.7.1 人工胃液的配制

    取10g胃蛋白酶溶于500mL水中,加鹽酸調節(jié)pH為1.2左右,加入2gNaCl,將溶液稀釋至1000mL制成人工胃液[10]。

    2.7.2 PBS溶液中體外釋放度的測定方法

    參照文獻[11]中體外釋放度測定方法,每隔30min取樣10mL,濾除微粒,檢測濾液中藥物濃度,計算累積釋放率。

    2.7.3 模擬人工胃液中體外釋放度的測定方法

    精密稱取10mg載藥微粒,將上述在PBS溶液換成模擬人工胃液,測定模擬人工胃液體外的釋放度。取樣同上。

    3 結果與分析

    3.1 5-氟尿嘧啶的檢測標準曲線

    采用紫外吸收法測定5-氟尿嘧啶,制作標準曲線。用測得的吸光度對濃度回歸,作標準曲線和計算回歸方程。結果如圖1所示。由圖1可以看出,5-氟尿嘧啶標準曲線線性回歸方程為y=0.0645x-0.0044,R2=0.9991,5-氟尿嘧啶在 3~15μg之間有良好的線性關系。

    3.2 正交設計優(yōu)化載藥微粒制備工藝

    對載藥微粒的制備工藝條件進行正交試驗優(yōu)化。正交試驗結果如表1所示。

    以吸附藥量為評判標準,由表1正交試驗結果可知,水油比(A)、乳化時間(B)和殼聚糖/明膠濃度比(C)3個因素的對載藥量的影響R2>R3>R1,因此在微粒的制備過程中,影響因素最大的是乳化時間,其次是殼聚糖/明膠濃度比,最后影響因素最小的是水油比。試驗最佳組合為A1B1C2,根據影響因素的大小和成本確定工藝條件:水油比1∶7,乳化時間5min,殼聚糖/明膠濃度比1∶3,乳化溫度60℃,戊二醛用量5.5mmol/L,交聯(lián)時間1h,表面活性劑用量100.7mmol/L。經驗證,在此條件下,載藥微粒的載藥量為6.986mg,制備的載藥微粒載藥量為34.93%,包封率為38.36%。

    圖1 5-氟尿嘧啶的檢測標準曲線

    表1 載藥微球制備最佳工藝條件正交試驗結果

    3.3 載藥乳液和SEM微粒形態(tài)

    用倒置顯微鏡觀察乳液形態(tài),如圖2(a)所示。用電子掃描顯微鏡對載藥微粒進行形態(tài)觀察,如圖2(b)所示。

    由圖2(a)可以看出,載藥乳液表面光滑,相對比較均勻,成球狀。由圖2(b)可看出載藥微粒成球狀,形態(tài)比較均勻,表面光滑。

    圖2 載藥乳液及載藥乳液的形態(tài)

    3.4 5-氟尿嘧啶以及載藥微粒的紅外圖譜分析

    5-氟尿嘧啶的紅外圖譜如圖3(a),殼聚糖/明膠微粒及載藥微粒的紅外圖譜如圖3(b)所示。

    由圖 3(a)所示 5-氟尿嘧啶的 IR譜中3068.57cm–1為 C=C 的伸縮振動吸收峰,1662.01cm–1為 C=O 的伸縮振動吸收峰,1430.92cm–1為—CF—CH—中的C—H的面內彎曲振動,877.55cm–1—CF—CH—中的C—H的面外彎曲振動吸收峰,814.06cm–1和 752.01cm–1為—CF—CH—中的 C—H 的面外變形振動,1246.71cm–1為C—N的伸縮振動吸收峰。由圖3(b)中載5-氟尿嘧啶殼聚糖/明膠微粒IR譜中存在5-氟尿嘧啶的特征吸收峰[12],例如,1666.65cm–1,C=O 和C=C伸縮振動的重合吸收峰;1450.47cm–1,—CF—CH—中的 C—H的面內彎曲振動;1244.95cm–1,C—N伸縮振動。在901.77cm–1處出現了5-氟尿嘧啶中的—CF—CH—中的C—H的面外彎曲振動藍移的吸收峰,這說明了5-氟尿嘧啶經殼聚糖包裹后,殼聚糖削弱了5-氟尿嘧啶分子之間的作用力,使吸收峰紅移。殼聚糖明膠微粒的特征吸收峰出現在1666.65cm–1,C=O伸縮振動,1539.65cm–1,C=N伸縮振動,這是殼聚糖明膠被戊二醛交聯(lián)后所形成的席夫堿的特征結構,1405.67cm–1,—CH2—彎曲振動,1076.01cm–1和1033.34cm–1,殼聚糖吡喃環(huán)中C—H的彎曲振動[9]。因此,由紅外光譜可知,載藥微粒中存在5-氟尿嘧啶。

    圖3 5-氟尿嘧啶及殼聚糖/明膠微粒與載藥微粒的紅外圖譜

    3.5 載藥微粒的體外釋藥分析

    3.5.1 載藥微粒在PBS溶液中的釋藥分析

    載藥微粒在PBS溶液中的累積釋放曲線如圖4所示。

    圖4 載藥微粒在PBS溶液中的累積釋放曲線

    由圖4可知,載藥微粒的釋藥前期出現了一定程度的突釋現象。在5h時,累積釋藥量達到70%,其主要原因可能是由于殼聚糖主鏈的疏水作用和5-氟尿嘧啶的親水作用,使鏈狀殼聚糖5-氟尿嘧啶在水溶液中有自聚成團的趨勢,這樣就導致親水性的藥物部分在團外,有利于藥物分子的滲透和擴散[13]。另外,5-氟尿嘧啶本身的水溶性也有利于自身的溶解作用。因此,在前10h表現為一定程度的突釋現象。后階段釋放很緩慢,趨于平緩。這除了受濃度減小的影響外,還有可能與5-氟尿嘧啶與殼聚糖之間的作用力有關。由于5-氟尿嘧啶中的強電負性原子,O、N、F與殼聚糖分子中的—OH氫原子形成了比較強的氫鍵或者 5-氟尿嘧啶中的—NH—中氫原子與殼聚糖分子中的氧原子和氮原子之間形成了氫鍵,從而使5-氟尿嘧啶與殼聚糖之間的結合比較強,5-氟尿嘧啶難從微粒中釋放出來,但是在水分子的不斷作用下,氫鍵被破壞,5-氟尿嘧啶又從微粒中緩慢地釋放出來,直至釋放完全。

    3.5.2 載藥微粒在人工胃液中的釋藥分析

    載藥微粒在人工胃液中的累積釋放曲線如圖 5所示。

    由圖5可知,載藥微粒在pH為1.2的人工胃液中前60min釋放較快,累積釋放量為70%,而后藥物釋放速度較慢,這可能是在強酸環(huán)境中H+與微粒表面的—NH2很快結合形成—NH,使微粒表面較快溶脹并釋放藥物,60min后微粒溶脹速度變緩慢,5-氟尿嘧啶原料藥在 45min內累計釋藥達到了100%[13],因此載藥微粒明顯表現出緩釋現象,6h后藥物累積釋放量接近90%。

    圖5 載藥微粒在模擬人工胃液中的累積釋放曲線

    4 結 論

    采用乳化交聯(lián)法初步制備了 5-氟尿嘧啶殼聚糖/明膠的載藥微粒,通過正交試驗確定了最佳制備工藝條件為:水油比1∶7,殼聚糖與明膠濃度比1∶3,乳化時間 5min,乳化溫度 60℃,戊二醛用量5.5mmol/L,交聯(lián)時間1h,乳化劑用量100.7mmol/L。在此條件下,載藥微粒的載藥量為34.93%,包封率為38.36%。微球在顯微鏡下光滑,均勻。載藥微粒的紅外光譜圖表明殼聚糖負載5-氟尿嘧啶。在PBS緩沖溶液中8h累積釋藥量為80%,在模擬人工胃液中3h累積釋藥量為85%,體外釋藥性能表明微粒具有明顯的緩釋作用,但微囊的體內緩釋效果還有待于進一步用動物試驗驗證。

    參考文獻

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    第一作者:賀寶元(1977—),男,博士,講師,研究方向為生物功能材料開發(fā)。聯(lián)系人:張寶艷,碩士研究生。E-mail zhangbaoyan163@163.com。

    中圖分類號:O 636

    文獻標志碼:A

    文章編號:1000-6613(2016)07-2151-05

    DOI:10.16085/j.issn.1000-6613.2016.07.031 Preparation of 5-fluorouracil loaded chitosan/gelatin particles and its’drug release properties HE Baoyuan1,ZHANG Baoyan2,LI Shan2,XUE Haiyan2

    收稿日期:2015-11-06;修改稿日期:2016-02-04。

    基金項目:國家自然科學基金(31301405)、陜西省科技統(tǒng)籌計劃(2013KTZB02-02-05(2))、西安市科技計劃(CXY1434(4))及陜西省教育廳專項(16JK1088)項目。

    (1School of Resource and Environment,Shaanxi University of Science and Technology,Xi’an 710021,Shaanxi,China;2School of Food and Biological Engineering,Shaanxi University of Science and Technology,Xi’an 710021,Shaanxi,China)

    Abstract :Chitosan and Gelatin are good biocompatible polymers and are suitble for drug carriers.Preparation of 5-fluorouracil loaded chitosan/gelatin particles and in vitro release were performed using emulsion crosslinking method with paraffin oil as external phase and chitosan/gelatin as internal phase,and the optimal formulations were verified by orthogonal design.The drug loading,encapsulation efficiency,the microscopic morphology and release behavior of drug loaded particles in vitro were examined.The optimal preparation conditions were:the ratio of water to oil 1∶7,the ratio of chitosan/gelatin concentration 1∶3,emulsifying time 5min,emulsifying temperature 60℃,glutaraldehyde dosage 5.5mmol/L,reaction time 1h,and emulsifier dosage 100.7mmol/L.Under these conditions,the drug loading of particles was 34.96% and encapsulation efficiency was 38.36%.Infrared spectroscopy showed that chitosan/gelatin microparticles have loaded 5-Fu.Microparticles were spherical with smooth surface.5-Fu can be encapsuoed in chitosan/gelatin by emulsion crosslinking method.This method was simple and reproducible and drug release performance in vitroshowed that the microparticles had obviously sustained release effect.

    Key words:preparation;optimal design;support;chitosan;gelatin;5- fluorouracil;in vitro drug release

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