油茶花蜜期不同飼喂條件對蜜蜂體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性的影響

張燕新++張學文++楊娟++趙洪木++楊爽++王艷輝

摘要：分析油茶花期不同飼喂條件對蜜蜂體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性的影響，以探討蜜蜂油茶花蜜中毒的原因。采用糖濃度為35%的糖水飼喂西方蜜蜂蜂群，試驗組采用檸檬酸分別將糖水的pH值調(diào)整為3.5、4.5，對照組不添加檸檬酸。觀察并記錄不同飼喂條件下的蜂群群勢和爛子情況，測定蜜蜂體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性。結(jié)果表明，當pH值為3.5時，蜜蜂爛子情況輕微，蜜蜂體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的比活力隨喂食時間的增長呈明顯升高趨勢，比活力差異顯著（P<0.05）；當pH值為7.0時，乙酰膽堿酯酶的比活力隨喂食時間的增長呈緩慢升高趨勢甚至有所下降，飼喂1周后比活力差異不顯著（P>0.05），爛子情況比其他2組嚴重。飼料中添加檸檬酸喂食蜜蜂后，檸檬酸與蜜蜂采食的油茶花蜜中的生物堿結(jié)合，從而釋放乙酰膽堿酯酶，使乙酰膽堿酯酶活性升高。

關鍵詞：油茶花蜜；蜜蜂爛子；乙酰膽堿酯酶

中圖分類號： S896.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0358-03

收稿日期：2015-05-11

基金項目：云南省科技廳重點新產(chǎn)品開發(fā)計劃（編號：2011BB012）；國家蜂產(chǎn)業(yè)技術體系專項（編號：CARS-45-SYZ 17）；云南省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所青年創(chuàng)新基金（編號：QC2015005）。

作者簡介：張燕新（1987—），女，云南曲靖人，碩士研究生，主要從事蜂產(chǎn)品質(zhì)量與安全研究。E-mail：dreamfly0517@hotmail.com。

通信作者：王艷輝，副研究員，主要從事蠶桑蜜蜂資源利用研究。E-mail：wyh686686@sina.com。油茶（Camellia oleifera Abel.）別稱茶籽樹、茶油樹、白花樹等，屬山茶科山茶屬，為常綠灌木或小喬木，是我國重要的木本油料植物，與油橄欖、油棕、椰子并稱為世界四大木本油料植物，被譽為“東方橄欖油”[1]。油茶花花期長、流蜜量大，是很好的蜜源植物。但油茶具有自花不育性，雖然樹大花多但結(jié)果很少，有“千花一果”之稱，亟需傳粉蜜蜂授粉。開發(fā)利用油茶蜜源[2]不僅可增加養(yǎng)蜂戶的收入，還能大幅提高茶籽的產(chǎn)量和出油率[3]。由于油茶花蜜中含有對蜜蜂具有毒性的物質(zhì)，蜜蜂采食后出現(xiàn)腹部膨脹、喪失飛翔能力等癥狀，成蜂在地面上爬行，幼蟲中毒后死亡腐爛，出現(xiàn)蜂群群勢下降等現(xiàn)象[4]。對于蜜蜂油茶花蜜中毒現(xiàn)象，康雪冬等研究認為，油茶花蜜中含半乳糖的寡糖成分，棉子糖和水蘇糖是引起蜜蜂中毒的主要因素，可能是蜜蜂不能利用寡糖中的半乳糖而造成消化、代謝上的障礙所致[5]。棉子糖和水蘇糖中均結(jié)合有半乳糖成分，因此認為半乳糖是油茶花蜜中導致蜜蜂中毒的物質(zhì)。黃堅研究認為，茶花引起蜜蜂中毒是由于茶樹花蜜、油茶花蜜中均含有較高濃度生物堿等不易消化的物質(zhì)[6]。蜜蜂幼蟲食后不易消化，后腸阻塞造成營養(yǎng)不良而死亡。生物堿不僅會造成蜜蜂消化障礙，還是一種乙酰膽堿酯酶抑制劑[7-9]。乙酰膽堿酯酶是昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的酶系之一[10]，在中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)中與乙酰膽堿受體共同參與完成神經(jīng)-神經(jīng)、神經(jīng)-肌肉突觸之間動作電位的傳遞。乙酰膽堿酯酶的主要生理功能是催化水解陽離子性神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，維持神經(jīng)沖動正常傳遞[11]。油茶花蜜中的生物堿可能影響了蜜蜂神經(jīng)系統(tǒng)中的乙酰膽堿酯酶，導致神經(jīng)信號傳遞阻斷而致使昆蟲死亡。根據(jù)蜂農(nóng)多年的養(yǎng)蜂經(jīng)驗，酸飼料可中和茶花蜜中的生物堿，并能促進蜜蜂消化，是其常用的方法，包括檸檬酸、醋酸等。本試驗采用喂食檸檬酸的方法，測定蜜蜂體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性，以探討蜜蜂油茶花蜜中毒的現(xiàn)象，以期為油茶花蜜生物堿的進一步開發(fā)提供依據(jù)，并有望將其作為新型乙酰膽堿酯酶抑制劑。

1材料與方法

1.1供試蟲源

采用濃度為35%且pH值分別為3.5、4.5、7.0的糖水喂食西方蜜蜂，每個梯度3群，共9群。白天蜜蜂正常采集油茶花蜜粉，隔天晚上飼喂1次，飼喂量為每群800 mL，連續(xù)飼喂4周。第1次測定蜂群群勢后，每周記錄蜂群的成蜂量（脾）、封蓋子數(shù)（包括健康和不健康封蓋子）、爛子數(shù)。每群蜜蜂取樣3只進行試驗。

1.2試驗地點

試驗于西雙版納地區(qū)普文蜂場進行，普文鎮(zhèn)位于東經(jīng)101°23′、北緯22°33′，地處云南省西雙版納地區(qū)景洪市最北部。該地區(qū)最高海拔1 797.3 m、最低海拔772 m、年平均氣溫20.2 ℃、年平均降水量1 675.6 mm、全年日照時數(shù)1 990 h，屬于北亞熱帶高原季風氣候，適宜茶葉、咖啡、水果等植物的生長。

1.3主要試劑和儀器

主要試劑為1 mg/mL牛血清白蛋白標準品（Albumin bovine serum，云科生物工程公司），考馬斯亮藍G-250（北京索萊寶科技有限公司），1.6 mmol/L碘化硫代乙酰膽堿（Acetylthiocholine iodide，ATChI，ACROS ORGANICS公司），5，5′-二硫代雙硝基苯甲酸[5，5′-dithio-bis（2-nitrobenzoicacid）]（DTNB，Damas-beta公司）。主要儀器為高速冷凍離心機、xMark型酶標儀、玻璃勻漿器。

1.4活體抑制粗酶液制備

采用0.9% NaCl溶液清洗蜜蜂樣品，以1 g ∶ 5 mL的比例于0.01 mol/L磷酸緩沖液（1 mmol/L EDTA、1% TritonX-100、1 mol/L NaCl，pH值8.0）中冰浴，研磨成勻漿，勻漿液于4 ℃、15 000 r/min離心20 min，取上清液作為待測酶液。

1.5蛋白質(zhì)及AChE活性測定

參照考馬斯亮藍G-250法[12]測定酶源蛋白質(zhì)含量，以牛血清蛋白為標準蛋白。參照張瑩等的酶活性測定方法[13]測定AChE活性，以0.8 mmol/L碘化硫代乙酰膽堿（ATChI）為反應底物，以0.125 mmol/L 5，5′-二硫代雙硝基苯甲酸（DTNB）為顯色劑。取50 μL待測酶液、100 μL ATChI底物，混勻后置于40 ℃酶標儀中保溫10 min，加入100 μL DTNB顯色劑顯色并終止反應。于412 nm處測定吸光度（D值），按以下公式計算AChE的比活力[14-15]。

AChE比活力=ΔD×Ve×L×V1×t×m

。

（1）

式中：V表示反應體系的總體積，mL；V1表示反應體系中所加酶液的體積，mL；m表示反應體系中AChE的實際蛋白質(zhì)含量，mg；消光系數(shù)（e）為13.6，光程（L）為1 cm。

1.6數(shù)據(jù)處理分析

所有測定均重復3次，采用Origin 8.5、SPSS軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理和分析。

2結(jié)果與分析

2.1蜜蜂中毒癥狀

經(jīng)過1個月的觀察，采食了油茶花蜜的蜜蜂陸續(xù)出現(xiàn)幼蟲中毒后死亡腐爛、蜂群群勢下降等現(xiàn)象。在飼料中添加檸檬酸的蜂群，其爛子數(shù)低于未喂食檸檬酸的蜂群，飼料pH值為3.5的蜂群其爛子情況最為輕微。

2.2蜜蜂體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性的變化

當pH值為3.5時，乙酰膽堿酯酶的比活力隨著檸檬酸飼喂時間的增長呈明顯增加趨勢（圖1）。當pH值為4.5時，乙酰膽堿酯酶的比活力隨著檸檬酸飼喂時間的增長而增加，但有逐漸變緩的趨勢（圖2）。當pH值為7.0時，即糖水中未添加檸檬酸的3個蜂群，乙酰膽堿酯酶的比活力開始時隨著飼喂時間的增長而增加，但趨勢更加緩慢，甚至有下降的趨勢（圖3）。

2.3喂食檸檬酸對蜜蜂體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性的影響

由表1可知，針對3個梯度中的第2個蜂群，喂食之前蜂

群之間蜜蜂體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的比活力為0.16～0.18 U/mg。飼喂檸檬酸1個月之后，在pH值為3.5、4.5的2個組中，其蜜蜂體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的比活力均升高至 0.23 U/mg，與飼喂檸檬酸前相比差異顯著；飼料中未添加檸檬酸的蜂群中，其蜜蜂體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的比活力仍在0.17 U/mg 左右，與飼喂檸檬酸前相比差異不顯著（表1）。從整體來看，pH值為3.5的3個蜂群中，其蜜蜂體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性高于另外2個組（圖4、圖5）。

3結(jié)論與討論

蜜蜂自然中毒是指蜜蜂采食某種天然植物的花粉、花蜜、甘露蜜（蚜蟲、介殼蟲等昆蟲分泌的甜汁經(jīng)蜜蜂采集釀成）后出現(xiàn)的中毒現(xiàn)象。在養(yǎng)蜂生產(chǎn)中，多見于有毒植物中毒、棗花中毒、茶花中毒、油茶中毒、甘露蜜中毒[16]。對于蜜蜂棗花期中毒的原因，目前多認為是由于花粉和花蜜中的生物堿、游離鉀離子濃度不當所引起[17-18]。對于蜜蜂油茶中毒現(xiàn)象，目前認為是蜜蜂不能消化棉子糖和水蘇糖等，并未探討油茶期蜜蜂體酶的變化。

本研究從乙酰膽堿酯酶活性變化的角度探討蜜蜂油茶花蜜中毒現(xiàn)象。結(jié)果表明，在飼料中添加檸檬酸并喂食4周后，蜂群蜜蜂體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶活性升高，與喂食檸檬酸前呈顯著性差異，爛子情況減弱；在空白組即未喂食檸檬酸的蜂群中，蜜蜂體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性的升高趨勢緩慢，與喂食前酶活性的差異不顯著，爛子情況比其他2組嚴重。本研究證實，喂食檸檬酸可改善蜜蜂采食油茶花蜜后的爛子情況和蜂群群勢。油茶花蜜中含有生物堿，生物堿是一種乙酰膽堿酯酶抑制劑，會與蜜蜂神經(jīng)系統(tǒng)中的乙酰膽堿酯酶結(jié)合，導致神經(jīng)信號傳遞阻斷而致使蜜蜂死亡。在飼料中添加檸檬酸，蜜蜂食用后，檸檬酸與蜜蜂采食的油茶花蜜中的生物堿結(jié)合，從而釋放乙酰膽堿酯酶，使乙酰膽堿酯酶活性升高。

對于蜜蜂油茶花蜜中毒現(xiàn)象，不僅要關注棉子糖、水蘇糖等蜜蜂不能消化的糖，還要重視生物堿的作用[19-21]。明確蜜蜂油茶花蜜中毒的真正原因，深入探討蜜蜂油茶花蜜中毒的作用機理，進而找到更好的解毒劑，使蜜蜂安全有效地采集油茶蜜粉，對油茶進行授粉并提高油茶籽產(chǎn)量。本研究為進一步定量分析油茶花蜜中生物堿對乙酰膽堿酯酶活性的抑制作用奠定了基礎，并有望開發(fā)油茶花蜜生物堿作為新型乙酰膽堿酯酶抑制劑。

參考文獻：

[1]潘捷. 湖南省現(xiàn)有油茶林低產(chǎn)原因分析[J]. 湖南林業(yè)科技，2010，37（3）：46-47，50.

[2]郭冬生. 蜜蜂采集油茶蜜粉時蜂群的狀況分析[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014（12）：125-126.

[3]鄧園藝，喻勛林，羅毅波.傳粉昆蟲對我國中南地區(qū)油茶結(jié)實和結(jié)籽的作用[J]. 生態(tài)學報，2010，30（16）：4427-4436.

[4]張麗珠，陳穩(wěn)宏. 蜜蜂油茶花蜜中毒的預防與救治[J]. 中國蜂業(yè)中旬刊：學術，2013，64（3）：36-37.

[5]康雪冬，范正友. 蜜蜂油茶蜜中毒物質(zhì)的分析研究[J]. 蜜蜂雜志，1991（1）：8-10.

[6]黃堅. 淺談茶花爛子的防治[J]. 蜜蜂雜志，1994（8）：27.

[7]Cardoso-Lopes E M，Maier J A，Da-Silva M R，et al. Alkaloids from stems of Esenbeckia leiocarpa Engl.（Rutaceae）as potential treatment for alzheimer disease[J]. Molecules，2010，15（12）：9205-9213.

[8]羅萬春，李云壽，慕立義，等. 苦豆子生物堿對蘿卜蚜的毒力及其對幾種酯酶的影響[J]. 昆蟲學報，1997（4）：358-365.

[9]黃華，丁伯平. 鉤藤生物堿對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥理作用研究進展[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床，2013，28（5）：806-810.

[10]Fournier D，Mutero A. Modification of acetylcholinesterase as a mechanism of resistance to insecticides[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C：Pharmacology，Toxicology and Endocrinology，1994，108（1）：19-31.

[11]Li F H Z. Characterization of acetylcholinesterase from cotton aphid，Aphis gossypii Glover[J]. Archives of Insect Biochemistry and Physiology，2002，51（1）：37-45.

[12]Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry，1976，72（1）：248-254.

[13]張瑩，黃建，高希武. 兩種蜜蜂頭部乙酰膽堿酯酶對殺蟲藥劑敏感度比較[J]. 農(nóng)藥學學報，2005，7（3）：221-226.

[14]黃曉，滕云，陶科，等. 天然產(chǎn)物對家蠶乙酰膽堿酯酶抑制作用研究[J]. 四川動物，2008，27（3）：327-330.

[15]彭霞，陶科，滕云，等. 農(nóng)藥靶標乙酰膽堿酯酶的分離純化及性質(zhì)研究[J]. 四川大學學報：自然科學版，2008，45（1）：189-193.

[16]余海波. 蜜蜂自然中毒的病因與診治[J]. 貴州畜牧獸醫(yī)，2015，65（1）：24-27.

[17]金豐. 棗花期蜜蜂中毒的防治[J]. 中國養(yǎng)蜂，1994（2）：22.

[18]李曉立，范正友.蜜蜂棗花病病因的探討[J]. 中國養(yǎng)蜂，1991（2）：5-8.

[19]劉海青，劉富平，胡文婷. 壯實鹿角珊瑚生物堿的體外抗菌活性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（1）：250-251.

[20]賢景春，陳小濱. 雞屎藤總生物堿提取工藝優(yōu)化及抗氧化性研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（2）：209-211.

[21]賈書紅，李效振，張東升，等. 宮炎凈提取物中生物堿對子宮內(nèi)膜炎家兔的抗炎作用機理[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2015，43（1）：209-211.