響應(yīng)面法優(yōu)化胃蛋白酶制備蛋清多肽的研究

Emmanuel Kargan Dangan，蔡成崗,2,3，謝金海,2,3，王珍珍，毛建衛(wèi),2,3

(1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310023；3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310023)

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響應(yīng)面法優(yōu)化胃蛋白酶制備蛋清多肽的研究

Emmanuel Kargan Dangan1，蔡成崗1,2,3，謝金海1,2,3，王珍珍1，毛建衛(wèi)1,2,3

(1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310023；3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310023)

摘要:以蛋清粉為原料，以酶解液的抗氧化能力為指標(biāo)，優(yōu)化了胃蛋白酶酶解蛋清粉的工藝條件。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酶解溫度50 ℃、酶解pH值2.5和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的蛋清粉，經(jīng)酶解后可以獲得較佳的抗氧化能力；響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在pH值2.1、蛋清粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.5%、反應(yīng)溫度49 ℃時(shí)，酶解液產(chǎn)生的多肽具有最優(yōu)的抗氧化活性。研究結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)蛋清多肽打下了一定的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:蛋清粉；胃蛋白酶；多肽；響應(yīng)面法

雞蛋營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，在世界范圍內(nèi)得到廣泛的食用。隨著食品工業(yè)的發(fā)展，雞蛋來(lái)源的配料也日漸在食品產(chǎn)業(yè)中占有一定的份額，如蛋清粉、蛋黃粉、溶菌酶和蛋源免疫球蛋白、DHA等[1-3]，這些東西的使用很方便，同時(shí)還減少了運(yùn)輸成本。生物活性肽是以蛋白質(zhì)為底物，采用酶解的方法進(jìn)行生產(chǎn)的功能性成分，主要包括免疫肽、抗菌肽、降壓肽等[4-6]，它們?cè)诒＝∈称?、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。目前有報(bào)道采用酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶等多種酶制劑對(duì)蛋清進(jìn)行酶解制備活性肽[7-9]。

本研究采用豬源胃蛋白酶對(duì)蛋清粉進(jìn)行酶解處理，以酶解后多肽還原力變化和清除DPPH自由基能力為指標(biāo)，考察較優(yōu)的酶解條件，以便為進(jìn)一步利用蛋清多肽打下一定的基礎(chǔ)。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1材料和試劑

蛋清粉，長(zhǎng)興艾格生物制品有限公司。胃蛋白酶(EC編號(hào)：232-629-3，規(guī)格1∶3 000)、透析袋(截留分子質(zhì)量6 945 u)，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DPPH購(gòu)自Sigma公司；HCl、KCl、NaH2PO4、Na2HPO4、Tris堿、H2O2、H3PO4、CH3OH、K3[Fe(CN)6]、FeCl3、C7H5NaO3等均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司和華東醫(yī)藥股份有限公司器材化劑分公司。

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備

磁力攪拌器JB-2，上海雷磁有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)752N，上海精科儀器有限公司；離心機(jī)Micro17R，美國(guó)熱電(上海)科技儀器有限公司；酸度計(jì)PB-10，梅特勒托利多儀器(上海)有限公司；水浴搖床SHA-C，江蘇金壇市宏華儀器廠；其他常規(guī)玻璃器皿。

1.3實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線

蛋清粉→實(shí)驗(yàn)條件選擇→酶解實(shí)驗(yàn)控制→滅酶與抗氧化分析→實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)選→參數(shù)確定。

1.4實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)定胃蛋白酶用量為蛋清粉用量的1%，在酶解時(shí)間2 h的條件時(shí)，以溫度、緩沖液pH值和蛋清粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為單因素變量，以還原力和DPPH自由基清除率為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。其中，設(shè)計(jì)蛋清粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、4%、6%時(shí)，在50 ℃、pH2的緩沖溶液中酶解時(shí)間2 h，測(cè)定酶解效果；考察40、50、60 ℃時(shí)，蛋清粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、pH2的緩沖液中酶解2 h后的酶解效果；以蛋清粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，研究pH值為1、2、3的緩沖液中50 ℃酶解2 h后的酶解效果。

1.4.2Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以酶降解緩沖液的酸堿性(pH值)、蛋清蛋白量和反應(yīng)溫度為實(shí)驗(yàn)條件開(kāi)展研究。采用Design Expert軟件7.0版本中的Box-Behnken方法進(jìn)行設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)因素水平根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為參考，具體見(jiàn)表1。

表1　響應(yīng)面優(yōu)化因素和水平表

1.5抗氧化活性測(cè)定

還原力和DPPH自由基清除率測(cè)定參考文獻(xiàn)[9]的方法。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1　蛋清粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶解液DPPH清除和還原力的影響Fig.1　Influence of substrate contents on reducing power and DPPH scavenging of hydrolysates

2.1.1蛋清粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)抗氧化結(jié)果的影響

在緩沖溶液pH2，50 ℃酶解2 h后，質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的蛋清粉具有最大的還原力和DPPH自由基清除率，高于質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%和6%時(shí)的蛋清粉，如圖1所示。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的蛋清粉。

2.1.2酶解溫度對(duì)抗氧化效果的影響

反應(yīng)溫度對(duì)蛋清粉多肽清除DPPH自由基和還原力有一定的影響(圖2)。結(jié)果表明，溫度在50 ℃時(shí)，蛋清粉的酶解產(chǎn)物顯示了較佳的抗氧化能力，高于40 ℃和60 ℃時(shí)的效果，因此，在后續(xù)試驗(yàn)中選擇50 ℃作為酶解溫度。

2.1.3反應(yīng)液酸堿度對(duì)抗氧化效果的影響

在反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時(shí)間2 h的條件下，選擇pH值為1(氯化鉀-鹽酸)、2(甘氨酸-鹽酸)和3(甘氨酸-鹽酸)的緩沖液，研究合適的反應(yīng)液酸堿度。結(jié)果表明(圖3)，當(dāng)選擇pH2的甘氨酸-鹽酸緩沖液時(shí)，酶解后得到的產(chǎn)物顯示了高于pH值分別為1和3的緩沖液，因此，在后續(xù)的研究中選擇pH值為2的甘氨酸-鹽酸緩沖液。

圖2　溫度對(duì)酶解液DPPH清除和還原力的影響Fig.2　Influence of temperature on reducing power and DPPH scavenging percent of hydrolysate

圖3　緩沖液pH值對(duì)水解肽的還原力和清除DPPH自由基的影響Fig.3　Influence of different pH values on reducing power and DPPH scavenging percent of hydrolysate

2.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差分析

為考察較佳的酶解條件，選擇了酶解液的還原力及清除DPPH自由基的能力為指標(biāo)，開(kāi)展了Box-Behnken優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，并對(duì)還原力的結(jié)果進(jìn)行了分析，結(jié)果如表2所示。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到還原力方程如式(1)所示：

還原力=0.42-0.079A-0.011B-0.028C+0.027AB+0.095AC+

0.046BC-0.13A2-0.18B2-0.12C2

(1)

根據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析后得到方差分析表，如表3所示。由結(jié)果可知，模型的顯著性為極顯著(P=0.001 1)，模型的失擬性不顯著(P=0.650 1)，表明根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到了較好的模型。同時(shí)預(yù)測(cè)的R2=0.947 4，調(diào)整的AdjR2=0.879 8，該結(jié)果說(shuō)明了所建方程具有很好的擬合性。

表2　響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的方差分析表

2.2.2因素間的交互作用

圖4　酶解pH值與酶解溫度交互作用Fig.4　Interaction effects of hydrolysis pH value and temperature

Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方法的一種，可以考察不同因素之間的交互作用，根據(jù)研究結(jié)果對(duì)酶解溫度、緩沖液pH值及蛋清粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)三因素相互作用進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，酶解反應(yīng)pH值和反應(yīng)溫度在接近中心位置時(shí)具有相對(duì)較高的抗氧化值，說(shuō)明在單因素實(shí)驗(yàn)具有較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)選取的區(qū)間范圍合適。兩者的交互作用也得到了較佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

在酶解反應(yīng)pH值一定時(shí)，蛋清粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在接近選取的中心點(diǎn)時(shí)具有較佳的抗氧化性；相應(yīng)地，在蛋清粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，酶解反應(yīng)pH值在中心點(diǎn)也具有較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5)。兩者交互作用得到了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

在酶解反應(yīng)溫度固定時(shí)，蛋清粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在編碼值由-1到1的變化過(guò)程中，抗氧化值呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在蛋清粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，隨著酶解反應(yīng)溫度的改變，抗氧化值也呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，兩者在中心位置附近具有接近最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖6)。

圖5　酶解pH值與蛋清粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)交互作用Fig.5　Interaction effects of hydrolysis pH value and substrate concentration

圖6　酶解溫度與蛋清粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)交互作用Fig.6　Interaction effects of hydrolysis temperature and substrate concentration

對(duì)實(shí)驗(yàn)所得的方程和交互作用圖等實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化后，得到一組最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，此時(shí)pH值編碼為-0.44，溫度為-0.1，蛋清粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為-0.3，預(yù)測(cè)的700 nm下的還原力吸光度A為0.440，換算為實(shí)際的反應(yīng)溶液為pH2.1，反應(yīng)溫度49 ℃，蛋清粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.5%，在最優(yōu)的條件下進(jìn)行水解后發(fā)現(xiàn)，得到的700 nm下的還原力吸光度A為0.472±0.03，DPPH自由基清除率為33.4%±0.02%，較優(yōu)化前結(jié)果平均值有一定的增加。

3結(jié)語(yǔ)

蛋清粉富含蛋白等功能分子，酶解后得到的多肽顯示了較好的抗氧化效果，應(yīng)用潛力較好。采用胃蛋白酶進(jìn)行酶解條件優(yōu)化后，結(jié)果表明，酶解溫度50 ℃、酶解pH2.5和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的蛋清粉，經(jīng)酶解后可以獲得較佳的抗氧化能力；響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在pH2.1、蛋清粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.5%、反應(yīng)溫度49 ℃時(shí)，酶解液產(chǎn)生多肽具有較佳的抗氧化活性。本研究結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)蛋清多肽打下了一定的基礎(chǔ)。

后續(xù)研究需在活性肽的分離方面進(jìn)一步展開(kāi)，如可以通過(guò)膜分離、柱層析等方法獲得純化的活性多肽，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和研究；在此基礎(chǔ)上開(kāi)展胃蛋白酶的固定化方面的研究，以提高酶解的效率；同時(shí)通過(guò)定向酶解法提高活性肽含量；進(jìn)而在小試基礎(chǔ)上開(kāi)展中試研究，為后續(xù)的實(shí)際生產(chǎn)提供一定的工藝參數(shù)。

參考文獻(xiàn):

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doi:10.3969/j.issn.1671-8798.2016.03.010

收稿日期:2016-04-11

基金項(xiàng)目：浙江省重大科技專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目(2013C02007)；浙江科技學(xué)院科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(F702103E03)

作者簡(jiǎn)介:Emmanuel Kargan Dangan (1988—)，男，利比里亞人，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。

通信作者：蔡成崗，副教授，博士，主要從事食品生物技術(shù)相關(guān)的教學(xué)和研究。

中圖分類號(hào):TS201.2；TS253.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1671-8798(2016)03-0225-05

Optimization of conditions for egg white protein peptides production by pepsin hydrolysis

Emmanuel Kargan Dangan1, CAI Chenggang1,2,3, XIE Jinhai1,2,3, WANG Zhenzhen1, MAO Jianwei1,2,3

(1.School of Biological and Chemical Engineering, Zhejiang University of Science and Technology,Hangzhou 310023， China; 2.Zhejiang Provincial Key Laboratory for Chemical and Biological Processing Technology of Farm Produce, Hangzhou 310023, China; 3.Zhejiang Collaborative Innovation Center of Chemical and Biological Manufacturing for Agricultural Biological Resources, Hangzhou 310023, China)

Abstract:The Egg white protein powder as the substrates for the peptides preparation by pepsin hydrolysis were studied. The hydrolysis conditions were optimized based on the reducing power and DPPH radical scavenging analysis. The single factor experimental results showed that the reaction temperature of 50 ℃, the buffer solution pH value of 2.5 and 5% substrate concentration are the better conditions for the antioxidant activity. The response surface methodology results showed that the optimal conditions are hydrolysis temperature of 49 ℃, pH value of 2.1 and 3.5% substrate concentration, respectively. The results will be the basis for the further production of egg white protein peptides.

Keywords:egg white protein powder; pepsin; peptide; response surface methodology