基于乙肝病毒基因突變分析的乙肝個(gè)體化診斷與應(yīng)用研究

石之驎　戴煒　曾輝　謝舒枝

[摘要] 目的 研究乙肝病毒基因突變分析在乙肝個(gè)體化診斷方面的臨床應(yīng)用。 方法 選取本院自2011年8月～2014年8月間收集的乙型肝炎病毒感染未使用藥物者的外周血標(biāo)本和肝癌患者術(shù)后病理標(biāo)本工共120例，前者為甲組，后者為乙組，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行已感染HBV BCP-PreC/C區(qū)基因突變與臨床診斷的相關(guān)性研究，對(duì)測(cè)得的DNA基因序列通過(guò)HBV drug guide軟件進(jìn)行對(duì)比分析。 結(jié)果 研究結(jié)果現(xiàn)實(shí)，1762/1764位的基因突變與肝臟損傷呈正向相關(guān)；1896/1899位的基因突變與HBeAg呈負(fù)向相關(guān)。 結(jié)論 本次研究為乙肝病毒基因突變分析對(duì)于乙肝個(gè)體化診斷提供一定的臨床依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 乙肝病毒；基因突變；分析；乙肝個(gè)體化診斷；應(yīng)用

[中圖分類號(hào)] R512.62 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 2095-0616（2016）09-124-04

[Abstract] Objective To explore the clinical application of hepatitis B virus （HBV） gene mutation analysis in the individualized diagnosis of patients with hepatitis B. Methods A total 120 cases of peripheral blood samples from hepatitis B patients without any drugs and pathologic specimens from liver cancer patients after operations which were collected in our hospital form August 2011 to August 2014 were divided into group A and group B respectively.The relationship between HBV gene mutation in the BCP-PreC/C segment and clinical diagnosis was studied， and the DNA gene sequences were compared and analyzed by the HBV drug guide software. Results Results indicated that， there was a positive correlation between liver injury and gene mutation in the 1762/1764 segment，and there was a negative correlation between HBeAg and gene mutation in the 1896/1899 segment. Conclusion This paper provides a clinical reference for the individualized diagnosis of hepatitis B patients based on hepatitis B virus gene mutation analysis.

[Key words] Hepatitis B virus （HBV）；Gene mutation；Analysis；Individualized diagnosis of hepatitis B；Application

乙型肝炎病毒是一種嗜肝、雙鏈DNA病毒[1]。據(jù)調(diào)查顯示，乙型肝炎病毒感染導(dǎo)致的乙型肝炎已經(jīng)成為世界性的傳染性疾病，居我國(guó)嚴(yán)重的傳染病之首。世界上有20億人感染過(guò)HBV，中國(guó)的乙肝患者及攜帶者就已高達(dá)9500多萬(wàn)，其中3000多萬(wàn)人為慢性乙型肝炎的患者，據(jù)調(diào)查顯示，我國(guó)每年大約有50多萬(wàn)人死于本病及其并發(fā)癥[2]，容易發(fā)生堿基配對(duì)錯(cuò)誤，而導(dǎo)致HBV基因高突變的特性，進(jìn)而產(chǎn)生耐藥或感染進(jìn)程改變等。本文通過(guò)研究乙肝病毒基因在我國(guó)的變異情況以及實(shí)際的臨床相關(guān)性，為復(fù)雜的病毒感染檢測(cè)提出指導(dǎo)思路，盡可能的提高病毒基因診斷的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性進(jìn)行綜述。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取院自2011年8月～2014年8月間本院收集的乙型肝炎病毒感染未使用藥物者的外周血標(biāo)本和肝癌患者術(shù)后病理標(biāo)本共120例，其中標(biāo)本來(lái)源于男79例，女41例，年齡在23～76歲，平均（48.7±8.2）歲。并對(duì)肝癌患者（或肝硬化患者）進(jìn)行手術(shù)后取組織采取病理標(biāo)本。

1.2 方法

對(duì)上述標(biāo)本進(jìn)行已感染HBV BCP-PreC/C區(qū)基因突變與臨床診斷的相關(guān)性研究分析，對(duì)測(cè)得的DNA基因序列通過(guò)HBV drug guide軟件進(jìn)行對(duì)比分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本次研究使用SPSS14.0軟件包對(duì)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者1762/1764位基因、1896/1899位的基因突變的發(fā)生情況比較

通過(guò)HBV drug guide軟件分析可見，HBV BCP-PreC/C區(qū)的基因在肝癌患者（或肝硬化患者）以及未用藥組標(biāo)本中存在1762/1764位的多發(fā)性基因突變，并且發(fā)現(xiàn)基因突變的平均比例>50%，主要以AST、AST值40U/L為界值，同時(shí)對(duì)比其他位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，1762/1764位的突變較未發(fā)生突變的樣本差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），由此看來(lái)，1762/1764位的基因突變與肝臟損傷呈正向相關(guān)；分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1896/1899位基因突變?cè)跒橛盟幗MHBeAg<1作為界限，對(duì)比分析1762/1764等其他的位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)1896/1899位的基因突變與為發(fā)生突變的樣本比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），由此看來(lái)1896/1899位的基因突變與HBeAg呈負(fù)向相關(guān)。見表1。

2.2 兩組乙型肝炎病毒感染標(biāo)志物分析

研究結(jié)果顯示，兩組患者乙型肝炎病毒感染標(biāo)志物HBsAg+HBeAg+、HBsAg+抗-HBe、HBsAg+抗-HBc以及HBsAg+HBeAg+抗-HBc水平比較差異具有顯著性，而肝癌患者HBsAg+抗-HBe+ 抗-HBc標(biāo)志物明顯多于乙型肝炎病毒感染者。詳細(xì)的分析結(jié)果，見表2。

3 討論

乙肝病毒是目前發(fā)現(xiàn)的危害人類健康較為嚴(yán)重的全球性傳染病，據(jù)相關(guān)資料統(tǒng)計(jì)，我國(guó)的乙肝患者以及乙肝攜帶者高達(dá)9300萬(wàn)。其中大約有1/3為慢性乙型肝炎患者。我國(guó)每年大約有50萬(wàn)人死于HBV感染導(dǎo)致的干功能衰竭、肝癌、肝硬化等嚴(yán)重并發(fā)癥，該病導(dǎo)致的死亡人數(shù)約占全部因感染導(dǎo)致死亡人數(shù)的一半，與其他國(guó)家相比，我國(guó)的乙型肝炎的感染率居全球首位，其在我國(guó)的感染率高達(dá)57.6%。乙肝病毒流行定義為攜帶慢性乙肝病毒患者的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）≥2%，并且攜帶6個(gè)月以上。目前，最常見的乙肝病毒分型方法主要是以HBV全基因序列核苷酸同源性和異源性進(jìn)行分型。其分型標(biāo)準(zhǔn)是以全系列的異原性≥8%，或者根據(jù)HBV全序列中的S基因區(qū)異源性≥4%為乙型肝炎病毒基因S區(qū)分型標(biāo)準(zhǔn)，將HBV分為8種基因型及不同的亞型。不同的基因組間發(fā)生充足，主要發(fā)生在病毒基因組的核心區(qū)，并且不同基因組間重組主要發(fā)生在B基因型和C基因型之間。HBV基因型的分布具有一定的區(qū)域性。

乙肝病毒DNA的開放讀框碼具有高度重疊性，其主要氛圍四個(gè)區(qū)域，即S基因區(qū)域、C基因區(qū)域、P基因區(qū)域以及X基因區(qū)域，其中的P基因區(qū)域編碼的乙肝病毒DNA的聚合酶具有較高的復(fù)制特性，并且由于缺乏3-5外切酶的活性，DNA復(fù)制的過(guò)程中的逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏3-5外切酶的活性，因此容易出現(xiàn)堿基配對(duì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的情況，最終可能導(dǎo)致乙肝病毒DNA基因發(fā)生基因突變，進(jìn)一步導(dǎo)致耐藥性或?qū)е缕浒l(fā)生感染。研究表明非編碼區(qū)主要控制病毒的復(fù)制、翻譯以及基因表達(dá)的過(guò)程。其對(duì)于下游表達(dá)的E、C抗原等存在重要的調(diào)控作用，該區(qū)域?qū)儆诟咄蛔儏^(qū)域，極其容易導(dǎo)致乙型肝炎病毒感染的發(fā)生、發(fā)展。此外還發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域編碼的X基因和X蛋白存在部分重疊，因此該區(qū)域可能發(fā)生X蛋白的改變。不同的乙肝病毒基因型對(duì)于乙肝的發(fā)展程度也存在一定的差異，目前臨床雖然對(duì)本病的發(fā)病機(jī)制還不明確，但可以確定的是對(duì)乙型肝炎病毒治療之前進(jìn)行分型鑒定，有利于對(duì)疾病的治療方案進(jìn)行預(yù)估，并且還能實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的個(gè)體化治療[3]。

乙型肝炎病毒的復(fù)制周期可分為兩個(gè)階段，第一個(gè)階段為HBV的結(jié)合和入侵、核心顆粒入核、基因組脫殼以及形成cccDNA，第二個(gè)階段則為病毒基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯、初級(jí)基因組RNA衣殼化、反轉(zhuǎn)錄、病毒顆粒的包裝和分泌。

Peg-α-干擾素-2a（聚乙二醇化α-干擾素）和Peg-α-干擾素-2b可用于HBV的治療[4]。其它能夠抑制病毒的復(fù)制的核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，包括阿德福韋（ADV）、恩替卡韋（ETV）、拉米夫定（LVD）、替比夫定（LDT）以及替諾福韋（TDF），以及氟化的拉米夫定，恩曲他濱（FTC）均可以用于治療中。其治療機(jī)制為：核苷類似物進(jìn)入人體后，通過(guò)磷酸激酶的作用激化磷酸化，成為三磷酸核苷類似物，達(dá)到逆轉(zhuǎn)錄酶的活性和抑制病毒的DNA多聚酶的目的，并與核苷競(jìng)爭(zhēng)性的摻入乙肝病毒的DNA鏈，來(lái)終止HBV DNA的合成和延長(zhǎng)，最終抑制病毒的復(fù)制來(lái)發(fā)揮出抗病毒的作用核苷類似物藥物能有效抑制病毒的復(fù)制但不能消除已有的病毒和cccDNA[5]。耐藥所產(chǎn)生的基本理論在藥物進(jìn)入后，長(zhǎng)期的壓力下引起突變，對(duì)沒(méi)有發(fā)生突變的病毒株進(jìn)行了抑制，而突變的病毒株則逐漸的失控，最終引起病毒學(xué)突破的過(guò)程[6]。

拉米夫定具有安全、有效、耐受性好的特點(diǎn)，在臨床的實(shí)驗(yàn)中用于治療HBV感染，可能夠有效的抑制HBV病毒載量，降低肝臟炎癥，改善部分實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，不過(guò)在隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致具有抗性的乙型肝炎病毒[7]。其抗性有M204V/I/S改單一位置的突變導(dǎo)致，該位點(diǎn)存在于高度保守的聚合酶催化中心YMDD結(jié)構(gòu)域，M204I的變異可直接發(fā)現(xiàn)，但同時(shí)伴有L180M突變，該位點(diǎn)的伴隨性突變，能彌補(bǔ)增強(qiáng)乙肝病毒的復(fù)制能力，同時(shí)抵抗拉米夫定的抑制作用[8]。阿德福韋酯是乙肝病毒復(fù)制的強(qiáng)效抑制劑，只有微弱的HIV復(fù)制抑制的效果，因此被FDA批準(zhǔn)為只作為治療HBV感染的藥物，其抗性的產(chǎn)生主要在HBV聚合酶的密碼子rt181和rt236位置，當(dāng)阿德福韋在與拉米夫定預(yù)先耐藥患者與拉米夫定預(yù)先耐藥的病毒株組合給藥時(shí)，可同時(shí)誘發(fā)兩種藥物抗性，根據(jù)有關(guān)的細(xì)胞培養(yǎng)研究表明，N236T突變和A181V突變不造成對(duì)恩替卡韋的交叉耐藥性。替諾福韋出能抑制HBV聚合酶外，也可用于治療HIV感染[9]。研究表明，替諾福韋與拉米夫定聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行治療，比單獨(dú)使用替諾福韋抑制HBV DNA復(fù)制更加的有效。更多的感染A基因型HBV的患者與非A基因型HBV感染的患者相比，具有更佳的藥物應(yīng)答效果[10]。目前，替諾福韋主要被用于HBV與HIV的共感染治療中。拉米夫定和替諾福韋同時(shí)用藥的方案治療HBV和HIV共感染的患者，不被推薦為一線治療HBV單一感染的患者使用[11]。

乙肝病毒載量和自然發(fā)生的突變株與乙肝病毒導(dǎo)致的慢性肝臟疾病的長(zhǎng)期感染密切相關(guān)，在早期的研究資料中，發(fā)現(xiàn)C基因型的核心啟動(dòng)子區(qū)A1762T/G1764A與B基因型相比更加容易發(fā)生變異[12]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)C基因型乙肝病毒患者的病毒載量明顯高于B基因型患者，在這種高病毒載量的情況下，C基因型患者與其它基因型的患者相比，發(fā)生肝硬化的幾率明顯要高。本次研究也證實(shí)了這一說(shuō)法[13]。各基因型間的慢性乙型肝炎發(fā)病機(jī)制具有一些差異，B和C基因型對(duì)比A和D的基因型當(dāng)中，乙肝病毒DNA和乙肝核心抗原在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，以及乙肝病毒DNA和乙肝E抗原在細(xì)胞外的分泌表達(dá)，B和C基因型均高于A和D基因型[14]。細(xì)胞內(nèi)積累的乙肝病毒DNA和抗原的導(dǎo)致較大肝細(xì)胞損傷。

經(jīng)過(guò)大量的臨床研究，多項(xiàng)研究已經(jīng)明確S基因區(qū)的保守性較高，并且S區(qū)基因也是區(qū)分基因型的標(biāo)志性基因區(qū)；研究表示，P基因區(qū)為耐藥基因區(qū)，同時(shí)還與S區(qū)存在一定的交叉區(qū)域，可根據(jù)S區(qū)的保守性進(jìn)行分析。有研究表示，BCP-P熱C/C 基因區(qū)是突變的高發(fā)區(qū)域，這一高發(fā)的突變性導(dǎo)致其不具備基因分型的功能，這一區(qū)域的突變程度與肝性疾病的發(fā)展存在密切的關(guān)聯(lián)。根據(jù)以上基因區(qū)對(duì)乙型肝炎病毒進(jìn)行綜合判斷，乙型肝炎病毒的八種基因型均具有相對(duì)的保守性，并且還具有一定的分型特征。通過(guò)應(yīng)用生物信息學(xué)分析的方法，目前已經(jīng)初步建立乙型肝炎病毒基因檢測(cè)的基因測(cè)序基礎(chǔ)，也進(jìn)一步為乙型相關(guān)性疾病的診斷提供可靠的參考依據(jù)。也最終為乙型肝炎病毒的分型以及耐藥的研究利空檢測(cè)路徑[15]。通過(guò)本次研究也可以看出，通過(guò)對(duì)乙型肝炎病毒基因突變的診斷，可以對(duì)肝臟病變的程度進(jìn)行區(qū)分，研究結(jié)果顯示，1762/1764位的基因突變與肝臟損傷呈正向相關(guān)；1896/1899位的基因突變與HBeAg呈負(fù)向相關(guān)。本次選取的乙型肝炎病毒感染者的1896/1899位的基因突變率明顯低于肝癌患者1896/1899位的基因突變率（51.67%vs90.0%）；而1896/1899位的基因突變比較則發(fā)現(xiàn)，肝癌患者的突變率明顯低于乙型肝炎病毒感染者（70.0%vs88.33%）。

綜上所述，乙肝病毒基因突變分析對(duì)于乙肝個(gè)體化診斷提供一定的臨床依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 黎健，陳健，李燕婷，等.上海市88例乙型肝炎患者乙肝病毒基因型與基因突變的關(guān)系[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2013，30（8）：611-613.

[2] Motavaf M，Safari S，Saffari Jourshari M，et al.Hepatitis B virus-induced.hepatocellular carcinoma：the role of the virus protein[J].Acta Virol，2013，57（4）：389-396.

[3] Glebe DL，Bremer CM.The molecular virology of hepatitis B virus. Semin Liver Dis. 2013； 33（2）：103-112.

[4] McMahon BJ.Chronic hepatitis B virus infection[J].Med Clin North Am，2014，98（1）：39-54.

[5] 喬瑩，黃芬，蔡鑫澤，等.HBV感染誘發(fā)AID高表達(dá)與肝細(xì)胞癌變相關(guān)性研究[J].中華腫瘤防治雜志，2015，22（1）：13-18.

[6] 王淏，鄭優(yōu)榮，熊華平，等.廣州地區(qū)HBV DNA+/HBsAg-獻(xiàn)血者分子生物學(xué)特征[J].臨床醫(yī)學(xué)工程，2015，22（5）：546-549.

[7] Ott JJ，Stevens GA，Groeger J，et al.Global epidemiology of hepatitis B virus infection：new estimates of age-specific HBsAg seroprevalence and endemicity[J].Vaccine，2012，30（12）：2212-2219.

[8] 蒿廣德，孫少嬌，黃菲，等.HLA-DR與慢性乙肝持續(xù)病毒應(yīng)答的相關(guān)性研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2013，17（8）：1440-1443.

[9] 李慶虹.基于臨床信息的新發(fā)傳染病診療系統(tǒng)與基于遺傳信息的HBV個(gè)體化診療信息系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)[D].中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2010：45-47.

[10] 王慧.HBV基因變異在HBV相關(guān)原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的臨床意義研究[D].第二軍醫(yī)大學(xué)，2015：8-11.

[11] 陸奕宇，宋雅楠，張貴彪，等.慢性乙型肝炎及其肝炎后肝硬化中醫(yī)證候分類的系統(tǒng)生物學(xué)研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2013（6）：1281-1287.

[12] 曾躍紅，田海清，王新華，等.乙型病毒性肝炎臨床轉(zhuǎn)歸與機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀況的相關(guān)性研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，12（5）：8-11，21.

[13] 朱雪娟.阿德福韋醋治療慢性乙型肝炎優(yōu)化策略的臨床研究[D].山東大學(xué)，2011：13-14.

[14] 陸志檬.慢性乙型肝炎治療指南-在臨床實(shí)踐中應(yīng)用[C]. 2009中國(guó)腎臟內(nèi)科醫(yī)師年會(huì)論文集，2009：136-139.

[15] 李嘉.乙肝病毒C基因區(qū)變異與機(jī)體細(xì)胞免疫功能關(guān)系的研究[D].天津：天津醫(yī)科大學(xué)，2002：31-36.

（收稿日期：2016-01-05）