桃PG基因家族的鑒定與分析

霍如雪 劉振寧 楊青 +王光全

摘要：多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）屬于一個大的水解酶家族，它通過降解果膠在植株生長發(fā)育過程中的細(xì)胞分離事件中發(fā)揮重要作用。為深入研究桃PG基因家族的功能，利用生物信息學(xué)方法對桃基因組中PG基因家族成員進行鑒定，對其基因和蛋白特征、保守結(jié)構(gòu)域、基因進化樹分類和基因表達(dá)模式等方面進行研究。結(jié)果表明，在桃基因組中共鑒定出了84個PG基因，可以聚類成7個分支A～G；PG基因在8條染色體上呈現(xiàn)不均勻分布，并存在明顯的串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象，共發(fā)現(xiàn)16個串聯(lián)重復(fù)基因簇；利用 UniGene 數(shù)據(jù)庫進行的組織表達(dá)分析。說明有 10 個基因在數(shù)據(jù)庫中有表達(dá)數(shù)據(jù)，其中有6個基因具有組織表達(dá)特異性。

關(guān)鍵詞：桃；多聚半乳糖醛酸酶；基因家族；生物信息學(xué)

中圖分類號： S662.103文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）06-0033-08

多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）是一種細(xì)胞壁結(jié)合蛋白，具有水解酶性質(zhì)，廣泛存在于細(xì)菌、真菌和植物中。PG大約在52年以前被鑒定，并被證明參與到植株生長發(fā)育各個時期中果膠的降解。在降解果膠的諸多酶類中，PG屬于其中最大的水解酶家族。目前，已經(jīng)在擬南芥、水稻、楊樹、白菜、黃瓜、甜瓜、卷柏、小立碗蘚等物種中對其基因家族進行了鑒定，并在進化上進行了分析[1-8]。PG從性質(zhì)上主要分成3種，即內(nèi)切PG、外切PG、鼠李糖PG。根據(jù)不同的分類標(biāo)準(zhǔn)，不同研究者將PG聚類為不同的亞類。擬南芥A～F等6類中的PG基因在表達(dá)模式上存在差異，有些亞類的成員趨向于在營養(yǎng)組織中表達(dá)，而有些則趨向于在生殖器官中表達(dá)[8]。不同亞類的PG可能具有獨特的生物學(xué)功能。Park 等認(rèn)為，A類和B類含有陸生植物的PG基因，E類含有從藻類到開花植物的PG基因，而C、D、F類則只含有開花植物的PG基因[8]。對水稻、楊樹、苔蘚、小立碗蘚和擬南芥5個物種中的225個PG的研究表明，A類和B類為內(nèi)切PG，C類和D類為外切PG，E類為鼠李糖PG，而F類的成員不能被歸類于不同性質(zhì)PG中的任何一種[6]。

根據(jù)Hadfield等對植物PG功能的分類，PG可以分為三大類，與果實成熟相關(guān)的PG、與器官脫落相關(guān)的PG、與花粉發(fā)育相關(guān)的PG[9]。研究表明，cpPG1和木瓜果肉軟化有關(guān)，cpPG1在木瓜中的過表達(dá)能夠促進果肉的軟化[10]。Roongsattham等在油棕果實成熟和脫落的過程中鑒定出14個PG基因，這些基因均在果實成熟時基部的脫落區(qū)表達(dá)[11]。RDPG1是油菜中的一個PG基因，主要在果莢和花藥的開裂區(qū)表達(dá)，并且在花器官的脫落區(qū)、花粉管生長過程中的花柱組織、莖和花梗的節(jié)點中表達(dá)，表明RDPG1可能與器官脫落有關(guān)[12]。在擬南芥花粉發(fā)育過程中，花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂形成四分體小孢子，研究發(fā)現(xiàn)，PG基因[WTBX][STBX]QRT3[WTBZ][STBZ]參與了四分體小孢子的分離。在花粉發(fā)育的早期，[WTBX][STBX]QRT3[WTBZ][STBZ]由絨氈層分泌降解四分體小孢子周圍的花粉母細(xì)胞壁，從而使得四個小孢子能夠正常分離[13]。

桃（Prunus persica）是薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）植物，是世界上廣泛栽培的落葉果樹之一[14]。與薔薇科木本植物如李和酸櫻桃等多倍體果樹相比，桃是二倍體（n=8 ），具有相對較小的基因組（230 Mbp），而且具有相對短的童期（2～3年），這些獨特的優(yōu)點使得桃成為李屬及其他薔薇科植物的模式基因組物種[15]。桃基因組測序的完成和序列釋放[16]使得在全基因組水平上對桃的重要功能基因的發(fā)掘比較和功能研究成為可能。本研究利用生物信息學(xué)方法對桃PG基因家族成員進行了鑒定和基因組注釋，分析了其基因結(jié)構(gòu)和保守域，以期為進一步對桃PG家族基因的功能研究提供基礎(chǔ)信息并最終在分子水平上對桃品種的改良提供明確的候選基因。

1材料與方法

1.1桃PG基因家族的鑒定

首先，利用擬南芥PG蛋白的氨基酸序列作為種子序列在桃基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.rosaceae.org/species/prunus_persica/genome_ version 2.0）[16]中BlastP比對搜索。其次，為保證候選基因沒有被遺漏，又利用搜索到的PG蛋白的氨基酸序列對桃基因組數(shù)據(jù)庫進行2次BLASTP比對搜索。最后，利用Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.janelia.org/）、SMART數(shù)據(jù)庫（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析候選蛋白的結(jié)構(gòu)域，根據(jù)候選蛋白的氨基酸序列是否至少具有一個PG的保守結(jié)構(gòu)域（SPNTDGI、GDDC、CGPGHGISIGSLG和RIK）進行候選PG基因的篩選和鑒定。除上述方法獲得的PG基因外，還包括[WTBX][STBX]At4g20050（QRT3[WTBZ][STBZ]）[13]，該基因雖然不含有PG基因的任何一個結(jié)構(gòu)域，但是它已經(jīng)被證明為PG基因。因此，[WTBX][STBX]At4g20050[WTBZ][STBZ]基因在桃基因組中的同源基因單獨用BLASTP搜索獲得。

1.2桃PG基因的基因組信息和染色體定位

桃PG基因的序列和基因組信息通過桃基因組數(shù)據(jù)庫獲得，并根據(jù)每一個PG基因在染色體上的精確位置和染色體的長度使用Photoshop軟件將PG基因人工定位到對應(yīng)的染色體上。

1.3桃PG蛋白的生理生化分析

PG蛋白的分子量和等電點通過（Compute pI/Mwsoftware （http：//www.expasy.ch/tools/pi_tool.html）[17]來預(yù)測，信號肽序列通過SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）[18]分析。

[BT2+*5]1.4桃PG基因的結(jié)構(gòu)分析、保守域分析和進化樹分析

GSDS網(wǎng)站（http：//gsds1.cbi.pku.edu.cn/）[19]用來分析PG基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。在線的MEME軟件（http：//meme.sdsc.edu/meme/meme.html）[20]用來鑒定PG蛋白的氨基酸序列中的基序。Clustal X軟件用來對PG蛋白的氨基酸序列進行比對。對進化樹的構(gòu)建，首先利用MEGA 50軟件（http：//www.megasoftware.net/）自帶的Clustal W應(yīng)用對蛋白的氨基酸序列進行比對分析，空格罰分設(shè)置為10，空格擴展罰分設(shè)置為0.2。然后將比對好的序列利用MEGA 50軟件構(gòu)建進化樹，進化樹使用鄰接法構(gòu)建，采用泊松校正，成對刪除和1 000次重復(fù)等建樹參數(shù)[21]。

1.5桃PG基因的表達(dá)

在NCBI數(shù)據(jù)庫中對每個桃PG基因進行BLASTN比對搜索，取高相似度的序列（>95%）搜索其Unigene的EST表達(dá)數(shù)據(jù)，并將基因的表達(dá)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成Log2的格式，最終的基因表達(dá)數(shù)據(jù)使用Multiple Array Viewer軟件[22]以熱點圖的形勢呈現(xiàn)。

2結(jié)果與分析

2.1桃PG基因家族的鑒定和注釋

根據(jù)擬南芥PG蛋白的氨基酸序列，通過對桃基因組數(shù)據(jù)庫的BLAST搜索，在桃基因組中共鑒定出了84個PG基因，并參考擬南芥PG基因的命名方法[4]對桃PG基因進行命名（表1）。這84個PG基因的開放閱讀框長度在426～2 127 bp，編碼141～708個氨基酸，相應(yīng)的蛋白分子量在1576～7463 ku，等電點在4.48～9.52之間。對PG蛋白信號肽的預(yù)測表明，其中64個蛋白具有一段N末端信號肽，信號肽長度為15～32個氨基酸。對桃PG基因染色體定位（圖1），研究表明，PG基因在桃的8條染色體上呈現(xiàn)不均勻分布，其中第1、第2、第3、第4、第7染色體上具有比較多的PG基因，而第5、第6、第8染色體上的PG基因比較少。此外，PG基因在染色體上分布存在明顯的串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象，共發(fā)現(xiàn)了16個串聯(lián)重復(fù)基因簇，共包含48個基因，占PG基因總數(shù)的57%。

2.2桃PG基因的系統(tǒng)發(fā)育分析和分類

為進一步分析桃PG基因在植物中的進化模式，筆者選取了桃、擬南芥、楊樹、水稻、卷柏和小立碗蘚等6個代表性物種[2，5]中PG蛋白的氨基酸序列使用MEGA5.0軟件，構(gòu)建了NJ進化樹并對各物種中PG基因進行了聚類分析（圖2）。結(jié)果表明，這6個物種的298個PG基因被聚類成7個分支（A～G）。為明確每個物種在每個分支中PG基因的數(shù)目，對每個分支中不同物種PG基因的數(shù)目進行統(tǒng)計（表2）。結(jié)果表明，桃PG基因家族成員存在于所有的A～G等7個分支中，分別含有8、5、15、31、13、9、3個，擬南芥中分別含有8、6、8、20、14、11、1個。楊樹PG基因分布于A～F等6個分支中，分別含有12、7、21、16、14、5個。單子葉植物水稻PG基因也分布于A～F等6個分支中，分別含有7、11、4、9、12、1個。卷柏和小立碗蘚中PG基因數(shù)目比較少，卷柏中含有16個，分別為A類2個、B類6個、E類7個、F類1個；小立碗蘚中有11個，分別為A類2個、B類1個、E類8個。統(tǒng)計數(shù)據(jù)也表明，A、B、E類包含上述6個陸生植物的PG基因；C類、D類只包括桃、擬南芥、楊樹和水稻的PG基因；F類包含桃、擬南芥、楊樹、水稻和卷柏的PG基因；而G類只包括桃和擬南芥的PG基因。

2.3桃PG基因的基因結(jié)構(gòu)分析

為研究桃PG基因的基因結(jié)構(gòu)，根據(jù)桃基因組信息獲取每一個PG基因的DNA和CDS序列信息并構(gòu)建其基因結(jié)構(gòu)（圖3）。結(jié)果表明，大部分PG基因都有3～8個不等的內(nèi)含子，其中分支D中有11個基因不具有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。通過對基因結(jié)構(gòu)圖和基因進化樹的比較分析，發(fā)現(xiàn)每一個分支中PG基因的結(jié)構(gòu)相對是比較保守的，尤其是每一個更小分支中的PG基因。

2.4桃PG蛋白的氨基酸序列比對和保守域分析

為研究桃PG蛋白的保守域，利用CLUSTAL X對桃PG蛋白的氨基酸序列進行多重比對（圖4）。結(jié)果表明，PG蛋白一般具有4個典型的保守結(jié)構(gòu)區(qū)域（Ⅰ，SPNTDGI；Ⅱ，GDDC；Ⅲ，CGPGHGIS；Ⅳ，RIK）。除了分支G中的3個特殊蛋白不包含這4個結(jié)構(gòu)域之外，分支A～F中的蛋白都至少具有其中一個結(jié)構(gòu)域。尤其是分支A、B、C、F中的蛋白一般都具有所有4個結(jié)構(gòu)域，而分支E中的13個蛋白一般只具有Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ這3個結(jié)構(gòu)域，都缺少結(jié)構(gòu)域Ⅲ。 另外，利用MEME軟件對桃PG保守基序的分析（圖5），發(fā)現(xiàn)了6個比較保守的基序（motif 1～6），其中motif 1、motif 5、motif 2和motif 3分別對應(yīng)Ⅰ～Ⅳ 4個保守結(jié)構(gòu)域。另外，還分別在74、76個PG蛋白中發(fā)現(xiàn)了motif 4和motif 6。

2.5桃PG基因的表達(dá)分析

利用 UniGene 數(shù)據(jù)庫進行的組織表達(dá)。結(jié)果表明，有 10 個基因在數(shù)據(jù)庫中有表達(dá)數(shù)據(jù)（圖6）。其中有6個基因具有組織表達(dá)特異性，[WTBX][STBX]PpaPG10、PpaPG65、PpaPG66、PpaPG67、PpaPG68[WTBZ][STBZ]在果實中特異表達(dá)，[WTBX][STBX]PpaPG60[WTBZ][STBZ]在莖中特異表達(dá)。對另外4個非組織特異表達(dá)的基因，[WTBX][STBX]PpaPG01[WTBZ][STBZ]在莖中表達(dá)量比較高，[WTBX][STBX]PpaPG23[WTBZ][STBZ]主要在果實中表達(dá)，而[WTBX][STBX]PpaPG80[WTBZ][STBZ]在葉中具有比較高的表達(dá)。

3結(jié)論與討論

PG家族是一個大的基因家族。在不同物種中，PG基因的進化和分類已經(jīng)被進行了大量的研究。Park等通過聚類分析，將藻類到陸生植物的PG基因家族成員進行了詳細(xì)的劃分[8]。8個物種的225個PG成員被聚類到A～F等6個分支，分支A、分支B包含所有陸生植物的PG基因，分支E包含藻類到開花植物的PG成員，而分支C、D、F則只含有開花植物的PG成員[6]。本研究對桃、擬南芥、楊樹、水稻、卷柏和小立碗蘚等6個代表性物種中的298個PG基因構(gòu)建了進化樹和聚類分析，將PG基因聚類到A～G等7個分支。桃和擬南芥PG基因家族成員存在于所有的A～G等7個分支中，楊樹和水稻PG基因分布于A～F等6個分支中，卷柏PG基因分布于分支A、B、E、F中，小立碗蘚PG基因僅分布于分支A、B、E等3個分支中。與Park等的研究結(jié)果[6]不同的是，分支F中存在1個卷柏PG基因，因此F亞類應(yīng)該包含除苔蘚以外的所有陸生植物的PG基因。

桃、擬南芥、水稻、楊樹基因組大小分別為230、125、466、480 Mbp，而這4個物種基因組中PG基因的數(shù)目分別為84、68、44、75個，說明桃基因組中PG基因出現(xiàn)了基因的擴增。進一步對這4個物種每個分支中PG基因數(shù)目進行統(tǒng)計和比較發(fā)現(xiàn)，桃的分支C、分支D分別包含15、31個PG基因，明顯比其他物種在這2個分支中PG基因多，說明桃PG基因的擴增主要出現(xiàn)在這2個分支中?；驍U增是基因組進化最主要的[CM（25]驅(qū)動力之一，是產(chǎn)生具有新功能的基因和進化出新物種的[CM）][FL）]

主要原因之一?；蚩梢酝ㄟ^多種方式進行擴增，包括全基因組復(fù)制、串連復(fù)制、片段復(fù)制和逆轉(zhuǎn)座復(fù)制等。對桃PG基因染色體定位進行研究發(fā)現(xiàn)，PG基因在染色體上，分布存在明顯的串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象，共有16個串聯(lián)重復(fù)基因簇，包含48個基因，占PG基因總數(shù)的57%，表明串聯(lián)重復(fù)是桃PG基因擴增的主要方式。分支C中有4個串聯(lián)重復(fù)基因簇，包含13個基因；分支D有7個串聯(lián)重復(fù)基因簇，包含22個基因。表明桃PG基因的串聯(lián)重復(fù)主要發(fā)生在分支C和分支D中?；驍U增后會產(chǎn)生大量的基因重復(fù)，基因重復(fù)在生物系統(tǒng)進化中發(fā)揮著極其重要的作用，是基因組和遺傳系統(tǒng)分化的重要推動力[23]。一般認(rèn)為，復(fù)制基因在進化過程中有4種命運，即假基因化、[JP2]保持原有基因功能、亞功能化、新功能化。桃基因組中大量重復(fù)PG基因的進化命運仍需要進一步研究。[JP]

桃的使用主要是鮮食和加工2種方式，而這2種方式對果實的硬度和成熟度要求不同[24-26]。PG基因已被證明在果

實成熟和軟化過程中具有重要作用。在桃UniGene 數(shù)據(jù)庫中找到了10個有表達(dá)數(shù)據(jù)的PG基因，其中有9個基因均在果實中表達(dá)，而且有5個基因是在果實中特異表達(dá)，表明PG基因在桃果實發(fā)育過程中扮演者重要角色。對桃PG基因與果實發(fā)育關(guān)系研究能夠為培育符合市場需求的桃優(yōu)良品種提供重要的理論依據(jù)，并具有現(xiàn)實的指導(dǎo)意義。

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