小鼠口服五氯柳胺混懸劑的急性毒性研究

張吉麗++司鴻飛++李冰++程富勝++周緒正+張繼瑜

摘要：通過進(jìn)行小鼠急性毒性試驗(yàn)，對五氯柳胺混懸劑的安全性進(jìn)行初步評價。預(yù)試驗(yàn)采用遞增法確定給藥的劑量范圍、正式試驗(yàn)分組以及組距等。正式試驗(yàn)按照簡化寇氏法進(jìn)行，觀察給藥后小鼠的體征變化，統(tǒng)計(jì)死亡率，記錄死亡時間，計(jì)算五氯柳胺混懸劑的半致死劑量（LD50）以及95%的可信限。結(jié)果表明，小鼠口服五氯柳胺混懸劑的LD50值為1.679 g/kg，95%的置信區(qū)間為1.439～1.947 g/kg，按照化學(xué)物毒性分級可得：五氯柳胺混懸劑為低毒物質(zhì)。

關(guān)鍵詞：五氯柳胺混懸劑；小鼠；急性毒性試驗(yàn)；半致死劑量（LD50）

中圖分類號： S855.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0340-02

收稿日期：2016-01-14

基金項(xiàng)目：國家科技支撐計(jì)劃（編號：2015BAD1101）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)（編號：CAR-38）。

作者簡介：張吉麗（1992—），女，黑龍江大慶人，碩士，研究方向?yàn)閯游锟辜纳x藥。E-mail：zhangjlzjl@sina.com。

通信作者：張繼瑜，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楂F醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)。E-mail：infzjy@sina.com。五氯柳胺是廣譜高效的水楊酰苯胺類化學(xué)合成抗寄生蟲藥物，主要用于治療牛、羊的肝片吸蟲感染，在抗絳蟲、線蟲等方面也具有較好的治療效果[1]。自20世紀(jì)中后期報(bào)道其抗蟲活性后，國外對其進(jìn)行了大量研究，并相繼報(bào)道了五氯柳胺在臨床試驗(yàn)中顯著的治療效果[2-3]。國內(nèi)并未對其進(jìn)行系統(tǒng)性研究，相關(guān)報(bào)道較少。因其水溶性差，有一定的毒性，限制了其臨床應(yīng)用。五氯柳胺混懸劑，克服了五氯柳胺的難溶性，且性質(zhì)穩(wěn)定、質(zhì)量可控、治療效果確切，本研究采用改良寇氏法進(jìn)行小鼠的急性毒性試驗(yàn)，從而評價五氯柳胺混懸劑的安全性。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動物

SPF級昆明系小鼠110只，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。體質(zhì)量在18～22 g之間，雌雄各半，雌性未產(chǎn)未孕。試驗(yàn)前飼養(yǎng)3～5 d，自由飲水覓食，以適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境。

1.2供試藥品

五氯柳胺口服混懸劑，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所農(nóng)業(yè)部新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備。試驗(yàn)前，精確稱定處方中主藥及輔料，配制成0.209 g/mL的混懸劑，待用。按照處方中各輔料的用料配比，配制輔料對照組的濃度為 0.100 g/mL。

1.3預(yù)試驗(yàn)

本試驗(yàn)采用遞加法分別對五氯柳胺混懸劑組以及輔料對照組進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。

五氯柳胺混懸劑預(yù)試驗(yàn)組：將20只SPF級昆明系小鼠，隨機(jī)分為5組，每組4只，雌雄各半，分別給小鼠稱體質(zhì)量，計(jì)算給藥劑量。最高劑量組給藥量為3.375 g/kg體質(zhì)量，最低劑量組給藥量為1.000 g/kg體質(zhì)量。灌胃給藥，觀察7 d，記錄小鼠的死亡數(shù)，確定最小致死劑量（LD100）和最大耐受劑量（LD0）。從而確定正式試驗(yàn)組數(shù)（N）以及各組間劑量比（r）。

輔料對照組預(yù)試驗(yàn)同樣采用20只SPF級昆明系小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組4只，分別給小鼠稱體質(zhì)量，計(jì)算給藥劑量。最高給藥劑量為5.000 g/kg體質(zhì)量，最低給藥劑量為1.000 g/kg體質(zhì)量。記錄死亡數(shù)，確定最小致死劑量（LD100）和最大耐受劑量（LD0）。

1.4正式試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)得到的最小致死劑量（LD100）和最大耐受劑量（LD0），采用簡化寇氏法計(jì)算正式試驗(yàn)組數(shù)（N）以及各組間劑量比（r）。由于輔料試驗(yàn)的LD100值大于5.000 g/kg體質(zhì)量，將小鼠樣本量增至10只，雌雄各半，仍未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，按照化學(xué)藥物毒性分級，可以得到結(jié)論：混懸劑輔料實(shí)際無毒。

根據(jù)五氯柳胺混懸劑預(yù)試驗(yàn)結(jié)果將正式試驗(yàn)分為6組，包括空白對照組和5個不同劑量試驗(yàn)組。將60只小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量為18～22 g，隨機(jī)分為6組，試驗(yàn)組的給藥劑量為：3.375、2.488、1.836、1.355、1.000 g/kg體質(zhì)量。空白對照組給予等量的飲用水。灌胃給藥，觀察7 d，觀察給藥后小鼠的外觀體征、采食狀況、行為活動等相關(guān)癥狀，記錄每組小鼠死亡數(shù)、死亡時間，并對死亡小鼠進(jìn)行剖檢，觀察病理變化。用改良寇氏法計(jì)算LD50以及95%的置信區(qū)間。

2結(jié)果與分析

2.1預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

由預(yù)試驗(yàn)可得：輔料預(yù)試驗(yàn)組的LD0大于5.000 g/kg，增加試驗(yàn)動物數(shù)量至10只，仍未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，按照化學(xué)藥物的毒性分級可以視為混懸劑輔料實(shí)際無毒。

五氯柳胺混懸劑預(yù)試驗(yàn)組的LD100為3.375 g/kg，LD0為1.000 g/kg。從而確定正式試驗(yàn)的組數(shù)（N）為5。各組之間的劑量比值為r=1.355。由此將預(yù)試驗(yàn)分為6組，其中包括不同劑量試驗(yàn)組5組以及空白對照組。

2.2正式試驗(yàn)結(jié)果

觀察給藥后動物表現(xiàn)出的癥狀為：給藥后出現(xiàn)精神沉郁、伏臥不動、眼睛微閉、被毛凌亂、食欲減退，給藥3.5 h后出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，死亡時間集中在5～12 h，死亡前出現(xiàn)全身震顫、側(cè)翻現(xiàn)象，大約持續(xù)5 min死亡。剖檢未見明顯的病理變化。給藥36 h后，再無死亡現(xiàn)象，但高劑量組存活小鼠依然表現(xiàn)為精神沉郁，3 d后逐漸恢復(fù)飲食飲水。將存活小鼠體質(zhì)量變化與空白組對比可以發(fā)現(xiàn)，給藥組小鼠增長緩慢。

五氯柳胺混懸劑試驗(yàn)組的死亡數(shù)見表1，根據(jù)死亡情況計(jì)

算五氯柳胺口服混懸劑的LD50以及95%的可信度區(qū)間如下：

LD50=lg-1[Xm-i（∑p-0.5）]

Sx50=i（∑pq/n），

LD50的95%可信限=lg-1（lgLD50±1.96×Sx50）。

式中：Xm為最大劑量的對數(shù)；i為組距，相鄰兩組劑量對數(shù)值之差；p為各劑量組死亡率；q為各劑量組存活率；n為各組動物數(shù)；Sx50為lgLD50的標(biāo)準(zhǔn)誤差。

經(jīng)計(jì)算得五氯柳胺口服混懸劑的LD50為1.674 g/kg，95%的可信度區(qū)間為1.439～1.947 g/kg。

3討論與結(jié)論

為了保證試驗(yàn)動物本身清潔無污染，有效地消除試驗(yàn)動物本身造成的試驗(yàn)誤差，本研究選用SPF級昆明系小鼠。在整個試驗(yàn)過程中，嚴(yán)格按照《獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編》中關(guān)于化學(xué)物急性毒性相關(guān)的試驗(yàn)指導(dǎo)原則[4]進(jìn)行。在給藥過程中，嚴(yán)格按照灌胃給藥的操作，以防由于灌胃方法不當(dāng)導(dǎo)致小鼠死亡，影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

由于配制五氯柳胺混懸劑的母液濃度為0.209 g/mL，遵照《獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編》中關(guān)于小鼠受試物給藥體積的相關(guān)規(guī)定為：小鼠1次給藥量為每10 g體質(zhì)量給藥量在0.1～0.2 mL之間。所以在給藥過程中，為了避免給藥體積過大，需要進(jìn)行多次給藥，2次給藥時間間隔為1～2 h，1次給藥體積不得超過0.4 mL，防止小鼠因灌胃受試物的體積過大而撐死。

寄生蟲作為一類重要的病原，嚴(yán)重危害人類和畜禽的健康，造成了畜牧養(yǎng)殖業(yè)的重大損失。動物抗寄生蟲藥物是預(yù)防和治療寄生蟲類疾病、保障畜牧業(yè)健康發(fā)展和公共衛(wèi)生安全的最有效手段。五氯柳胺是一種廣譜抗寄生蟲類化學(xué)合成藥物，是臨床抗寄生蟲的首選。為了滿足獸醫(yī)臨床對五氯柳胺的需求，本研究研制了五氯柳胺的口服混懸劑，并對其急性毒性進(jìn)行了評價。由試驗(yàn)結(jié)果可知：五氯柳胺口服混懸劑的LD50為1.674 g/kg，95%的可信度區(qū)間為1.439～1.947 g/kg，這為五氯柳胺混懸劑后續(xù)研究及臨床推廣奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]崔瑩. 驅(qū)蟲藥五氯柳胺的制備[J]. 現(xiàn)代商貿(mào)工業(yè)，2010，22（20）：300-300.

[2]Sanabria R，Moreno L，Alvarez L，et al. Efficacy of oxyclozanide against adult Paramphistomum leydeni in naturally infected sheep[J]. Veterinary Parasitology，2014，206（3/4）：277-281.

[3]Arias M S，Sanchis J，F(xiàn)rancisco I，et al. The efficacy of four anthelmintics againist Calicophoron daubneyi in naturally infected dairy catlle[J]. Veterinary Parasitology，2013，197：126-129.

[4]農(nóng)業(yè)部獸藥評審中心. 獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2012