氨基化二氧化硅熒光微球的制備及其表征

劉清浩，郭金春，蔡宇廷，冷嘉鵬，劉紅彥，陳立功（中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，山西 太原 0005；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，河南 鄭州 45000；天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 0007）

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研究開發(fā)

氨基化二氧化硅熒光微球的制備及其表征

劉清浩1，郭金春1，蔡宇廷1，冷嘉鵬1，劉紅彥2，陳立功3
（1中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，山西 太原 030051；2河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，河南 鄭州 450002；3天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072）

摘要：首先合成了熒光量子產(chǎn)率高的不對(duì)稱羅丹明衍生物，以其為熒光染料，正硅酸乙酯為硅源，在酸性條件下，運(yùn)用包埋法制備了二氧化硅熒光微球。然后采用硅烷偶聯(lián)劑氨丙基三乙氧基硅烷，在二氧化硅熒光微球表面引入氨基功能基團(tuán)。通過(guò)掃描電鏡、熒光顯微鏡、紅外光譜儀、熒光分光光度計(jì)對(duì)氨基化二氧化硅熒光微球的形貌、結(jié)構(gòu)和熒光性能進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，氨基化二氧化硅熒光微球具有良好的單分散性，粒徑分布窄，熒光性能好且穩(wěn)定，并成功的引入氨基基團(tuán)。

關(guān)鍵詞：二氧化硅；制備；有機(jī)化合物；氨基化熒光微球；不對(duì)稱羅丹明衍生物

功能化熒光微球是指微球的表面標(biāo)有熒光物質(zhì)或微球體內(nèi)結(jié)構(gòu)含有熒光物質(zhì)的微球，受到外界能量刺激能激發(fā)出熒光，其載體多為有機(jī)或無(wú)機(jī)聚合物材料。目前，功能化熒光微球以其獨(dú)特的光學(xué)與材料學(xué)性能，在高通量藥物篩選、分子示蹤[1]、免疫檢測(cè)[2]、基因研究[3]等領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。羅丹明熒光染料以其優(yōu)良的光學(xué)性能常用來(lái)制備熒光微球，但本身的斯托克斯位移小，降低了檢測(cè)的分辨率，限制其在許多研究領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用[4]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，羅丹明衍生物的不對(duì)稱結(jié)構(gòu)有利于增加斯托克斯位移[5]。為此，本文設(shè)計(jì)合成出光學(xué)性能優(yōu)異的不對(duì)稱羅丹明衍生物，并將其作為微球的熒光染料。此外，無(wú)機(jī)材料二氧化硅具有許多高分子材料無(wú)法比擬的特性[6]，如物理剛性、化學(xué)穩(wěn)定性、在溶劑中可忽略的溶脹性、無(wú)毒性、膠體穩(wěn)定性、高生物相容性、優(yōu)異的光學(xué)透光性及表面易功能化的特性，尤其是表面氨基化的二氧化硅微球，其活性氨基可以和多種無(wú)機(jī)離子或無(wú)機(jī)、有機(jī)、生物分子發(fā)生反應(yīng)，在生物化學(xué)、分析、催化、工業(yè)和電子學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。因此，本文選用二氧化硅微球作為載體，以不對(duì)稱羅丹明衍生物作為熒光染料，在酸性條件下采用包埋法制備了二氧化硅熒光微球[7-10]。然后以硅烷偶聯(lián)劑氨丙基三乙氧基硅烷（KH-550）為改性劑，在二氧化硅熒光微球表面引入了功能基團(tuán)。本文制備的二氧化硅熒光微球是將熒光物質(zhì)完全包埋在微球內(nèi)部，使其不會(huì)受到任何外部因素的影響，從而保障了微球熒光強(qiáng)度的穩(wěn)定性，很好地解決了物理吸附熒光染料所產(chǎn)生的缺點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SU-500型掃描電子顯微鏡（日本電子）、DM6000-B熒光顯微鏡（德國(guó)Leica）、島津8400S FTIR光譜儀、Cary Eclipse型熒光分光光度計(jì)（美國(guó)Varian公司生產(chǎn)）和UV2450紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津）。

正硅酸乙酯（TEOS，AR）、氨丙基三乙氧基硅烷（KH-550，AR）、冰乙酸（CH3COOH，AR）、甲苯（AR）。

1.2 不對(duì)稱羅丹明衍生物的合成

吡咯烷基酮酸的合成如式(1)。

向裝有電磁攪拌的 100mL四口燒瓶中加入吡咯烷基酚 1.20g（7.36mmol），鄰苯二甲酸酐 1.31g （8.83mmol）和甲苯（40mL）。在N2保護(hù)下，攪拌至部分溶解后升溫回流，反應(yīng) 4h后降溫至 50～60℃，加入w(NaOH)=35%的水溶液7.00mL，在90℃下反應(yīng)6h。將反應(yīng)液倒入70mL水中，緩慢滴入濃鹽酸進(jìn)行酸化至pH < 3，析出黃褐色粉末，靜置2h后抽濾。濾餅先用冷水洗至中性，抽濾，然后用甲醇的水溶液（水∶甲醇= 1∶1，體積比）重結(jié)晶，得淡黃色柱狀晶體，即吡咯烷基酮酸（1.63g，71.35%）。

不對(duì)稱羅丹明衍生物的合成如式(2)。

向裝有電磁攪拌的100mL四口燒瓶中加入吡咯烷基酮酸 0.31g（1.00mmol），間 N，N-二甲氨基苯酚0.17g（1.25mmol）和甲基磺酸5mL。在N2保護(hù)下，加熱至85℃反應(yīng)。14h后停止反應(yīng)，降至室溫后加入50mL冰水，用飽和碳酸鈉溶液中和至pH=5，過(guò)濾，將濾餅真空干燥得粗品。干法上樣經(jīng)柱層析（甲醇∶二氯甲烷=1∶20，體積比）分離，得不對(duì)稱羅丹明（0.31g，72.83%）。

1H NMR (300MHz，CD3OD)：δ 2.04～2.10 (m，4H)，3.23～3.33 (m，4H)，3.55 (s，6H)，6.73～6.97 (m，3H)，7.17～7.27 (m，3H)，7.67～7.76 (m，3H)，8.18 (d，J = 7.2Hz，1H)。

圖1 包埋法制備SiO2熒光微球的示意圖

圖2 不對(duì)稱羅丹明衍生物和羅丹明B在乙醇溶液中的紫外-可見光譜和熒光發(fā)射光譜圖

1.3 SiO2熒光微球的制備

在 100mL四口燒瓶中加入一定量的正硅酸乙酯（TEOS）、冰乙酸（CH3COOH）攪拌5min后，再加入一定量的不對(duì)稱羅丹明衍生物的水溶液。在室溫下磁力攪拌10min，并靜置20min后，抽濾出SiO2熒光微球，并用去離子水、乙醇反復(fù)洗滌微球，直至洗滌液中不再檢測(cè)出熒光為止，最后用丙酮洗滌，在50℃下真空干燥即得SiO2熒光微球。其中正硅酸乙酯（TEOS）∶冰乙酸（CH3COOH）∶水（H2O）=1∶4∶4（摩爾比），不對(duì)稱羅丹明衍生物的量為0.08～0.10g。

圖1是采用包埋法制備SiO2熒光微球的反應(yīng)示意圖[7，10]。

1.4 氨基化SiO2熒光微球的制備

取0.5g SiO2熒光微球置于100mL四口瓶中，加入25mL無(wú)水甲苯，0.5mL氨丙基三乙氧基硅烷（KH-550），超聲混合15min后，110℃冷凝回流，磁力攪拌 12h。反應(yīng)結(jié)束后，依次用去離子水、乙醇、丙酮反復(fù)洗滌微球，50℃真空干燥即得氨基化SiO2熒光微球。

2 結(jié)果與討論

2.1 不對(duì)稱羅丹明和羅丹明B的光學(xué)性能

圖3 不對(duì)稱羅丹明衍生物（A）和羅丹明B（B）在乙醇溶液中的熒光發(fā)射光譜圖

圖2是不對(duì)稱羅丹明衍生物和羅丹明B在乙醇溶液中的紫外-可見光譜和熒光發(fā)射光譜圖。由圖2(a)和圖 2(b)可知，不對(duì)稱羅丹明衍生物的最大激發(fā)波長(zhǎng)為541nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為564nm；羅丹明B的最大激發(fā)波長(zhǎng)為 544nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)是為565nm，由文獻(xiàn)[11]報(bào)道的斯托克斯位移（Stokes shift）公式，得出不對(duì)稱羅丹明衍生物的斯托克斯位移是754cm–1，而羅丹明B是683cm–1。圖3是不對(duì)稱羅丹明衍生物和羅丹明B在乙醇溶液中的熒光發(fā)射光譜圖，以羅丹明 B（乙醇溶液， λex=450～565nm，φstandard=0.50[11]）為標(biāo)準(zhǔn)，選擇500nm為激發(fā)波長(zhǎng)，由文獻(xiàn)[11]報(bào)道的量子產(chǎn)率公式得到不對(duì)稱羅丹明的量子產(chǎn)率為0.70。

圖4 二氧化硅熒光微球的掃描電鏡和熒光顯微鏡圖

由上述分析可知，不對(duì)稱羅丹明衍生物具有優(yōu)異的光學(xué)性能，其斯托克斯位移和量子產(chǎn)率均高于羅丹明B，因此本文將不對(duì)稱羅丹明衍生物作為制備二氧化硅熒光微球的熒光染料。

2.2 二氧化硅熒光微球的形貌

圖4(a)和圖4(b)是二氧化硅熒光微球的掃描電鏡圖，可以看出所制備的二氧化硅熒光微球粒徑分布窄、單分散性良好。圖4(c)和(d)是二氧化硅熒光微球的熒光照片，可以看出二氧化硅熒光微球熒光強(qiáng)度強(qiáng)，具有好的光穩(wěn)定性。

正如圖1所示，前體正硅酸乙酯在酸性條件下水解成球的過(guò)程中，生成的中間體硅膠基質(zhì)帶有負(fù)電荷。而熒光染料不對(duì)稱羅丹明衍生物帶有正電荷，能與電負(fù)性的硅膠基質(zhì)通過(guò)靜電作用力將不對(duì)稱羅丹明衍生物分子牢牢地固定在微球中，解決了熒光染料分子泄漏的問(wèn)題[10，12]，從而保證二氧化硅熒光微球的熒光強(qiáng)度高且穩(wěn)定。

圖5 二氧化硅熒光微球（A）和氨基化二氧化硅熒光微球（B）的紅外光譜圖

2.3 氨基化二氧化硅熒光微球的FTIR和熒光光譜

圖5是二氧化硅熒光微球（A）和氨基化二氧化硅熒光微球（B）的紅外光譜圖，從圖5可以看出，二氧化硅熒光微球和氨基化二氧化硅熒光微球在 1100cm–1處均有 Si—O—Si鍵的骨架伸縮振動(dòng)峰，947cm–1處是Si—OH的彎曲振動(dòng)吸收峰，455cm–1處是Si—O—Si的彎曲振動(dòng)吸收峰，這說(shuō)明二氧化硅熒光微球和氨基化二氧化硅熒光微球均由Si—O—Si的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)組成。圖5中曲線B為3-氨丙基三乙氧基硅烷（KH550）改性的二氧化硅紅外光譜圖，可以看出在2940cm–1處有很弱的吸收峰，這分別是亞甲基和甲基中C—H的伸縮振動(dòng)峰；在3458cm–1處有一個(gè)吸收峰，與二氧化硅的Si—OH相比該峰明顯寬了許多，這主要是因?yàn)镵H550中的N—H的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰與二氧化硅中的Si—OH峰相互重疊造成的。上述結(jié)果已充分證明二氧化硅熒光微球表面接枝上了KH550。

圖6是氨基化二氧化硅熒光微球和不對(duì)稱羅丹明衍生物的熒光發(fā)射光譜圖，可以看出氨基化二氧化硅熒光微球的發(fā)射波長(zhǎng)比不對(duì)稱羅丹明衍生物稍微發(fā)生了紅移，這可能是由于氨基化二氧化硅熒光微球中的不對(duì)稱羅丹明衍生物和 Si—OH之間以SiO–…不對(duì)稱羅丹明衍生物+或者SiO–…[(不對(duì)稱羅丹明衍生物二聚體)2+]…–OSi的形式存在相互作用[9]，使不對(duì)稱羅丹明衍生物在微球中形成二聚體乃至多聚體，導(dǎo)致單體激發(fā)態(tài)能級(jí)的分裂，使得多聚體熒光的上能級(jí)低于單體，因此，與單體不對(duì)稱羅丹明衍生物相比，氨基化二氧化硅熒光微球表現(xiàn)出紅移。

圖6 氨基化二氧化硅熒光微球（A）和不對(duì)稱羅丹明衍生物（B）水溶液中的熒光發(fā)射光譜圖

3 結(jié) 論

（1）合成出熒光性能優(yōu)異的熒光染料-不對(duì)稱羅丹明衍生物。

（2）在酸性條件下，采用包埋法制備得到單分散性好、粒徑分布窄、熒光強(qiáng)度高且穩(wěn)定的二氧化硅熒光微球，并在二氧化硅熒光微球表面接枝上氨丙基三乙氧基硅烷。

（3）氨基化二氧化硅熒光微球表面帶有正電荷，可強(qiáng)烈結(jié)合帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)、DNA或藥物分子。

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第一作者及聯(lián)系人：劉清浩（1979—），女，博士，講師，主要從事新型熒光功能材料合成、性能和生物應(yīng)用的研究。E-mail liuqinghao0205@126.com。

中圖分類號(hào)：O 635.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-6613（2016）07-2130-05

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.07.027

收稿日期：2015-08-12；修改稿日期：2016-04-03。

基金項(xiàng)目：省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（1504211303）和2015校學(xué)科研究基金項(xiàng)目（110246）。

Preparation and characterization of silica fluoresent microspheres with amino groups

LIU Qinghao1，GUO Jinchun1，CAI Yuting1，LENG Jiapeng1，LIU Hongyan2，CHEN Ligong3
（1School of Chemical Engineering and Environment，North University of China，Taiyuan 030051，Shanxi，China;2Institute of Plant Protection，Henan Academy of Agriculture Sciences，Zhengzhou 450002，Henan，China；3School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China）

Abstract：Asymmetrical rhodamine derivative was firstly synthesized with a yield of high fluorescence quantum.Using asymmetrical rhodamine derivative as fluoresent dye，tetraethyl orthosilicate as the raw material，we prepared silica fluoresent microspheres by embedding method under acidic solutions.Then surface modification on the silica fluoresent microspheres by aminopropyl triethoxysilane was carried out.Finally，silica fluorescent microspheres with amino groups were characterized by scanning electron microscopy，fluorescence microscopy，fourier transform-infrared spectroscopy and fluorescence spectrophotometry.The results indicated that the obtained silica fluorescent microspheres were of good dispersion，narrow particle size，stable and high fluorescence intensity.And amino groups were successfully introduced on the surface.

Key words:silica; preparation；organic compounds；fluoresent microspheres with amino groups；asymmetrical rhodamine derivative