沼液生物厭氧發(fā)酵對病死豬病原微生物殺滅效果的評價

袁萬哲，鄭麗麗，劉天駒，楊旭光，王 邁，張永輝，王玉清（.河北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，河北保定 0700；.河北省動物疫病預防控制中心，河北保定 07000；.衡水市動物疫病預防控制中心，河北衡水 05000；.石家莊市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北石家莊 050000）

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沼液生物厭氧發(fā)酵對病死豬病原微生物殺滅效果的評價

袁萬哲1，鄭麗麗2，劉天駒2，楊旭光3，王 邁4，張永輝3，王玉清2
（1.河北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，河北保定 071001；2.河北省動物疫病預防控制中心，河北保定 071000；3.衡水市動物疫病預防控制中心，河北衡水 053000；4.石家莊市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北石家莊 050000）

摘 要：為評估利用沼液無害化處理病死豬的效果，無菌采集病死豬沼液生物厭氧發(fā)酵樣品，利用PCR技術對樣品中的豬瘟病毒、圓環(huán)病毒2型、藍耳病病毒、偽狂犬病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬鏈球菌與副豬嗜血桿菌等7種常見病原微生物進行了檢測，同時應用細菌培養(yǎng)基與PK-15細胞對豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌以及豬瘟病毒、偽狂犬病毒、圓環(huán)病毒2型進行了病原分離。結果顯示，田間試驗組和模擬平臺試驗組，在不同溫度條件下，應用沼液對病死豬進行3個月或6個月的厭氧發(fā)酵，病原微生物核酸檢測或病原分離鑒定均為陰性，證實應用沼液無害化處理病死豬能有效殺滅其中的病原微生物，使其失去活性。

關鍵詞：沼液；無害化處理；檢測；PCR

病死動物的無害化處理事關動物疫病的有效控制、畜牧業(yè)的健康發(fā)展和社會公共衛(wèi)生的安全。目前國內(nèi)外采用的無害化處理技術主要包括深埋、焚燒、化制等，存在造價高、費時費工、污染環(huán)境等缺陷。為改進、規(guī)范、創(chuàng)新現(xiàn)有的病死動物無害化處理方法和技術，探索低成本、便操作、易接受、適民情、節(jié)能源、減排放、符環(huán)保、再利用的病死動物無害化處理新方法和新技術，在傳統(tǒng)化尸池處理病死動物方法的基礎上，本著“務實創(chuàng)新、科學規(guī)范”的原則，2014年開展了“應用沼液無害化處理病死動物相關技術”的研究工作，在河北省衡水市武邑縣、繞陽縣等地設立了野外田間實驗區(qū)（點）和室內(nèi)人工模擬試驗平臺，經(jīng)過近1年多的初步試驗，取得了階段性成果?，F(xiàn)對利用沼液生物厭氧發(fā)酵無害化處理技術對病死豬的病原微生物殺滅效果進行評價。

1 材料和方法

1.1 樣品

采自衡水市武邑縣、饒陽縣試驗點野外化尸沼液池以及實驗室人工模擬化尸瓶，樣品均為隨機采集經(jīng)過不同時間沼液發(fā)酵的病死豬組織或骨頭。其中2份來自武邑，2份來自饒陽，2份來自實驗室。

1.2 主要試劑

2×Taq Mix、dNTPs、DL2000 DNA Marker 購自寶生物工程（大連）有限公司；病毒RNA/DNA提取試劑盒購自全式金（北京）生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV（200U/uL）、5×M-MLV Buffer、0.1M DTT購自Promega公司；THB培養(yǎng)基購自青島海博生物技術有限公司。

1.3 引物設計與合成

PCR檢測方法為本實驗室自建［1-2］，所用引物見表1。其中，豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）預擴增片段為691 bp（高致病性毒株）或781bp（經(jīng)典毒株）；豬瘟病毒（CSFV）預擴增片段為186 bp；豬偽狂犬病毒（PRV）預擴增片段為349 bp；豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）預擴增片段為440 bp；豬流行性腹瀉病毒（PEDV）預擴增片段為477 bp；副豬嗜血桿菌（Hps）預擴增片段為276 bp；豬鏈球菌（SS）預擴增片段為466 bp。引物均由生工（上海）生物技術有限公司合成。

表1 PCR引物

1.4 核酸提取

將含病死豬組織的沼液5 000 rpm離心10 min后取沉淀加雙蒸水重懸，于100℃水浴10 min后立即冰浴冷卻5 min，12 000 rpm 4℃離心5 min，取上清液作為細菌檢測模板備用。將含病死豬豬組織的沼液5 000 rpm離心10 min，吸取上清，用病毒RNA/DNA提取試劑盒提取核酸作為病毒檢測模板備用。骨頭樣本抽取骨髓，刮取骨表面物質(zhì)提取核酸備用。

1.5 PCR擴增

根據(jù)目的片段采用相應下游引物，參照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶使用說明書進行操作。在20 μL體系里，依次加入RNA 樣品、dNTPs（10 mM）、下游引物（10 pM）、5×MLV Buffer、RRI（RNA酶 抑制劑）、DTT（0.1M）和MLV反轉(zhuǎn)錄酶，42℃反轉(zhuǎn)錄 1 h，反轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物作為PCR模板。將所有待檢樣本，在20 μL體系里，按照比例加入2×Taq Mix、模板引物（10 pM）和dd H2O，94 ℃預變性3 min，94 ℃預變性30 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。同時設立以水為模版的陰性對照。PCR結束后，取5 μL PCR擴增產(chǎn)物，進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.6 病原分離

利用THB培養(yǎng)基（含NAD）分離豬鏈球菌與副豬嗜血桿菌，利用PK-15細胞分離樣本中偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型與豬瘟病毒。

1.6.1 細菌分離。將沼液直接接種THB培養(yǎng)基，挑選鏈球菌與副豬嗜血桿菌可疑菌落傳代，通過革蘭氏染色與PCR進行檢測。

1.6.2 病毒分離。將沼液濾過處理之后，30 000 rpm超速離心1 h，棄掉上清，用細胞培養(yǎng)液洗滌沉淀，再超速離心，用細胞培養(yǎng)液懸浮沉淀后接種PK-15細胞，逐日觀察細胞病變，如此盲傳3代，收獲細胞培養(yǎng)物，采用PCR檢測偽狂犬病毒、豬瘟病毒與豬圓環(huán)病毒2型。

2 結果

2.1 經(jīng)過不同時間生物厭氧發(fā)酵病死豬的病原PCR檢測

病死豬發(fā)酵前（0月）、發(fā)酵后（3月、6月），分別采集發(fā)酵豬組織或骨頭進行PCR檢測，部分樣本的病原微生物核酸檢測陽性，結果見表2。

表2 樣本的PCR檢測結果

2.2 經(jīng)過不同時間生物厭氧發(fā)酵病死豬的病原分離鑒定

選擇病原微生物核酸檢測陽性樣本進行病原分離鑒定。將發(fā)酵3個月、6個月的樣本處理后，選擇THB培養(yǎng)基進行細菌分離，接種培養(yǎng)基后觀察細菌生長，挑選至少10個疑似鏈球菌與副豬嗜血桿菌菌落純化、革蘭氏染色以及PCR鑒定，結果未見鏈球菌與副豬嗜血桿菌。將發(fā)酵3個月、6個月的樣本處理后，接種PK-15細胞，盲傳3代后未見細胞病變。PCR鑒定后未檢出豬瘟病毒、偽狂犬病毒與豬圓環(huán)病毒2型。

結果表明應用沼液對病死豬進行3個月或6個月的生物厭氧發(fā)酵，病原微生物已失去活性。

3 討論

病死畜禽的無害化處理是消滅傳染源最有效和最徹底的措施，特別是當前正值重大動物疫病防控的重要階段和食用農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全水平全面提升的關鍵時期［3］。應用沼液生物厭氧發(fā)酵技術無害化處理病死動物，具有操作簡便、成本低廉、環(huán)境友好等特點。然而經(jīng)過發(fā)酵以后，病死豬所攜帶的病原微生物是否完全被殺滅或失去致病性，是決定沼液無害化處理技術是否有效的根本。本研究在流行病學調(diào)查的基礎上，選擇了5種既有DNA病毒、又有RNA病毒的，常發(fā)的和有代表性的病毒病病原，包括豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬流行性腹瀉病毒，同時還選擇了2種分別是革蘭氏陽性和革蘭氏陰性的、具有代表性的細菌病病原：豬鏈球菌與副豬嗜血桿菌，開展了殺滅效果檢測。經(jīng)過3個月或6個月發(fā)酵后，部分發(fā)酵池病原核酸檢測仍為陽性，這可能跟核酸本身的耐酸堿等性質(zhì)有關。為進一步驗證其活性，對檢出的陽性樣本處理后，接種PK-15細胞，有針對性地分離了陽性樣本中豬瘟病毒、偽狂犬病毒與豬圓環(huán)病毒2型。因為這三個病毒既有DNA病毒（豬偽狂犬病毒與豬圓環(huán)病毒2型），又有RNA病毒（豬瘟病毒），既有囊膜病毒（豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒），又有無囊膜病毒（豬圓環(huán)病毒2型），具有代表性，且這三種病毒都可以利用PK-15細胞進行分離。細胞傳代至3代，均未見細胞病變。收獲樣本，PCR檢測均未檢出豬瘟病毒、偽狂犬病毒與圓環(huán)病毒2型。同時將發(fā)酵3個月或6個月的樣本處理后，選擇THB培養(yǎng)基進行細菌分離，通過革蘭氏染色以及PCR鑒定，未見鏈球菌與副豬嗜血桿菌，證實病死豬經(jīng)過3個月或6個月發(fā)酵后，病原微生物已失去活性。

本沼液發(fā)酵利用保溫技術措施，使全年池內(nèi)溫度基本保持在7～28℃之間。冬季池內(nèi)最低溫度為7℃，夏季池內(nèi)最高溫度可達28℃。經(jīng)對整個發(fā)酵試驗過程跟蹤檢測，發(fā)現(xiàn)每個試驗組pH值的平均變化幅度在6.99～7.24之間。雖然發(fā)酵池發(fā)酵過程中的溫度與pH值比較恒定，但依然出現(xiàn)這種殺滅效果，其原因初步認為跟營養(yǎng)物質(zhì)缺乏以及厭氧等有關。隨著發(fā)酵的進行，病死豬組織逐漸被發(fā)酵降解，病毒等微生物失去營養(yǎng)基質(zhì)，同時氧氣減少，

抑制了病原微生物的增殖。另據(jù)有關資料報道，沼液對細菌、病毒等微生物具有一定的抑制與殺滅作用。沼液生物厭氧發(fā)酵中是否還存在其他有效殺滅病原微生物的原因，目前正在進一步研究中。

參考文獻：

［1］ Yuan W，Li Y，Li P，et al.Development of a nanoparticleassisted PCR assay for detection of porcine epidemic diarrhea virus［J］.J Virol Methods.2015，220：18-20.

［2］ 左奕，王建永，袁萬哲，等.PCV2-PRV-PRRSV-CSFV多重PCR檢測方法的建立［J］.中國獸醫(yī)科學，2015，45（8）：771-775.

［3］王聯(lián)芳，朱新華.病死畜禽無害化處理存在的問題及對策［J］.醫(yī)學動物防制，2008，24（11）：876-877.

（責任編輯：朱迪國）

Evaluation on Inactivating Pathogenic Microorganisms from Dead Pigs by Anaerobic Fermentation Slurry

Yuan Wanzhe1，Zheng Lili2，Liu Tianju2，Yang Xuguang3，Wang Mai4，Zhang Yonghui3，Wang Yuqing2
（1.College of Animal Medicine，Hebei Agricultural University，Baoding，Hebei 071001；2.Hebei Animal Disease Prevention and Control Center，Baoding，Hebei 071000；3.Hengshui Animal Disease Prevention and Control Center，Hengshui，Hebei 053000；4.Shijiazhuang Animal Health Supervision Institute，Shijiazhuang，Hebei 050000）

Abstract：In order to evaluate the effects of bio-safety disposal of dead pigs by using biogas slurry，samples were collected from biological anaerobic fermentation slurry with pigs died of disease and detected for seven kinds of common pathogenic microorganisms including classical swine fever virus，porcine circovirus type 2，porcine reproductive and respiratory syndrome virus，pseudorabies virus，porcine epidemic diarrhea virus，streptococcus suis and haemophilus parasuis in samples by PCR.Meanwhile，pathogens including streptococcus suis，haemophilus parasuis，classical swine fever virus，pseudorabies virus and porcine circovirus type 2 were isolated by bacterial culture medium or PK-15 cells.After dead pigs were treated by biological anaerobic fermentation slurry over the past three or six months under different temperature conditions，the results on nucleic acid testing or pathogen isolation both were negative.The results indicated that biogas slurry could effectively inactivate pathogenic microorganisms from pigs died of diseases.

Key words：anaerobic fermentation slurry；bio-safety disposal；detection；PCR

中圖分類號：S852.65

文獻標志碼：A

文章編號：1005-944X（2016）02-0026-04

基金項目：2014年度河北省畜牧獸醫(yī)局科技項目“應用沼液無害化處理病死動物相關技術研究與應用”（2014-1-02）

通訊作者：王玉清，張永輝