高速逆流色譜技術(shù)分離決明子中蒽醌類化合物

吳秋霞++孫衛(wèi)紅++王曉

摘要：采用高速逆流色譜（HSCCC）技術(shù)分離制備決明子粗提物中的蒽醌類化合物。首先用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（體積比3 ∶ 2 ∶ 3 ∶ 2）的溶劑體系，進(jìn)一步分離，從決明子粗提物中得到5種化合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和混合組分A（含有化合物Ⅱ和Ⅳ）。將組分A用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（體積比3 ∶ 7 ∶ 5 ∶ 5）的溶劑體系進(jìn)行進(jìn)一步分離，得到2種化合物Ⅱ和Ⅳ。經(jīng)HPLC檢測(cè)，化合物Ⅰ～Ⅶ的純度分別為99.7%、96.4%、91.0%、95.3%、98.7%、97.9%、95.8%。根據(jù)ESI-MS和1HNMR所提供的數(shù)據(jù)，化合物Ⅰ～Ⅶ分別鑒定為橙黃決明素、alaternin、1-甲氧基-2-羥基大黃素、黃決明素、1-O-甲基大黃素、決明素、大黃素。表明高速逆流色譜分離技術(shù)是一種快速有效的分離蒽醌類化合物的方法。

關(guān)鍵詞：高速逆流色譜；決明子；蒽醌類化合物

中圖分類號(hào)： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0381-04

收稿日期：2015-05-04

基金項(xiàng)目：江蘇省科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：SBE2014030578）；江蘇省博士后基金（編號(hào)：1102132C）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程。

作者簡(jiǎn)介：吳秋霞（1987—），女，河南許昌人，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：wqxia19890820@163.com。

通信作者：孫衛(wèi)紅，副教授，從事植物學(xué)及其抗氧化功能和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)研究。E-mail：weihongsun2009@163.com。決明子是豆科植物決明（Cassia obtusifolia L.）或小決明（Cassia tora L.）的干燥成熟種子[1]，具有清肝明目、潤(rùn)腸通便、調(diào)壓降脂、增強(qiáng)免疫力、抗氧化和抗衰老等作用[2-4]，是一種藥食同源的中草藥植物。研究表明，決明子中的主要有效成分是蒽醌及其苷類，例如橙黃決明素、黃決明素、決明素、美決明子素和大黃素等。橙黃決明素是決明子中的一個(gè)重要蒽醌成分，對(duì)低密度脂蛋白受體基因轉(zhuǎn)錄水平有增強(qiáng)作用，能顯著降低高脂血癥大鼠的膽固醇、甘油三脂和低密度脂蛋白膽固醇[5]，也是決明子中控制患者血脂水平的主要有效成分[6]；決明子中的另一個(gè)蒽醌成分大黃素，具有保護(hù)肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞、抗癌、消炎、抗血管生成和抑制蛋白質(zhì)糖化及醛糖合成酶的作用[7-9]?；谝陨纤幚碜饔?，建立一種快速有效分離純化決明子中蒽醌類化合物的方法非常必要，對(duì)進(jìn)一步研究闡明決明子的藥理作用非常有意義。

傳統(tǒng)的決明子中蒽醌類化合物的主要分離方法是柱色譜法[10-12]。柱色譜法的固定相一般是固態(tài)物質(zhì)，會(huì)對(duì)被分離樣品中的成分產(chǎn)生不可逆吸附作用。而HSCCC是一種液-液分配色譜技術(shù)，其固定相是液體，不存在不可逆吸附現(xiàn)象。并且HSCCC相較于柱色譜法還具有進(jìn)樣量大、成本小、操作簡(jiǎn)單、回收率高等優(yōu)點(diǎn)。Yang等用6次HSCCC分離從決明子乙酸乙酯部位中分離到9種化合物[13]，分離次數(shù)多，操作繁瑣。本研究對(duì)決明子中乙酸乙酯部位進(jìn)行了堿液萃取的操作，除去更多的雜質(zhì)，然后再應(yīng)用HSCCC技術(shù)分離決明子中的蒽醌類物質(zhì)，利用2次HSCCC方法得到了7種化合物，7種化合物結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1，實(shí)現(xiàn)了快速分離。

1材料與方法

1.1原料與試劑

決明子，購(gòu)自濟(jì)南市中魯醫(yī)院；用于制備決明子粗提物用的乙醇為工業(yè)乙醇，萃取和逆流色譜分離用的試劑如石油醚、乙酸乙酯、氫氧化鈉、甲醇等均為分析純；高效液相色譜用甲醇為色譜純，美國(guó)天地公司生產(chǎn)；水為娃哈哈純凈水。

1.2主要儀器與設(shè)備

TBP300A型高速逆流色譜儀，包括多層聚四氟乙烯螺旋管（直徑2.3 mm，分離體積300 mL，β值為0.5～0.8），上海同田生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；TBP5002泵、8823B-紫外檢測(cè)器，北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限公司生產(chǎn)；3057-11 記錄儀，重慶川儀總廠有限公司生產(chǎn)；Waters 600-996高效液相色譜系統(tǒng)，配有光電二極管陣列檢測(cè)器（PDA），美國(guó)Waters公司生產(chǎn)。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1決明子原材料的鑒定取決明子粉末1 g，加甲醇 10 mL，浸漬1 h，過(guò)濾；濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，再加鹽酸1 mL，置水浴鍋上加熱30 min，立即冷卻，用乙醚提取2次，每次20 mL；合并乙醚液，蒸干，加三氯甲烷2 mL溶解殘?jiān)?，得到供試品溶液。取大黃素、大黃酚對(duì)照品，分別加甲醇制成每1 mL各含0.25、1.00 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。展開(kāi)劑為石油醚（30～60 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（體積比15 ∶ 5 ∶ 1）的上層溶液，點(diǎn)板展開(kāi)，結(jié)果見(jiàn)圖2。決明子樣品中與對(duì)照品有相同的Rf，結(jié)合決明子的性狀等特征，鑒定該決明子藥材是決明子（Cassia obtusifolia L.）。

1.3.2決明子粗提物的制備取決明子藥材 0.7 kg，粉碎，置于5 000 mL 圓底燒瓶中，加入10倍量95%的乙醇，加熱回流提取3次，每次2 h。抽濾后合并濾液，減壓濃縮，得稠浸膏，用水復(fù)溶。用等量的石油醚萃取3次，棄去石油醚相。再用等量乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮至800 mL，將濃縮液用5%的NaOH溶液萃取3次，萃取液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2～3。再用乙酸乙酯萃取酸水液3次，將萃取液減壓

濃縮至浸膏狀，得到17.3 g決明子粗提物，置于4 ℃冰箱內(nèi)用于進(jìn)一步分離。

1.3.3兩相溶劑體系及樣品溶液的制備HSCCC所用的溶劑體系為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（體積比3 ∶ 2 ∶ 3 ∶ 2和3 ∶ 7 ∶ 5 ∶ 5），按比例分別置于2 L分液漏斗中，劇烈振蕩使充分混合，于室溫下靜置分層。使用前分出上下相，超聲脫氣10 min。

HSCCC樣品溶液的制備：取決明子粗提物200 mg，加入體系為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（體積比3 ∶ 2 ∶ 3 ∶ 2 的上下相各5 mL，超聲使其完全溶解即得。取含有成分Ⅱ和Ⅳ的混合組分A 20 mg，加入體系為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（體積比3 ∶ 7 ∶ 5 ∶ 5） 的上下相各5 mL，超聲將其全部溶解即得。

1.3.4分配系數(shù)KD的測(cè)定溶劑系統(tǒng)的選擇是根據(jù)目標(biāo)化合物的分配系數(shù)（KD）確定的，當(dāng)兩相溶劑體系達(dá)到平衡后，將適量的粗樣溶解在1 mL下相中。經(jīng)HPLC測(cè)定目標(biāo)化合物在下相中的峰面積，記錄為A1。然后加等量的上相，完全混合均勻，平衡后經(jīng)HPLC再次測(cè)定目標(biāo)化合物在下相中的峰面積，記錄為A2。分配系數(shù)（KD）由下列公式確定：KD=（A1-A2）/A2。

1.3.5HSCCC的分離過(guò)程將已超聲脫氣的上相（固定相）以20 mL/min的流速泵入螺旋管中直至有上相流出，以保證固定相充滿分離螺旋管，打開(kāi)主機(jī)，使色譜儀螺旋管柱按順時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到850 r/min并穩(wěn)定后，以2.0 mL/min的流速將下相（流動(dòng)相）泵入分離螺旋管中，待流出的上相體積恒定（即下相流出時(shí)）平衡完畢，進(jìn)樣，打開(kāi)紫外檢測(cè)儀和記錄儀。檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

1.3.6HPLC分析HPLC分析條件：色譜柱：Intersil ODS-SP （4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動(dòng)相：A：乙腈，B：水。梯度洗脫：0～15 min，A：40%～70%，15～25 min，A：70%，25～30 min，A：70%～100%，30～40 min，100%；流速：1 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)：285 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2結(jié)果與分析

2.1溶劑體系的選擇

溶劑體系的選擇是HSCCC分離的難點(diǎn)，也是最關(guān)鍵的部分。HSCCC分離的溶劑體系必須在充分混勻后快速地分層（不超過(guò)30 s）；有較高的樣品溶解量和固定相保留量；而成功的HSCCC溶劑體系還要求各目標(biāo)化合物在溶劑體系中有合適的分配系數(shù)。所以溶劑體系的選擇可通過(guò)分配系數(shù)KD值的測(cè)定來(lái)確定。一般來(lái)說(shuō)，KD值的最適范圍是0.5～2.0。若KD≤0.5，說(shuō)明目標(biāo)化合物的保留值偏低，出峰太快，各組峰之間的分離度較差。若KD≥2.0，說(shuō)明目標(biāo)化合物的保留值較高，雖然能夠?qū)崿F(xiàn)分離，但出峰時(shí)間較長(zhǎng)，且峰形較寬。若0.5 2.2HSCCC分離決明子粗提物

用選定的溶劑體系石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（體積比3 ∶ 2 ∶ 3 ∶ 2），按照“1.3.4”節(jié)所述的方法對(duì)大黃蒽醌提取物進(jìn)行分離純化。稱取0.2 g提取物，按照“1.3.2”節(jié)中所述的樣品溶液制備方法對(duì)樣品進(jìn)行處理。根據(jù)“1.3.4”節(jié)所述的方法進(jìn)行分離，結(jié)果得到化合物Ⅰ 26 mg、化合物Ⅲ 11 mg、混合組分A 20 mg（主要含化合物Ⅱ和Ⅳ）、化合物Ⅴ 23 mg、化合物Ⅵ 19 mg、化合物Ⅶ 9 mg。決明子粗提物HSCCC分離見(jiàn)圖3。圖中每個(gè)陰影與所標(biāo)出的成分相對(duì)應(yīng)，而餾分A中主要含有化合物Ⅱ和Ⅳ，有待進(jìn)一步進(jìn)行HSCCC分離。用選定的溶劑體系石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（體積比3 ∶ 7 ∶ 5 ∶ 5），按照“1.3.4”節(jié)所述的方法對(duì)混合組分A進(jìn)行分離純化。將20 mg混合組分A，按照“1.3.2”節(jié)中所述的樣品溶液制備方法對(duì)樣品進(jìn)行處理。根據(jù)“1.3.4”節(jié)所述的方法進(jìn)行分離，結(jié)果得到化合物Ⅱ9 mg和化合物Ⅳ 2 mg?；旌辖M分A的HSCCC分離見(jiàn)圖4。

2.3化合物的純度檢測(cè)和結(jié)構(gòu)鑒定

為分析決明子粗提物中各成分的HPLC圖譜，分別測(cè)試了不同濃度和組成的流動(dòng)相，包括甲醇-水、乙腈-水 、乙腈-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)以及梯度洗脫等。結(jié)果表明，流動(dòng)相用乙腈-水和乙腈-0.1%磷酸水溶液相似且效果最佳。本試驗(yàn)選用乙腈-水體系，梯度洗脫的方法如“1.3.6”節(jié)所述。決明子粗提物和化合物Ⅰ～Ⅶ的HPLC見(jiàn)圖5，經(jīng)測(cè)定分離得到的各組分的純度分別為99.7%、96.4%、91.0%、953%、98.7%、97.9%、95.8%。

化合物Ⅰ：ESI-MS，m/z：329[M-H]-，分子式：C17H14O7；1H-NMR（400 MHz，DMSO）：2.33（3 H，s）、3.90（3 H，s）、3.97（3 H，s）、4.90（3 H，s）、7.16（1 H，s）、7.79（1 H，s）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[14-17]基本一致，確定化合物Ⅰ為橙黃決明素。

化合物Ⅱ：ESI-MS，m/z：285[M-H]-；分子式：C15H10O6；1H-NMR（400 MHz，DMSO）：3.16（3 H，s）、6.46（1 H，d，J=2.4）、7.06（1 H，d，J=2.4）、7.52（1 H，s）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[14]基本一致，確定化合物Ⅱ?yàn)閍laternin。

化合物Ⅲ：ESI-MS，m/z：299[M-H]-；分子式：C16H12O6；1H-NMR（400 MHz，DMSO）：2.33（3 H，s）、3.70（3 H，s）、6.56（1 H，d，J=2.4）、6.95（1 H，J=2.4）、7.76（1 H，s）、13.25（1 H，s）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[11]基本一致，確定化合物Ⅲ為1-甲氧基-2-羥基大黃素。

化合物Ⅳ：ESI-MS，m/z：357[M-H]-，327[M-OCH3]-；分子式：C19H18O7；1H-NMR（400 MHz，DMSO）：2.27（3 H，s，3-CH3）、3.80、3.86、3.87、3.98（各3 H，s，1，6，7，8-OCH3）、7.50（1 H，s，H-5）、7.73（1 H，s，H-4），以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[16-17]基本一致，確定化合物Ⅳ為黃決明素。

化合物Ⅴ：ESI-MS，m/z：283[M-H]-；分子式：C16H12O5；1H-NMR（400 MHz，DMSO）：2.30（3 H，s）、3.82（3 H，s）、7.31（1 H，d，J=1.2）、7.63（1 H，d，J=1.2）、7.72（1 H，s）、7.8（1 H，s）、12.82（1 H，s）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[15]基本一致，確定化合物Ⅴ為美決明子素。

化合物Ⅵ：ESI-MS，m/z：343[M-H]-；1H-NMR（400 MHz，DMSO）：2.27（3 H，s，3-CH3）、3.34、3.80、3.98（各3 H，s，1，6，7-OCH3）、7.31（1 H，s，H-5）、7.80（1 H，s，H-4）、13.08（1 H，s，8-OH）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[16-17]基本一致，確定化合物Ⅵ為決明素。

化合物Ⅶ：ESI-MS，m/z：268.8[M-H]-；分子式：C15H10O5；1H-NMR（400 MHz，DMSO）：2.44（3 H，s）、6.56（1 H，d，J=2.4）、7.10（1 H，d，J=2.4）、7.10（1 H，s）、7.57（1 H，s）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[15，18]基本一致，確定化合物Ⅶ為大黃素。

3結(jié)論

應(yīng)用HSCCC分離方法，可從決明子中成功地分離出7種高純度的蒽醌類成分，其純度分別為99.7%、96.4%、91.0%、95.3%、98.7%、97.9%、95.8%。高速逆流色譜操作簡(jiǎn)單，快速高效，重現(xiàn)性好。特別是多種溶劑體系相結(jié)合以及HSCCC和多種分離方法相結(jié)合的思路，對(duì)天然植物資源中活性成分分離純化具有很好的應(yīng)用價(jià)值，也可為具活性植物特別是中草藥質(zhì)量控制所需要高純度物質(zhì)對(duì)照品的制備提供一種高效實(shí)用的方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典：一部[M]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：135-136.

[2]張榮，劉必旺，王永輝，等. 決明子乙酸乙酯提取物對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠的防治作用[J]. 山西中醫(yī)，2009，25（7）：45-47.

[3]韓昌志. 決明子煎劑對(duì)家兔和狗睫狀肌中乳酸脫氫酶活性的影響[J]. 同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，23（6）：470-472.

[4]張加雄，萬(wàn)麗，胡軼娟，等. 決明子提取物瀉下作用研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2005，16（6）：467-468.

[5]李明元，羅孟軍，葉娉，等. 橙黃決明素的降血脂作用研究[J]. 中藥藥理與臨床，2008，24（6）：36-37.

[6]馮艷平. 決明子降血脂有效成分探討[J]. 中國(guó)醫(yī)藥指南，2013（5）：258-259.

[7]Ghosh S，Sarma M D，Patra A A. Anti-inflammatory and anticancer compounds isolated from Ventilago madraspatana Gaertn.，Rubia cordifolia Linn. and Lantana camara Linn.[J]. Journal of Pharmacy and Pharmacology，2010，62（9）：1158-1166.

[8]He Z H，He M F，Ma S C，et al. Anti-angiogenic effects of rhubarb and its anthraquinone derivatives[J]. Journal of Ethnopharmacology，

2009，121（2）：313-317.

[9]Jang D S，Lee G Y，Kim Y S，et al. Anthraquinones from the seeds of Cassia tora with inhibitory activity on protein glycation and aldose reductase[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin，2007，30（11）：2207-2210.

[10]郝延軍，桑育黎，趙余慶. 決明子蒽醌類化學(xué)成分研究[J]. 中草藥，2003，34（1）：18-19.

[11]戴迎春，鄧楠，劉文，等. 決明子中橙黃決明素的提取、分離及純化方法的研究[J]. 中南藥學(xué)，2011，9（3）：179-182.

[12]張晶. 對(duì)決明子橙黃決明素的分離提取的研究分析[J]. 中外醫(yī)學(xué)研究，2012，10（20）：153.

[13]Yang J H，Ye H Y，Lai H J，et al. Separation of anthraquinone compounds from the seed of Cassia obtusifolia L. using recycling counter-current chromatography[J]. Journal of Separation Science，2012，35（2）：256-262.

[14]Shu X K，Duan W J，Liu F，et al. Preparative separation of polyphenols from the flowers of Paeonia lactiflora Pall. by high-speed counter-current chromatography[J]. Journal of Chromatography B，2014，947/948：62-67.

[15]謝亞. 中藥決明子有效成分提取分離及結(jié)構(gòu)的電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（ESI-MSn）研究[D]. 廣州：華南師范大學(xué)，2007.

[16]張?jiān)品澹簴|，郭祀遠(yuǎn)，等. 決明子活性成分的高速逆流色譜分離[J]. 華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，37（10）：129-134.

[17]唐力英，王祝舉，傅梅紅. 決明子中游離蒽醌類化學(xué)成分研究[J]. 中藥材，2009，32（5）：717-719.

[18]Guo S Y，F(xiàn)eng B，Zhu R N，et al. Preparative isolation of three anthraquinones from Rumex japonicus by high-speed counter-current chromatography[J]. Molecules，2011，16（2）：1201-1210.