櫻桃谷肉雛鴨感染鴨瘟、副黏病毒的PCR鑒定與防控

胡新崗++黃銀云++吳雙++郭廣富

摘要：根據(jù)發(fā)病情況、臨床癥狀、病理變化，初診江蘇省泰州市某肉鴨養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)的肉鴨群疑似感染鴨瘟，通過PCR方法鑒定該群病鴨混合感染鴨瘟病毒和副黏病毒，采取全群撲殺、徹底消毒、撲滅疫情等措施進(jìn)行防治，并針對我國肉鴨養(yǎng)殖中鴨瘟、鴨副黏病毒病流行的新態(tài)勢提出具體的防控舉措。

關(guān)鍵詞：櫻桃谷雛鴨；鴨瘟；副黏病毒；PCR；疫情；防控

中圖分類號： S858.32文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0344-02

收稿日期：2015-03-26

基金項目：江蘇省高?！扒嗨{(lán)工程”。

作者簡介：胡新崗（1974—），男，安徽宿州人，碩士，副教授，從事動物疫病防控研究及動物醫(yī)學(xué)教學(xué)工作。E-mail：gxh008@qq.com。鴨瘟（DP）別稱鴨病毒性腸炎，由鴨瘟病毒（DPV）引起，屬于急性、高致死性的病毒性傳染病，該病在我國廣大養(yǎng)鴨地區(qū)散在發(fā)生，不同齡期、性別、品種的鴨均可發(fā)生典型鴨瘟，臨床以蛋鴨、成年種鴨多見[1]。隨著我國肉鴨養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，鴨瘟在肉鴨群中的發(fā)病率明顯上升，未免疫鴨群的死亡率可達(dá)100%[2]。鴨副黏病毒病也被稱為鴨源新城疫，由禽副黏病毒Ⅰ型的鴨副黏病毒（DPMV）引起，屬于急性、高度接觸性傳染病[3]。在肉鴨養(yǎng)殖中，鴨瘟及鴨副黏病毒病的臨床病例報道不多，同一病例呈現(xiàn)鴨瘟病毒和副黏病毒混合感染的現(xiàn)象更無報道，筆者在工作中意外遇到了1例罕有病例，確診為櫻桃谷肉鴨混合感染鴨瘟和鴨副黏病毒病，鑒于目前我國肉鴨養(yǎng)殖業(yè)對這2種病的認(rèn)識和重視程度不足，疫情防控缺乏經(jīng)驗，特將案例報道如下。

1疫情調(diào)查

1.1發(fā)病情況

2014年4月，江蘇省泰州市某肉鴨養(yǎng)殖戶反映，其大棚飼養(yǎng)的2 000余羽13日齡櫻桃谷肉鴨于9日齡起感染發(fā)病，在臨床癥狀、病理變化等方面與鴨瘟相似，但考慮到10日齡左右的鴨苗不太可能會發(fā)生鴨瘟，因此未予重視，懷疑是細(xì)菌性傳染病，養(yǎng)殖戶自行購買氟苯尼考等多種抗菌藥物進(jìn)行防治，使用效果不佳，每天死亡十幾羽至幾十羽不等，由于此前幾批鴨也有類似情況，為弄清病因，找到有效的防治措施，養(yǎng)殖戶請求江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院幫助診斷，此時鴨群死亡率已近70%。鴨主反映該鴨群系本地某鴨場繁育的鴨苗，未予接種任何疫苗，基本上不進(jìn)行任何消毒?，F(xiàn)場走訪可見鴨場管理不善，鴨舍環(huán)境臟亂，人員流動無阻。

1.2臨床癥狀及病理變化

發(fā)病鴨表現(xiàn)出采食減少或食欲廢絕、飲欲增加、運(yùn)動失調(diào)、兩腿無力、行走時搖擺不穩(wěn)、頭縮頸軟、角弓反張等神經(jīng)癥狀。個體檢查可見病鴨流淚，眼有分泌物，腹瀉，排出淡綠色稀糞，泄殖腔黏膜充血。剖檢可見肝臟腫大，棕紅色，有灰白色、針頭大壞死灶，實質(zhì)較脆，膽囊腫大，充滿較濃的墨綠色膽汁，心包液增量，心包膜增厚，纖維素性心包炎，纖維素性氣囊炎，氣囊上有塊狀纖維素性滲出物附著，脾臟腫大，表面斑駁呈大理石狀，氣管環(huán)充血、出血，腦膜充血、水腫，腸黏膜充血、出血，胰腺發(fā)炎、充血，胸壁有淡黃色膠樣滲出物。根據(jù)病理變化，結(jié)合發(fā)病過程及多種抗菌藥物療效不佳等情況，初步診斷為鴨瘟，懷疑感染副黏病毒。

1.3分子生物學(xué)診斷

1.3.1病料來自上述疑似感染鴨瘟病毒及副黏病毒且臨床癥狀及病理變化明顯病例的肝、脾、肺、胰等。

1.3.2常用分子生物學(xué)試劑病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，Murine RNase Inhibitor和HiScriptReverse Transcriptase 購自南京諾唯贊生物科技有限公司，2×Lamp MasterMix（含染料）購自康為世紀(jì)生物科技有限公司，6 nt隨機(jī)引物購自Fermentas公司。

1.3.3雙抗PBS的配制根據(jù)OIE推薦的配方略作調(diào)整，用pH值7.2的PBS溶液配制運(yùn)輸液，溶液中抗生素劑量為：Penicilin （青霉素） 10 000 U/mL、Streptomycin （鏈霉素） 10 mg/mL，最后用10 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為7.2。

1.3.4引物設(shè)計與合成根據(jù)EMBL/GenBank公布的3種病毒的相關(guān)基因序列，運(yùn)用Primer Premier 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計4對引物，由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司，序列見表1。

1.3.5病毒的RNA、DNA提取將發(fā)生疑似病毒感染雛鴨器官病料剪碎研磨，加入預(yù)冷雙抗的PBS，反復(fù)凍融3次后經(jīng)2 000～3 000 r/min離心10 min，每份吸取200 μL上清用于病毒基因組提取。根據(jù)病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行RNA、DNA提取，測其含量為720 μg/μL，用6 nt隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（65 ℃ 加熱5 min，迅速置于冰上驟冷，并靜置2 min），根據(jù)HiScript Reverse Transcriptase說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得病毒的cDNA（置PCR儀上反應(yīng)，50 ℃ 45 min，85 ℃ 5 min）。

1.3.6基因片段的擴(kuò)增根據(jù)2×Lamp MasterMix（含染料）說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s；根據(jù)引物調(diào)整退火溫度，DPV、NDV、NDV-HN均為 55 ℃，DHV為50 ℃，72 ℃下延伸時間依次為 20 s、2 min、

1.2 min、30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測。

1.3.7基因片段的擴(kuò)增結(jié)果對上述DNA和cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測發(fā)現(xiàn)，DPV和NDV-HN出現(xiàn)的條帶與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。PCR擴(kuò)增結(jié)果確診該鴨群感染了鴨瘟病毒及副黏病毒。

2疫情處理方法

鑒于鴨瘟、鴨副黏病毒病均為嚴(yán)重危害肉鴨養(yǎng)殖的重要傳染病，建議立即全群撲殺剩余鴨，焚燒后深埋處理。從鴨棚移出各種生產(chǎn)用具，用0.02%二氯異氰尿酸鈉溶液、5%漂白粉溶液等浸泡洗刷。徹底清除鴨棚內(nèi)的糞便、墊草、墊料及雜物，能焚燒的予以焚燒，不能焚燒的拌合生石灰粉后深埋。采用5%過氧乙酸、0.5%癸甲溴銨溶液交叉反復(fù)多次消毒地面及環(huán)境。按1 m3空間25 mL福爾馬林、12.5 mL水、25 g高錳酸鉀的比例進(jìn)行鴨舍熏蒸消毒12～24 h，熏蒸消毒完成后，通風(fēng)換氣，空舍2～4周后再引入鴨苗。疫苗免疫是控制鴨瘟流行的主要措施，肉鴨雖然飼養(yǎng)周期短，但免疫不能掉以輕心。據(jù)報道，鴨接種弱毒疫苗數(shù)小時后，即可不同程度地抵抗鴨瘟野毒的攻擊[4]。因此，為預(yù)防雛鴨感染鴨瘟，購買鴨苗時必須問清種鴨是否免疫鴨瘟活疫苗，以確定鴨苗體內(nèi)的母源抗體情況，如種鴨未免疫鴨瘟活疫苗，則雛鴨必須盡早免疫?？稍陔r鴨1日齡時注射鴨瘟活疫苗，按瓶簽標(biāo)明羽份，用生理鹽水稀釋，每羽腿肌或頸側(cè)皮下注射0.25 mL，免疫期1個月。也可嘗試用鴨瘟活疫苗按1 ∶ 5（1個免疫量溶于5 mL水中）進(jìn)行飲水免疫，飲水免疫前應(yīng)停止供水一段時間，增加鴨的飲欲，以便通過飲水快速攝入足夠的疫苗。建議免疫前進(jìn)行環(huán)境徹底消毒，免疫后1周內(nèi)不要進(jìn)行環(huán)境消毒[5]。嚴(yán)格執(zhí)行獸醫(yī)衛(wèi)生制度，及時清除糞便及受污染的墊草墊料，及時通風(fēng)換氣，保證空氣清新，定期消毒鴨舍、運(yùn)動場、水池，勤清洗消毒水槽、料槽。疫情發(fā)生后，應(yīng)每天全面消毒，直至撲滅疫情。發(fā)現(xiàn)病鴨及時隔離診治，盡量不自行用藥，應(yīng)向當(dāng)?shù)孬F醫(yī)部門求助，確保正確診斷、合理用藥。由于鴨瘟病毒能在耐過鴨體內(nèi)形成潛伏感染并能復(fù)發(fā)，在感染后4年內(nèi)仍能向外界排毒而成為傳染源[6]。鴨場發(fā)生鴨瘟疫情，撲殺病鴨是清除傳染源的重要手段。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，肉鴨的發(fā)病死亡主要發(fā)生在2周齡以內(nèi)，在此期間應(yīng)注意通過飲水或拌料添加禽用多種維生素，以增強(qiáng)雛鴨的免疫力。如鴨群糞便不正常，可用0.02%高錳酸鉀液飲水或添加抗菌藥物，確保肉鴨健康快速生長、減少病死率、提高養(yǎng)鴨效益。

3結(jié)論與討論

通常水禽不能自然感染副黏病毒發(fā)病，即使強(qiáng)毒感染也不表現(xiàn)癥狀，但可從鴨、鵝等體內(nèi)分離出病毒。胡北俠等在規(guī)?；B(yǎng)殖場種鴨副黏病毒帶毒監(jiān)測研究中發(fā)現(xiàn)，健康肉用種鴨群在特定的時間副黏病毒帶毒率高達(dá)100%[7]。吳峻華在福建省福州市部分鴨場檢出鴨血清樣品副黏病毒抗體陽性率達(dá)28.7%，說明鴨副黏病毒感染情況呈現(xiàn)嚴(yán)峻態(tài)勢[8]。由于種蛋可以攜帶病毒，雛鴨早期發(fā)病可能主要與孵化及出雛過程中病毒污染有關(guān)。研究表明，人工感染鴨副黏病毒的肉鴨，雖然臨床癥狀不甚明顯，剖檢病變也較輕微，但會導(dǎo)致組織器官持續(xù)性嚴(yán)重病理損傷，是導(dǎo)致感染鴨群體質(zhì)量、大小產(chǎn)生顯著發(fā)育差異的根本原因，副黏病毒隱性感染的疫情是鴨副黏病毒病的主要流行形式[9]。由此可以解釋本次疫情的2個現(xiàn)象：一是該批肉鴨按常規(guī)飼養(yǎng)卻出現(xiàn)體質(zhì)量、大小具有明顯差異現(xiàn)象，二是鴨群并未表現(xiàn)出副黏病毒感染的明顯癥狀和典型病變。從而也可以推斷本次疫情由鴨瘟病毒感染主導(dǎo)，副黏病毒感染起到了促進(jìn)發(fā)病、死亡的作用。

一般認(rèn)為，鴨瘟多見于2月齡以上的成年鴨，特別是種鴨、成年蛋用鴨，由于肉鴨鴨瘟很少發(fā)生，沒能引起肉鴨飼養(yǎng)戶甚至基層獸醫(yī)技術(shù)人員的重視，從而造成該病暴發(fā)，給養(yǎng)鴨戶造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失[10]。因此，隨著肉鴨養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和養(yǎng)殖方式的多樣化，生產(chǎn)上應(yīng)加強(qiáng)肉鴨鴨瘟免疫預(yù)防。此外，肉鴨副黏病毒病危害已經(jīng)比較嚴(yán)重，鴨副黏病毒病與雞新城疫疫苗毒株建的同源性較低，現(xiàn)有新城疫疫苗無法對鴨提供有效保護(hù)，因此有關(guān)方面應(yīng)盡快制備針對鴨的副黏病毒疫苗，在無有效疫苗之前，肉鴨養(yǎng)殖只能采取“養(yǎng)、防、檢、治”的綜合防疫措施應(yīng)對該病。

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