醬油中抗草甘膦大豆轉(zhuǎn)基因多種成分的檢測：實時熒光定量PCR和傳統(tǒng)PCR的比較

張文志++魯緋++閆紅

摘要：采用基于SYBR Green探針的實時熒光定量PCR方法和傳統(tǒng)PCR方法對醬油中的大豆轉(zhuǎn)基因靶基因CaMv35S啟動子、NOS終止子、EPSPS、18S進行了高通量檢測，同時檢測了內(nèi)源參照Lectin基因。研究發(fā)現(xiàn)，醬油樣品中同時存在CaMv35S、NOS、18S靶基因，而不存在靶基因EPSPS，表明轉(zhuǎn)基因成分EPSPS在食品加工過程中已被降解；熔解曲線分析表明，實時熒光PCR對轉(zhuǎn)基因的檢測獲得了很好的特異性，與傳統(tǒng)PCR相比，具有快速、高通量、高選擇性、高靈敏度的優(yōu)勢。本研究建立的對醬油中多種抗草甘膦大豆轉(zhuǎn)基因成分的快速、高通量、高靈敏的定量檢測方法將在轉(zhuǎn)基因食品的檢測領域具有很大的應用前景。

關鍵詞：PCR RT-PCR；檢測

中圖分類號： TS264.2+1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0372-05

收稿日期：2015-05-12

作者簡介：張文志（1990—），男，碩士研究生，研究方向為化學生物學分析。E-mail：170850483@qq.com。

通信作者：魯緋，博士，研究員。E-mail：lufeilufei515@sina.com。大豆已經(jīng)成為人們生活中不可或缺的食物及食品原料，在我國用途非常廣泛，消費市場上大豆制品種類繁多。我國是大豆進口大國，根據(jù)資料統(tǒng)計，從開放大豆進口以來，我國每年大豆進口量逐年增加，到2014年我國大豆進口量已超過7 000萬t，且進口大豆中有超過90%為轉(zhuǎn)基因大豆[1-2]。

我國對于轉(zhuǎn)基因食品的監(jiān)管工作非常重視。2001年，國務院頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》，對大豆、玉米等國內(nèi)流通的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，規(guī)定了統(tǒng)一的標志制度，即確定了食品中轉(zhuǎn)基因成分的最低限標準[3]。然而，在轉(zhuǎn)基因食品飽受爭議的今天，我國的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品監(jiān)控技術體系依然缺乏。較為落后的檢測設備和相關技術，使得安全評價及審批許可制度缺乏技術保障[4]，嚴重制約了我國對于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全監(jiān)管，也嚴重妨礙了廣大消費者對轉(zhuǎn)基因食品安全性的深入了解[5]。因此，建立可靠、準確、快速、高通量的食品轉(zhuǎn)基因成分檢測方法迫在眉睫。

傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因成分檢測方法主要分為2類：酶聯(lián)免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[6]和聚合酶鏈式反應法（polymerase chain reaction，PCR）[7]。分別以蛋白質(zhì)和核酸為檢測對象。ELISA目前已有商業(yè)化試劑盒，它通過間接地檢測轉(zhuǎn)基因成分表達出的蛋白來推測轉(zhuǎn)基因成分，雖然其具備很好的選擇性，但缺乏定量準確性，且價格較為昂貴，樣品前處理復雜。傳統(tǒng)的PCR方法直接以提取的基因片段為檢測對象，靈敏度好，但定量能力較差，且非目標片段容易引起信號的假陽性和假陰性。在傳統(tǒng)PCR原理的基礎上，巢式PCR[8]、多重PCR[9]等方法也發(fā)展起來，其選擇性和準確性得到很大提高，但仍然是半定量的方法。

實時熒光定量PCR[10]是一種可以特異性靶標樣品中的目標DNA片段，并輸出該目標DNA定量信息新方法，相對于上述方法，這種方法的定量信息更準確，方法更加靈敏，因此在大豆轉(zhuǎn)基因制品的檢測上得到廣泛應用[11-13]。SYBR Green是一種常用的結合雙鏈 DNA 的染料，本身在激發(fā)光下只發(fā)出微弱的熒光，結合雙鏈DNA后，熒光增強1 000倍，因此常用來對雙鏈DNA進行定量分析[14]。本研究建立了基于SYBR Green染料的實時熒光定量PCR，用于高通量分析多種醬油中的大豆轉(zhuǎn)基因成分，希望為轉(zhuǎn)基因生物標志的監(jiān)管體系提供更可靠的技術支撐。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要材料試驗所用含抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆成分的醬油由北京市食品及釀酒產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗一站提供。

1.1.2主要試劑無水乙醇，異丙醇，70%乙醇（均為分析純）。深加工產(chǎn)品DNA提取試劑盒DP326（天根生化科技有限公司，其中包括GMO1、GMO2、Proteinase K、TE緩沖液）；Carrier RNA（天根生化科技有限公司）。0.1 mol/L Tris-Cl（pH值8.0）；乙酸；EDTA-Na2；ABI熒光染料；2×PCR Reagent（天根生化科技有限公司）；瓊脂糖。

1.1.3主要儀器BIO-RAD CF×96熒光PCR儀；METTLER TOLEDO電子天平（十萬分之一，瑞士梅特勒公司）；Eppendorf移液槍（1 000、100、10、2.5 μL）；湘儀TG16-WS臺式高速離心機；恒溫水浴鍋（恒發(fā)）；渦旋振蕩器；磁力攪拌器；BIO-RAD MJ Mini PCR儀。

1.2試驗方法

1.2.1凝膠緩沖液及凝膠的制備凝膠緩沖液：50×TAE溶液：取Tris-HCl 242 g，乙酸 57.1 mL，EDTA-Na2 37.2 g加蒸餾水溶解后定容到1 000 mL。

凝膠：取1.5 g瓊脂糖加入到三角瓶中，加入100 mL稀釋50倍的50×TAE緩沖液，加熱，充分溶解。進行瓊脂糖凝膠電泳之前，將凝膠加熱熔解后使用。

1.2.2DNA的提取采用試劑盒法，按照深加工產(chǎn)品DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）說明步驟操作。

1.2.2.1醬油樣品預處理取醬油30 mL，加入60 mL無水乙醇混勻，置冰箱（-20 ℃）放置10 min后，10 000 r/min離心10 min。棄上清。在沉淀中加入30 mL 0.1 mol/L Tris-Cl（pH值8.0）溶液，用力搖勻，全部轉(zhuǎn)移到100 mL燒杯中，于磁力攪拌器上攪拌2 h。分裝至1.5 mL離心管中，12 000 r/min 離心10 min。棄上清。沉淀中焦糖色素及鹽等小分子已全部去除，可用于DNA提取 （注：棄上清之后要將分裝后所有沉淀取到1個1.5 mL離心管中，用于后續(xù)DNA的提?。?

1.2.2.2DNA提取取上述預處理所得樣品，加500 μL緩沖液GMO1和20 μL Proteinase K（20 g/mL），渦旋振蕩1 min。56 ℃孵育1 h，孵育過程中每15 min振蕩1次。加入200 μL緩沖液GMO2，充分混勻，渦旋振蕩1 min，室溫靜置10 min。12 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。向上清液中加入1 μL Carrier RNA，再加入0.7倍體積的異丙醇，充分混勻。12 000 r/min離心3 min，棄上清，保留沉淀。加入700 μL 70%乙醇，渦旋振蕩5 s，12 000 r/min離心 2 min，棄上清。重復2次。開蓋倒置，室溫5～10 min，徹底晾干殘余的乙醇。加入20 ～50 μL洗脫緩沖液TE，渦旋振蕩 1 min，最終得到DNA緩沖液。

1.2.3PCR引物設計引物參照王媛等的設計[15]，由三博遠志公司合成（表1）。

1.2.4PCR反應體系和反應條件

1.2.4.1普通PCR反應體系和反應條件在96孔板上同時分別對醬油DNA提取液中凝集素（Lectin）基因、CaMv35S啟動子、NOS終止子、18S基因和EPSPS外源基因進行PCR擴增，另外，對Lectin基因、CaMv35S啟動子、NOS終止子、18S基因標準樣品以同樣條件進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μL。其中含2×PCR Reagent 12.5 μL；上、下游引物分別0.5 μL；模板DNA 4 μL，用滅菌雙蒸水定容至25 μL。陰性對照不含樣品。

PCR擴增條件：退火 94 ℃ 3 min；退火及延伸 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 1 min，37個循環(huán)；循環(huán)結束后70 ℃ 5 min。

1.2.4.2RT-PCR反應體系和反應條件在96孔板上同時分別對醬油DNA提取液中Lectin基因、CaMv35S啟動子、NOS終止子、18S基因和EPSPS外源基因進行實時熒光定量PCR擴增。PCR反應體系為25 μL。其中含2×PCR Reagent 12.5 μL；上、下游引物各0.5 μL；模板DNA 4 μL，用滅菌雙蒸水定容至25 μL。陰性對照不含樣品。

RT-PCR擴增條件：退火 94 ℃ 30 s；退火及延伸 94 ℃ 5 s，60 ℃ 80 s，40個循環(huán)。 循環(huán)結束后開始熔解階段，溫度從65 ℃升至95℃，每升高0.5 ℃儀器自動收集熒光信號。

按照以上反應條件和反應體系進行PCR和RT-PCR反應，普通PCR反應結束后，取5 μL反應產(chǎn)物與1 μL loading buffer混勻，加入到進樣孔中在180 V/0.1 A下進行凝膠電泳，38 min后取出凝膠，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結果。

2結果與分析

2.1基因組的提取結果

要成功進行PCR擴增，首先需保證DNA樣品的純度。經(jīng)分光光度計測量，試劑盒提取的樣品DNA的濃度為100～500 ng/μL，DNA純度較好，適合進行PCR擴增。

2.2醬油中轉(zhuǎn)基因成分定性PCR和凝膠電泳分析

Lectin基因作為內(nèi)源性的大豆看家基因，在大豆細胞中基因組的表達量基本恒定，很少受外部環(huán)境影響，因此，本研究選取了Lectin基因作為內(nèi)部參照[16]，考察Lectin基因的擴增，也可以判斷提取的DNA的量和純度是否合適進行PCR分析，排除假陰性結果的存在。根據(jù)圖1的3、4條帶可以看出，醬油中提取的DNA中含有足夠的Lectin基因用于PCR擴增，擴增效果良好。擴增產(chǎn)物約100 bp。然而Lectin的陰性對照組出現(xiàn)模糊的亮帶，可能來自于外部基因污染。

此外，由圖1可以看出，在醬油所提取的DNA的PCR擴增結果中，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆中的調(diào)控元件CaMv35S啟動子、NOS終止子和18S基因均得到明顯的擴增產(chǎn)物，其對照組均為陰性。而外源基因EPSPS沒有擴增產(chǎn)物。結果表示醬油樣品中的轉(zhuǎn)基因成分含有CaMv35s啟動子、Nos終止子和18S基因，而抗草甘膦基因中的EPSPS成分可能已被降解。

各種基因標準樣品PCR擴增后的結果與圖1的條帶結果一致，進一步證明了在醬油基因組提取中，無需進一步分離就能夠得到純度較高的轉(zhuǎn)基因成分進行PCR擴增分析，其結果較為準確（圖2）。值得特別注意的是，之前Lectin基因陰性對照中的條帶已經(jīng)基本消失不見，進一步證明在圖1的試驗中，PCR反應或凝膠電泳過程中對Lectin基因陰性對照組造成了外部污染。同時，圖2-B中的NOS陰性對照中出現(xiàn)

了模糊的亮帶，而圖1中NOS陰性對照組并未出現(xiàn)條帶。這個現(xiàn)象也進一步說明了陰性對照存在著假陽性外部污染。

2.3實時熒光定量PCR擴增結果分析

目前，定性PCR和凝膠電泳分析僅能夠?qū)︶u油中的轉(zhuǎn)基因成分完成初步的定性和篩選，實驗發(fā)現(xiàn)其結果容易因外部污染造成假陽性，因此準確性較差。而實時熒光定量PCR可對醬油樣品中提取出的轉(zhuǎn)基因成分進行進一步定性確認和定量標定。

實時熒光定量PCR對醬油樣品DNA提取物中的Lectin基因、CaMv35S啟動子、NOS終止子、18S基因、EPSPS外源基因進行了研究（圖3）。上述前4種基因都存在擴增產(chǎn)物，EPSPS 外源基因不存在擴增產(chǎn)物，根據(jù)軟件分析結果，其中Lectin、CaMv35S、NOS、18S、EPSPS的CT平均值分別為 33.46、33.15、30.16、35.45、0.00，該結果與定性PCR結果一致。同時所有5組陰性對照試驗均沒有擴增產(chǎn)物，進一步證明了試驗結果的準確性，與定性PCR相比，避免了外部污染引起的假陽性。因為該醬油樣品來源于抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆，而EPSPS基因是抗草甘膦基因的重要序列。因此，該檢測結果也準確地說明了EPSPS基因在食品中存在著降解和損耗。

為驗證該方法的重現(xiàn)性和準確性， 開展了4次實時熒光

定量PCR的重復試驗（圖4）。結果表明，對于相同批次的醬油樣品，PCR擴增結果重現(xiàn)性較好，Lectin、CaMv35S、NOS、18S 這4種基因都產(chǎn)生了擴增產(chǎn)物，其相對豐度基本一致，EPSPS基因均沒有擴增產(chǎn)物。

2.4熔解曲線分析

本研究中使用的是SYBR Green染料，能與雙鏈DNA發(fā)生非特異性結合，引發(fā)其熒光增強，由于這種結合的非特異性，所以假陽性擴增產(chǎn)物也可能引發(fā)熒光信號的增強，影響檢測的準確度[14]。因此，需要結合熔解曲線來分析PCR擴增反應的特異性。

在完成PCR擴增后，逐漸增加反應體系的溫度，同時監(jiān)測每一步的熒光值（RFU），隨著反應產(chǎn)物中雙鏈DNA在高溫下逐步解鏈，熒光強度隨時間逐漸降低。做-d（RFU）/dT與溫度的關系圖，則得到PCR產(chǎn)物的熔解曲線，這里T為時間。一般的，特異性擴增產(chǎn)物解鏈溫度的峰值（Tm值，即雙鏈DNA解鏈50%的溫度）比非特異性擴增產(chǎn)物的Tm值高，因此可區(qū)別出特異性信號和非特異性信號。

由圖5可見，醬油樣品中提取的轉(zhuǎn)基因成分里，CaMv35S、NOS、18S基因的PCR擴增產(chǎn)物的熔解曲線均為單峰，為典型的特異性擴增，解鏈溫度分別為83.1、75.8、84.5 ℃。Lectin基因擴增產(chǎn)物的熔解曲線在82.8 ℃有1個明顯的特異性擴增峰，另外，在77.5 ℃處還有1個非特異性擴增產(chǎn)生的小峰，這個結果也一定程度說明了定性PCR陰性對照中的凝膠電泳亮帶的來源（圖1條帶3），為非特異性擴增產(chǎn)生。同時，與前面的結果一致，因為EPSPS基因沒有產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，所有其熔解曲線沒有任何特征峰。

3結論與討論

PCR技術已經(jīng)被廣泛應用于基因組DNA的檢測中，具有特異性高、靈敏度高等特點。實時熒光定量PCR通過在PCR反應體系中加入熒光基團，利用信號的采集和積累來實時檢測PCR反應進度，根據(jù)反應CT值做到對基因的定量檢測。這種方法的定量信息更準確，方法更加靈敏，因此可以用于大豆轉(zhuǎn)基因制品的檢測。

本研究完成了對醬油這樣的實際樣品中所含的多種大豆抗草甘膦轉(zhuǎn)基因成分的快速、高通量檢測。首先，采用試劑盒成功從醬油樣品中提取出了基因組DNA，并設計5組探針，針對樣品中大豆的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因成分進行了定性PCR和實時熒光PCR擴增，對比標準樣品，對定性PCR的結果進行了凝膠電泳分析。試驗結果顯示，利用抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆（或豆粕）為原料產(chǎn)出的醬油中含有抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的調(diào)控元件CaMv35s啟動子、Nos終止子、以及18S基因，并同時可以檢測到內(nèi)源基因Lectin。然而，EPSPS外源基因并沒有檢測到。說明EPSPS外源基因在食品加工中可能被降解。

本研究利用實時熒光定量PCR技術同時成功檢出了多種醬油中所含的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆成分，內(nèi)源參照基因Lectin的CT值和目的基因的CT值相近，說明結果可靠有效，達到了極高的檢測靈敏度。試驗儀器采用的BIO-RAD MJ Mini PCR為96孔，可同時測定32個樣本，每個樣本為3個平行，可以進行高通量實時分析，與傳統(tǒng)PCR相比節(jié)約了大量的時間。

與傳統(tǒng)PCR相比，RT-PCR方法具有更好的分析特異性[17]。凝膠電泳分析結果顯示，定性PCR反應結果Lectin基因陰性對照組中有1條模糊的條帶，即造成了外界污染；而在相應的RT-PCR中，Lectin基因陰性對照組并沒有擴增產(chǎn)物。該現(xiàn)象表明傳統(tǒng)PCR容易在定性分析中因外界污染造成假陽性，具有技術上的缺陷，而實時熒光定量PCR克服了這一缺陷。熔解曲線的分析能夠很好地區(qū)分特異性擴增產(chǎn)物和非特異性擴增產(chǎn)物，進一步證實了Lectin基因擴增中產(chǎn)生了非特異性產(chǎn)物，有效地提高了分析的準確性。

本研究建立的RT-PCR方法作為一種更直觀、更準確和更快速的轉(zhuǎn)基因成分高通量檢測方法可以為食品質(zhì)量監(jiān)管機構提供更好的技術支持，有利于管理市場上轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品和規(guī)范轉(zhuǎn)基因原料的流通。

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