臺灣泡桐體細胞同源四倍體的誘導(dǎo)及鑒定

張變莉++王楊++劉榮寧++范國強

摘要：將臺灣泡桐葉片愈傷組織放置于含有不同質(zhì)量濃度秋水仙素的液體培養(yǎng)基上進行四倍體植株的誘導(dǎo)，采用根尖細胞染色體計數(shù)和葉片單細胞DNA含量測定的方法進行倍性分析。結(jié)果表明，在27個試驗組合中，用 30 mg/L秋水仙素處理預(yù)培養(yǎng)6 d的臺灣泡桐葉片48 h時，四倍體誘導(dǎo)率最高，為5.83%。根尖染色體壓片結(jié)果也表明，臺灣泡桐二倍體染色體數(shù)為2n=2x=40，四倍體為2n=4x=80。此外，與二倍體相比，誘變出的四倍體植株，具有生長慢、莖加粗、葉片增寬、單個氣孔面積增大、氣孔密度減少等特征。

關(guān)鍵詞：臺灣泡桐；葉片；秋水仙素；四倍體

中圖分類號： S792. 430.4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0290-04

收稿日期：2016-04-21

基金項目：河南省杰出人才創(chuàng)新基金（編號：321001700）；河南省高校杰出科研人才工程基金（編號：2002KYC-003）；河南省鄭州市普通科技攻關(guān)項目（編號：153PKJGG423）。

作者簡介：張變莉（1982—），女，河南通許人，碩士，講師，主要從事園林綠化及林木生物技術(shù)的教學(xué)和科研工作。E-mail：kfzbl@163.com。

通信作者：范國強，博士，教授，主要從事泡桐豐產(chǎn)栽培理論與生物技術(shù)研究。E-mail：gqfan@ henau.edu.cn。植物多倍體具有抗逆性和適應(yīng)性強等特點，能滿足生產(chǎn)上高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲害等要求，而且作為遺傳橋梁，對開展目的基因漸滲和轉(zhuǎn)移研究具有重要意義。目前，人工誘導(dǎo)植物多倍體已在楊樹、桑樹等林木樹種[ 1-12]上取得突破。泡桐在我國有著悠久的栽培歷史，由于其生長快、用途廣，廣受栽培者的歡迎。然而，泡桐叢枝病的頻發(fā)及“久治不愈”嚴重影響了其大面積栽植和應(yīng)用。近年來，范國強等[13-18]成功誘導(dǎo)了同源四倍體蘭考、白花、南方、豫雜一號等植株，但目前有關(guān)臺灣泡桐四倍體誘導(dǎo)研究鮮見報道。本試驗以臺灣泡桐組培苗葉片為材料，采用不同質(zhì)量濃度秋水仙素對其進行了同源四倍體誘導(dǎo)，為豐富泡桐四倍體種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗所用材料為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)試驗站的臺灣泡桐種子，采集后，先用70%乙醇消毒30 s，再用0.1% HgCl2 消毒 5 min，取出后，無菌水沖洗3～5次，之后將種子晾干，置于裝有40 mL MS 培養(yǎng)基 （ 含3.0 g/L瓊脂粉、25 g/L蔗糖） 的三角瓶中，在培養(yǎng)箱 [溫度（25±2） ℃，光照時間為 16 h/d，光照度為130 μmol/（m2·s）]內(nèi)培養(yǎng)。將生長 80 d 的同一株臺灣泡桐組培苗上部2片完全展開葉片置于其器官直接發(fā)生的培養(yǎng)基[19]上增殖后，取其葉片待用。

1.2試驗方法

1.2.1臺灣泡桐葉片的預(yù)培養(yǎng)取臺灣泡桐組培苗自頂部向下數(shù)的第 2～4 對葉片，剪成1.0 cm×1.0 cm小塊，分別置于裝有40 mL的MS+0.1 mg/L NAA+16.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基[19] 的三角瓶中，在20 ℃的黑暗條件下進行不同時間（表1）的預(yù)培養(yǎng)。

1.2.2秋水仙素誘導(dǎo)臺灣泡桐四倍體植株將上述預(yù)培養(yǎng)不同時間的外植體（臺灣泡桐葉塊）分別接種于含有秋水仙素液體培養(yǎng)基[19]的三角瓶中，并按照設(shè)計組合（表1）置于 20 ℃ 的黑暗條件下進行四倍體誘導(dǎo)。 誘導(dǎo)結(jié)束后，無菌水沖洗葉片3～5次，再將葉片表面水分用無菌濾紙吸干，之后轉(zhuǎn)入不含秋水仙素的MS+0.1 mg/L NAA+16.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上，于光照度為130 μmol/（m2·s） 、光照時間為 16 h/d、溫度為25 ℃的培養(yǎng)室內(nèi)進行芽誘導(dǎo)，每處理30瓶，每瓶2個葉塊。15 d后，統(tǒng)計臺灣泡桐外植體存活數(shù)，30 d后統(tǒng)計外植體出芽數(shù)，并計算其存活率[（存活的外植體個數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%]和芽誘導(dǎo)率[（誘導(dǎo)出芽外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%]。 將誘導(dǎo)后長至2 cm的幼芽剪下，接種于1/2 MS 培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，每30 d 繼代培養(yǎng)1次，共繼代5次。

第5次繼代苗培養(yǎng)后，幼芽根長至1.5～2.0 cm時，先剪其根尖制成壓片[20]用于觀察染色體的加倍情況，再用流式細胞儀[21]確認秋水仙素誘變的臺灣泡桐幼苗的倍性，并計算其四倍體誘導(dǎo)率（ 流式細胞儀檢測四倍體幼芽數(shù)/外植體誘導(dǎo)出的總芽數(shù)） 。 每組試驗重復(fù)2次，數(shù)據(jù)采用 SPSS 軟件處理，并進行F檢驗。

1.2.3臺灣泡桐四倍體植株的鑒定（1）幼苗根尖染色體計數(shù)。臺灣泡桐二倍體幼苗及秋水仙素誘導(dǎo)變異幼苗的根尖細胞染色體觀察參照舒壽蘭等[ 20]的方法。在尼康TS-100熒光倒置顯微鏡（2 000×）下，觀察上述根尖臨時壓片中的染色體條數(shù)并拍照。（2）葉片單細胞DNA相對含量測定。分別將染色體加倍的及普通二倍體的臺灣泡桐葉片各50 mg置于2 mL緩沖液Ⅰ（0.5%T ween 和濃度為0.1 mol/L的檸檬酸） 中，然后用剪刀或鋒利的刀片將其切碎，用300目尼龍網(wǎng)過濾至BD專用試管中，重復(fù)過濾2次去除雜質(zhì)。留取1 mL濾液置于轉(zhuǎn)速為1 500 r/min的離心機中4 ℃離心5 min，棄除上清液，并加入1 mL鞘液輕微搖勻，然后再置入上述轉(zhuǎn)速離心機中4 ℃離心5 min。倒掉上清液，在沉淀中加入 0.5 mL 儀器所帶熒光染色液，輕微振蕩搖勻后避光放置 30 min，以便充分染色。然后用300目濾網(wǎng)過濾1次至試管中，用于測定葉片單細胞DNA相對含量。

1.2.4植株形態(tài)特征比較觀察并記錄上面生長30 d第5次繼代的四倍體和二倍體臺灣泡桐幼苗葉形、葉色等差異。每一指標測定10個樣品，求其平均值。

1.2.5表皮細胞氣孔器的比較取苗齡60 d的四倍體和二倍體臺灣泡桐組培苗成熟葉片，放置于質(zhì)量分數(shù)5% 的KOH溶液中煮沸3～5 min，然后置于冷水中。先在載玻片上滴一滴清水，再用鑷子挑取其表皮并展平放于載玻片的水滴上，用濾紙吸去過多的水分。然后蓋上蓋玻片并用目鏡中帶有測微尺鏡頭的顯微鏡觀察，在100×10的油鏡下觀察測量每個氣孔器的長度、寬度和氣孔器個數(shù)，計算氣孔器密度，3次重復(fù)，取平均值。

張變莉 王楊 劉榮寧 范國強

摘要：將臺灣泡桐葉片愈傷組織放置于含有不同質(zhì)量濃度秋水仙素的液體培養(yǎng)基上進行四倍體植株的誘導(dǎo)，采用根尖細胞染色體計數(shù)和葉片單細胞DNA含量測定的方法進行倍性分析。結(jié)果表明，在27個試驗組合中，用 30 mg/L秋水仙素處理預(yù)培養(yǎng)6 d的臺灣泡桐葉片48 h時，四倍體誘導(dǎo)率最高，為5.83%。根尖染色體壓片結(jié)果也表明，臺灣泡桐二倍體染色體數(shù)為2n=2x=40，四倍體為2n=4x=80。此外，與二倍體相比，誘變出的四倍體植株，具有生長慢、莖加粗、葉片增寬、單個氣孔面積增大、氣孔密度減少等特征。

關(guān)鍵詞：臺灣泡桐；葉片；秋水仙素；四倍體

中圖分類號： S792. 430.4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0290-04

收稿日期：2016-04-21

基金項目：河南省杰出人才創(chuàng)新基金（編號：321001700）；河南省高校杰出科研人才工程基金（編號：2002KYC-003）；河南省鄭州市普通科技攻關(guān)項目（編號：153PKJGG423）。

作者簡介：張變莉（1982—），女，河南通許人，碩士，講師，主要從事園林綠化及林木生物技術(shù)的教學(xué)和科研工作。E-mail：kfzbl@163.com。

通信作者：范國強，博士，教授，主要從事泡桐豐產(chǎn)栽培理論與生物技術(shù)研究。E-mail：gqfan@ henau.edu.cn。植物多倍體具有抗逆性和適應(yīng)性強等特點，能滿足生產(chǎn)上高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲害等要求，而且作為遺傳橋梁，對開展目的基因漸滲和轉(zhuǎn)移研究具有重要意義。目前，人工誘導(dǎo)植物多倍體已在楊樹、桑樹等林木樹種[ 1-12]上取得突破。泡桐在我國有著悠久的栽培歷史，由于其生長快、用途廣，廣受栽培者的歡迎。然而，泡桐叢枝病的頻發(fā)及“久治不愈”嚴重影響了其大面積栽植和應(yīng)用。近年來，范國強等[13-18]成功誘導(dǎo)了同源四倍體蘭考、白花、南方、豫雜一號等植株，但目前有關(guān)臺灣泡桐四倍體誘導(dǎo)研究鮮見報道。本試驗以臺灣泡桐組培苗葉片為材料，采用不同質(zhì)量濃度秋水仙素對其進行了同源四倍體誘導(dǎo)，為豐富泡桐四倍體種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗所用材料為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)試驗站的臺灣泡桐種子，采集后，先用70%乙醇消毒30 s，再用0.1% HgCl2 消毒 5 min，取出后，無菌水沖洗3～5次，之后將種子晾干，置于裝有40 mL MS 培養(yǎng)基 （ 含3.0 g/L瓊脂粉、25 g/L蔗糖） 的三角瓶中，在培養(yǎng)箱 [溫度（25±2） ℃，光照時間為 16 h/d，光照度為130 μmol/（m2·s）]內(nèi)培養(yǎng)。將生長 80 d 的同一株臺灣泡桐組培苗上部2片完全展開葉片置于其器官直接發(fā)生的培養(yǎng)基[19]上增殖后，取其葉片待用。

1.2試驗方法

1.2.1臺灣泡桐葉片的預(yù)培養(yǎng)取臺灣泡桐組培苗自頂部向下數(shù)的第 2～4 對葉片，剪成1.0 cm×1.0 cm小塊，分別置于裝有40 mL的MS+0.1 mg/L NAA+16.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基[19] 的三角瓶中，在20 ℃的黑暗條件下進行不同時間（表1）的預(yù)培養(yǎng)。

1.2.2秋水仙素誘導(dǎo)臺灣泡桐四倍體植株將上述預(yù)培養(yǎng)不同時間的外植體（臺灣泡桐葉塊）分別接種于含有秋水仙素液體培養(yǎng)基[19]的三角瓶中，并按照設(shè)計組合（表1）置于 20 ℃ 的黑暗條件下進行四倍體誘導(dǎo)。 誘導(dǎo)結(jié)束后，無菌水沖洗葉片3～5次，再將葉片表面水分用無菌濾紙吸干，之后轉(zhuǎn)入不含秋水仙素的MS+0.1 mg/L NAA+16.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上，于光照度為130 μmol/（m2·s） 、光照時間為 16 h/d、溫度為25 ℃的培養(yǎng)室內(nèi)進行芽誘導(dǎo)，每處理30瓶，每瓶2個葉塊。15 d后，統(tǒng)計臺灣泡桐外植體存活數(shù)，30 d后統(tǒng)計外植體出芽數(shù)，并計算其存活率[（存活的外植體個數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%]和芽誘導(dǎo)率[（誘導(dǎo)出芽外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%]。 將誘導(dǎo)后長至2 cm的幼芽剪下，接種于1/2 MS 培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，每30 d 繼代培養(yǎng)1次，共繼代5次。

第5次繼代苗培養(yǎng)后，幼芽根長至1.5～2.0 cm時，先剪其根尖制成壓片[20]用于觀察染色體的加倍情況，再用流式細胞儀[21]確認秋水仙素誘變的臺灣泡桐幼苗的倍性，并計算其四倍體誘導(dǎo)率（ 流式細胞儀檢測四倍體幼芽數(shù)/外植體誘導(dǎo)出的總芽數(shù)） 。 每組試驗重復(fù)2次，數(shù)據(jù)采用 SPSS 軟件處理，并進行F檢驗。

1.2.3臺灣泡桐四倍體植株的鑒定（1）幼苗根尖染色體計數(shù)。臺灣泡桐二倍體幼苗及秋水仙素誘導(dǎo)變異幼苗的根尖細胞染色體觀察參照舒壽蘭等[ 20]的方法。在尼康TS-100熒光倒置顯微鏡（2 000×）下，觀察上述根尖臨時壓片中的染色體條數(shù)并拍照。（2）葉片單細胞DNA相對含量測定。分別將染色體加倍的及普通二倍體的臺灣泡桐葉片各50 mg置于2 mL緩沖液Ⅰ（0.5%T ween 和濃度為0.1 mol/L的檸檬酸） 中，然后用剪刀或鋒利的刀片將其切碎，用300目尼龍網(wǎng)過濾至BD專用試管中，重復(fù)過濾2次去除雜質(zhì)。留取1 mL濾液置于轉(zhuǎn)速為1 500 r/min的離心機中4 ℃離心5 min，棄除上清液，并加入1 mL鞘液輕微搖勻，然后再置入上述轉(zhuǎn)速離心機中4 ℃離心5 min。倒掉上清液，在沉淀中加入 0.5 mL 儀器所帶熒光染色液，輕微振蕩搖勻后避光放置 30 min，以便充分染色。然后用300目濾網(wǎng)過濾1次至試管中，用于測定葉片單細胞DNA相對含量。

1.2.4植株形態(tài)特征比較觀察并記錄上面生長30 d第5次繼代的四倍體和二倍體臺灣泡桐幼苗葉形、葉色等差異。每一指標測定10個樣品，求其平均值。

1.2.5表皮細胞氣孔器的比較取苗齡60 d的四倍體和二倍體臺灣泡桐組培苗成熟葉片，放置于質(zhì)量分數(shù)5% 的KOH溶液中煮沸3～5 min，然后置于冷水中。先在載玻片上滴一滴清水，再用鑷子挑取其表皮并展平放于載玻片的水滴上，用濾紙吸去過多的水分。然后蓋上蓋玻片并用目鏡中帶有測微尺鏡頭的顯微鏡觀察，在100×10的油鏡下觀察測量每個氣孔器的長度、寬度和氣孔器個數(shù)，計算氣孔器密度，3次重復(fù)，取平均值。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度秋水仙素處理對臺灣泡桐四倍體誘導(dǎo)的影響

從表1試驗數(shù)據(jù)及統(tǒng)計結(jié)果可以看出，不同預(yù)培養(yǎng)時間及不同濃度、不同處理時間的秋水仙素誘導(dǎo)對臺灣泡桐四倍體誘導(dǎo)率、芽誘導(dǎo)率和外植體存活率均有不同影響。 當秋水仙素濃度是10 mg/L時，伴隨預(yù)培養(yǎng)時間和秋水仙素誘導(dǎo)時間的延長，四倍體誘導(dǎo)率、芽誘導(dǎo)率和外植體存活率均表現(xiàn)出明顯不同。其中，組合11的四倍體誘導(dǎo)率、芽誘導(dǎo)率和外植體存活率分別為6.90%、20.58%及49.11%。當秋水仙素濃度為 20 mg/L 時，組合13的四倍體誘導(dǎo)率、芽誘導(dǎo)率及外植體存活率均達到最高。當秋水仙素濃度為30 mg/L時，組合16的四倍體誘導(dǎo)率、芽誘導(dǎo)率和外植體存活率達到最大，分別為345%、11.94%及32.83%。綜上所述，當秋水仙素濃度不斷增大，臺灣泡桐葉片（外植體）的最高四倍體誘導(dǎo)率及芽誘導(dǎo)率、存活率基本呈現(xiàn)下降趨勢，并且秋水仙素濃度對四倍體誘導(dǎo)率、芽誘導(dǎo)率及外植體存活率的影響均極顯著；秋水仙素處理外植體的時間對外植體存活率、芽誘導(dǎo)率的影響均極顯著；外植體的預(yù)培養(yǎng)時間對芽誘導(dǎo)率的影響顯著，而對四倍體誘導(dǎo)率的影響則不顯著（表2 ）。這表明，臺灣泡桐最高四倍體誘導(dǎo)率的產(chǎn)生是外植體預(yù)培養(yǎng)時間、處理時間及秋水仙素濃度共同作用的結(jié)果。因此，選擇組合11（6 d預(yù)培養(yǎng)+10 mg/L 秋水仙素+48 h處理），作為臺灣泡桐四倍體誘導(dǎo)的最佳組合。

2.2四倍體臺灣泡桐植株的鑒定

2.2.1根尖染色體觀察觀察顯微鏡下根尖臨時壓片顯示，變異的臺灣泡桐幼苗根尖細胞染色體為2n= 4x=80，正常臺灣泡桐二倍體的根尖細胞染色體為2n=2x=40（ 圖1） 。染色體觀察結(jié)果顯示，秋水仙素誘變的臺灣桐幼苗細胞中，染色體數(shù)均是正常二倍體的2倍。

2.2.2葉片單細胞DNA含量檢測流式細胞儀檢測繼代5次的臺灣泡桐變異幼苗和二倍體幼苗葉片單細胞DNA相對含量的檢測結(jié)果（圖2）表明，臺灣泡桐二倍體幼苗只在相對熒光強度值為50的位置上出現(xiàn)1個單峰，而經(jīng)秋水仙素處理后也僅在接近100的位置上出現(xiàn)1個單峰，即變異幼苗葉片單細胞 DNA含量為其二倍體葉片的2倍。綜上所述，秋水仙素誘導(dǎo)獲得的臺灣泡桐變異幼苗為其同源四倍體幼苗。

2.3臺灣泡桐二倍體與同源四倍體幼苗的形態(tài)比較

由圖3和表3可知，四倍體較二倍體幼苗葉色變深，葉片變厚、增大，長寬比變小。另外，與二倍體相比，臺灣泡桐四倍體葉片的氣孔變大，但其葉片的氣孔器密度變小。

3討論

眾所周知，當今植物多倍體誘導(dǎo)中效果最好、應(yīng)用最廣泛的化學(xué)誘變劑是秋水仙素，它在植物多倍體誘導(dǎo)中具有非常重要的作用[22-23]。本試驗結(jié)果表明，組合11是臺灣泡桐四倍體誘導(dǎo)率最高的組合，即將臺灣泡桐葉片預(yù)培養(yǎng)6 d后，再在濃度為10 mg/L秋水仙素的液體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)48 h，四倍體誘導(dǎo)率達到最高，為 6.90%。這與在蘭考泡桐、白花泡桐和南方泡桐等葉片上得到的情況[13-18]有一定差異，臺灣泡桐四倍體誘導(dǎo)率有顯著下降。這可能是將臺灣泡桐葉片直接浸泡于秋水仙素液體培養(yǎng)基中，造成其在較短時間內(nèi)對外植體產(chǎn)生毒害作用，降低了外植體的存活率和芽誘導(dǎo)率，因而造成四倍體誘導(dǎo)率的顯著下降。但是，與其他種類泡桐四倍體誘導(dǎo)所采用的雙層培養(yǎng)基法相比，上述方法減少了一定的工作量，加快了誘導(dǎo)的速度，對于需要快速獲得四倍體植株的植物種類，液體浸泡的方法是比較好的選擇。此外，在本試驗中，采用組合11處理后獲得的誘變植株大部分為四倍體，并且這些四倍體能夠穩(wěn)定地遺傳，其原因可能是用10 mg/L秋水仙素處理預(yù)培養(yǎng)6 d的臺灣泡桐葉片48 h時，由于葉片較薄，細胞分裂旺盛、分裂的同步性好，此時秋水仙素易抑制紡錘絲的形成，從而導(dǎo)致大量的細胞染色體加倍，這樣，獲得變異植株中出現(xiàn)嵌合體的概率就小。

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