葫蘆科作物游離小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展

胡雪丹 張曼 徐錦華 劉廣 姚協(xié)豐++李蘋芳++陳學(xué)好 羊杏

摘要：探討葫蘆科作物在游離小孢子培養(yǎng)中（與花粉培養(yǎng)）的優(yōu)勢，闡述游離小孢子培養(yǎng)過程中供體植株基因型、供體植株生理狀況、預(yù)處理、小孢子發(fā)育時期、培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件等諸多因素的影響，并針對葫蘆科蔬菜游離小孢子培養(yǎng)中存在的問題提出后續(xù)研究方向。

關(guān)鍵詞：葫蘆科作物；游離小孢子培養(yǎng)；優(yōu)勢；影響因素

中圖分類號： Q943.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）06-0025-05

葫蘆科作物在世界園藝作物生產(chǎn)中占有非常重要的地位，隨著人們消費(fèi)需求的增加，葫蘆科作物的栽培面積逐年增大。葫蘆科作物包括118屬825種，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，中國約有29屬142種，常見的主要有西瓜、甜瓜、苦瓜、黃瓜、西葫蘆等，栽培面積大且具有較高的經(jīng)濟(jì)效益，在人們?nèi)粘Ｉ钪芯哂兄匾饔谩Ｓ捎诤J科作物的常規(guī)遺傳育種方法育種周期長、難度大、遺傳性狀不穩(wěn)定，常規(guī)育種的不足在實(shí)際工作中日漸明顯，各國學(xué)者開始尋找育種的新途徑和新方法。單倍體育種技術(shù)為縮短育種年限、提高育種效率提供了可能，因此在葫蘆科作物中開展以離體培養(yǎng)為基礎(chǔ)的生物技術(shù)育種研究顯得尤為重要。獲得單倍體葫蘆科植物最常見的方法是通過輻射花粉授粉，誘導(dǎo)單倍體胚胎進(jìn)行原位孤雌發(fā)育。近年來，離體雄核發(fā)育途徑生產(chǎn)單倍體技術(shù)逐漸受到重視，離體雄核發(fā)育途徑有花藥離體培養(yǎng)和游離小孢子培養(yǎng)，其效果可以媲美輻射花粉授粉技術(shù)[1]。早在1971年，西貞夫等在黃瓜花藥培養(yǎng)的研究中獲得了不定芽。之后的幾十年里，學(xué)者們致力于花粉離體培養(yǎng)，已經(jīng)在葫蘆科作物中的南瓜屬、葫蘆屬、西瓜屬、甜瓜屬、苦瓜屬等獲得了單倍體[2]。與花藥離體培養(yǎng)相比，葫蘆科作物游離小孢子培養(yǎng)起步較晚、研究相對較少，僅在黃瓜、西瓜、甜瓜上獲得了胚狀體或再生植株。

1葫蘆科作物游離小孢子培養(yǎng)的優(yōu)勢

在葫蘆科蔬菜作物中，自發(fā)產(chǎn)生單倍體的頻率極低。為獲得單倍體植株，離體雄核發(fā)育途徑（花藥或小孢子培養(yǎng)）、雌核發(fā)育途徑（未授粉子房或胚珠離體培養(yǎng)、外源化學(xué)藥劑、正?；ǚ刍蜉椛溥^的花粉授粉誘導(dǎo)的孤雌生殖）等手段被用來誘導(dǎo)單倍體。近年來，游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的不斷成熟為離體培養(yǎng)單倍體帶來了曙光。

游離小孢子培養(yǎng)研究于20世紀(jì)70年代初開始，于1982年在蕓薹屬作物上首次獲得成功[2]。在高等植物的生活史中，小孢子是雄配子體發(fā)育過程中短暫而重要的階段，是減數(shù)分裂后四分體釋放出的單倍性單細(xì)胞。小孢子培養(yǎng)是指將小孢子從花藥中游離出來，在人工培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)并獲得再生植株的過程。與花藥培養(yǎng)相比，游離小孢子培養(yǎng)開展的并不晚，但進(jìn)展較緩慢。早在1982年，Licher首次報(bào)道采用甘藍(lán)型油菜游離小孢子培養(yǎng)形成植株[3]。20世紀(jì)80年代后期，游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)在十字花科的油菜上得以迅速發(fā)展并日臻完善。近十幾年，游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)在甘藍(lán)型油菜上日漸成熟，已陸續(xù)在黑芥、結(jié)球甘藍(lán)、芥藍(lán)、嫩莖花椰菜、抱子甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、皺葉甘藍(lán)、小白菜、大頭菜、葉芥等十幾種蔬菜上獲得成功，但對葫蘆科游離小孢子培養(yǎng)至今尚未見明確成功的報(bào)道[4]。

從概念來看，花藥離體培養(yǎng)是把小孢子發(fā)育到一定階段的花藥接種至培養(yǎng)基上，以改變花藥內(nèi)小孢子粒的發(fā)育程序，使其分裂形成細(xì)胞團(tuán)，進(jìn)而分化成胚狀體，形成愈傷組織，由愈傷組織再分化成植株。小孢子離體培養(yǎng)是指把小孢子從花藥中分離出來，以單個小孢子粒作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)。由于小孢子已是單倍體細(xì)胞，誘發(fā)它經(jīng)愈傷組織或胚狀體發(fā)育而成的植株都是單倍體，且不受花藥的藥隔、藥壁、花絲等體細(xì)胞的干擾。從培養(yǎng)層次來看，花藥離體培養(yǎng)屬器官培養(yǎng)，小孢子離體培養(yǎng)屬細(xì)胞培養(yǎng)，但花藥離體培養(yǎng)和小孢子離體培養(yǎng)的目的均是誘導(dǎo)小孢子細(xì)胞發(fā)育成單倍體細(xì)胞，最后發(fā)育成單倍體植株。一般來說，花藥培養(yǎng)比游離小孢子培養(yǎng)的技術(shù)要求相對簡單。從培養(yǎng)過程來看，花藥離體培養(yǎng)相對容易，技術(shù)比較成熟，但最后須對培養(yǎng)成的植株進(jìn)行染色體倍數(shù)檢測；小孢子離體培養(yǎng)盡管不受花藥壁、藥隔等二倍體細(xì)胞的干擾，但這種特殊單倍體細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)難度較大，目前僅在少數(shù)植物上獲得成功。

產(chǎn)生單倍體的方法主要有花藥培養(yǎng)和小孢子培養(yǎng)，但近年來花藥培養(yǎng)已逐漸被小孢子培養(yǎng)所取代。與花藥培養(yǎng)相比，小孢子培養(yǎng)方法具有以下幾方面優(yōu)勢：（1）排除了母體組織體細(xì)胞的干擾，培養(yǎng)獲得的植株均是由單倍體小孢子發(fā)育來的，避免了嵌合體的發(fā)生，染色體加倍后可獲得遺傳上純合穩(wěn)定的后代。（2）有利于提高小孢子胚胎發(fā)生的機(jī)率。（3）小孢子均是單細(xì)胞，數(shù)量多、發(fā)育快、易獲得、誘導(dǎo)率高、易突變，在自然條件下容易加倍，操作簡便，得到的胚狀體還可應(yīng)用于育種實(shí)踐和遺傳分析。（4）適合作為單一細(xì)胞群體系統(tǒng)的生理生化研究。（5）易于誘發(fā)突變和進(jìn)行離體篩選。小孢子培養(yǎng)技術(shù)在育種及基礎(chǔ)研究應(yīng)用上具有以下優(yōu)勢：（1）小孢子培養(yǎng)獲得的DH（doubled haploid，雙單倍體）植株是同源體，因而是真實(shí)育種；[JP2]（2）從雜種中培養(yǎng)得到的小孢子單倍體在遺傳上代表隨機(jī)配子；（3）小孢子培養(yǎng)獲得純合植株一般需要7～8個月，而傳統(tǒng)育種方法需要3～4年，大大節(jié)省了時間和成本；（4）與組織培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合能獲得大量成本相對較低的目標(biāo)材料；（5）小孢子能直接發(fā)育成胚胎，因而減少了遺傳變異；（6）單倍體小孢子能進(jìn)行顯性和隱性性狀的突變誘導(dǎo)。 [JP]

總體來講，瓜類蔬菜作物通過離體雄核發(fā)育途徑生產(chǎn)單倍體難度較大，只有西瓜的花藥培養(yǎng)較為成功。薛光榮等利用瓊酥西瓜品種，通過培養(yǎng)單核靠邊期的花藥在國際上首次獲得了西瓜單倍體植株，并從其加倍后代中直接選育出優(yōu)良的新品種[5]，1988年薛光榮等在周至紅這一品種上獲得了成功[6]。在南瓜的花藥培養(yǎng)上也有學(xué)者進(jìn)行過嘗試。Shail等培養(yǎng)花藥但并未獲得單倍體植株[7]；Kurtar等對4個南瓜品種花粉母細(xì)胞處于單核期的花藥進(jìn)行培養(yǎng)，并摸索了蔗糖濃度和2，4-D濃度對培養(yǎng)效果的影響，但最后得到的3個植株均為二倍體[8]；直到1998年，Metwally等成功得到了10個單倍體植株，并對培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)單核中期、單核晚期的南瓜小孢子接種在MS+15%蔗糖+5 mg/L 2，4-D上培養(yǎng)的效果最好，每塊愈傷組織植株再生頻率可達(dá)192%[9]。Dryanovska等曾嘗試甜瓜的花藥培養(yǎng)，結(jié)果以失敗告終[10]。早在1982年，Lazarte等分別取黃瓜四分體、小孢子、成熟期3個時期的花粉進(jìn)行花藥培養(yǎng)，并得到再生植株，但直到目前并無進(jìn)一步研究，所得植株是否起源于小孢子仍未知[11]。直到2003年，Ashok等成功獲得了黃瓜單倍體植株[12]。詹艷等以10個不同基因型的黃瓜為試材進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，通過對成胚條件的系統(tǒng)研究，從7447和Poinsett97中獲得了子葉形胚和再生植株，得到的子葉形胚易分化成苗，而其他類型的胚狀體未能獲得再生植株，但誘導(dǎo)頻率仍然很低，難以用于育種實(shí)踐[13]。唐懿等針對基因型、小孢子發(fā)育時期等影響苦瓜花藥培養(yǎng)的主要因素進(jìn)行綜述，討論了苦瓜花藥培養(yǎng)中存在的問題，并為今后苦瓜花藥培養(yǎng)提供了研究方向[14]。Han等利用子葉節(jié)建立了葫蘆再生體系[15]，但關(guān)于葫蘆花藥離體培養(yǎng)和游離小孢子培養(yǎng)并無報(bào)道。

2葫蘆科作物小孢子培養(yǎng)的影響因素

影響單倍體離體誘導(dǎo)的因素很多，涉及供體植株的基因型、培養(yǎng)基、外植體預(yù)處理方式、外植體發(fā)育時期、培養(yǎng)條件等方面，且各因素之間存在相互作用。根據(jù)關(guān)于游離小孢子培養(yǎng)和再生植株的報(bào)道，得出小孢子培養(yǎng)的主要影響因素。

2.1誘導(dǎo)游離小孢子胚胎發(fā)生的影響因子

小孢子培養(yǎng)受到供體植株基因型、供體植株生理狀況、預(yù)處理、小孢子發(fā)育時期、培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件等諸多因素的影響，因此小孢子出胚率受到很大限制，成為實(shí)際應(yīng)用中的一大難題。

2.1.1供體植株的基因型供體植株的基因型是影響小孢子培養(yǎng)的關(guān)鍵因素，不同基因型的植株對培養(yǎng)具有不同反應(yīng)，主要體現(xiàn)在基因型的反應(yīng)范圍、產(chǎn)胚率的差異2個方面。基因型的反應(yīng)范圍即有多少基因型有反應(yīng)，以及有反應(yīng)的基因型產(chǎn)胚率的差異。詹艷等對10份黃瓜供試材料進(jìn)行研究，只有4份試材獲得了胚狀體，其中成胚率最高的是7447，為312個/皿；成胚率最低的是康德，為1.5個/皿；其余6份材料中有些游離小孢子出現(xiàn)膨大，有些已啟動分裂，但均未能繼續(xù)分裂形成胚狀體[13]。李娟對西瓜進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，野生種和栽培種的成胚率有顯著差別，前者高于后者[4]。緱艷霞、董艷榮分別在西瓜、甜瓜花藥培養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1代植株的愈傷組織誘導(dǎo)率明顯大于親本，表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢，表明小孢子的基因型至少是決定培養(yǎng)能力的因素[16-17]。

2.1.2供體植株的生長環(huán)境供體植株的生理狀態(tài)對小孢子胚胎誘導(dǎo)率具有重要影響，試驗(yàn)中一般選擇生長發(fā)育健壯、無病蟲害的花蕾為試材進(jìn)行培養(yǎng)，以達(dá)到最佳效果。另外，光照、溫度、水肥等供體植株生長的環(huán)境條件也是影響小孢子培養(yǎng)的關(guān)鍵因素。供體植株生長環(huán)境的溫度影響最為顯著，很多研究表明，適當(dāng)?shù)蜏乜娠@著提高供體植株小孢子的出胚率。曹鳴慶等以種植在部分控溫溫室和露地的17個基因型的大白菜為試材，研究供體母株的生長環(huán)境條件對小孢子胚胎發(fā)生的影響；結(jié)果表明，供體植株生長環(huán)境的溫度為10～25 ℃，小孢子的胚產(chǎn)量較高[18]。張鳳蘭等利用人工氣候室研究光照、溫度對小孢子胚胎發(fā)生的影響，結(jié)果表明，日照時數(shù)為 14 h 最有利于小孢子胚胎發(fā)生且產(chǎn)胚量最高，最適溫度為 20 ℃[19]。袁亦楠等在番茄游離小孢子培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，5月下旬、10月薯葉番茄花蕾的類胚發(fā)生率分別為0.01%、0.25%，可能是土壤的低夜溫影響了供體內(nèi)小孢子的發(fā)育方向，使其偏離配子體方向發(fā)育，從而脫分化形成胚狀體[20]。

2.1.3小孢子發(fā)育時期小孢子發(fā)育時期、花蕾大小、取樣時期均會影響小孢子培養(yǎng)效果。小孢子發(fā)育時期通常分單核期、雙核期、三核期，并非任何時期的小孢子都適于培養(yǎng)。單核期又分為單核早期、單核中期、單核靠邊期，最適于游離小孢子培養(yǎng)的時期通常為單核靠邊期。很多研究表明，小孢子發(fā)育時期與花蕾長度、花藥長度、花瓣長等花蕾形態(tài)指標(biāo)密切相關(guān)，可作為小孢子群體是否適于培養(yǎng)的衡量指標(biāo)。Thurling等在進(jìn)行蕓薹屬花藥培養(yǎng)時指出，雖然花蕾大小是判斷小孢子發(fā)育階段的可靠指標(biāo)，但也隨著供體基因型、生長條件、生長時間、花序等的變化而變化，此結(jié)論同樣適用于瓜類[4]。

在大多數(shù)作物花藥培養(yǎng)中，花粉的發(fā)育時期均選用單核靠邊期，但目前對其作用機(jī)理仍不清楚。在黃瓜花藥培養(yǎng)中，不同發(fā)育期的花藥幾乎均可形成愈傷組織。詹艷等對黃瓜進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，只有單核靠邊期的小孢子誘導(dǎo)成胚[13]。謝淼等則研究發(fā)現(xiàn)，單核中后期的花藥適于作為外植體，而甜瓜花藥培養(yǎng)的最佳時期是單核靠邊期至雙核期[21]。薛光榮等利用瓊酥西瓜品種，通過培養(yǎng)單核靠邊期的花藥在國際上首次獲得西瓜單倍體植株，并從其加倍后代中獲得了新品種，但并未進(jìn)行推廣[22]。不能僅憑花蕾的大小來判斷花粉發(fā)育時期。崔群香等以蜜本南瓜、安生黑鉆南瓜開花初期的雄花蕾為試驗(yàn)材料，利用熒光染色技術(shù)對南瓜花粉發(fā)育時期進(jìn)行鑒定[23]?；ɡ俅笮∫蛑仓晟L狀況及采花時期而有所不同，同樣大小的花蕾其發(fā)育時期也不盡相同；因此，掌握葫蘆科作物花蕾的采集時期，須先對葫蘆科作物不同發(fā)育階段的花藥進(jìn)行顯微觀察，了解葫蘆科作物花粉發(fā)育的特點(diǎn)。

2.1.4逆境脅迫預(yù)處理預(yù)處理可改變小孢子的發(fā)育途徑，使其從配子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑，從而誘導(dǎo)小孢子胚的形成。預(yù)處理包括離心、低溫、高溫、輻射、秋水仙素、饑餓等人為處理，目前廣泛應(yīng)用的預(yù)處理方法一般為低溫預(yù)處理、高溫?zé)峒ぬ幚?、甘露醇預(yù)處理、秋水仙素預(yù)處理。溫度脅迫是影響小孢子胚狀體發(fā)生的最主要因素。一般來說，從植株上采下花蕾后，直接進(jìn)行小孢子培養(yǎng)很難誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生。溫度脅迫可改變小孢子發(fā)育途徑，從而阻止小孢子向成熟花粉粒方向發(fā)展，而是沿著胚胎的發(fā)展途徑最終形成胚。羊杏平等研究低溫、高溫、甘露醇、蔗糖、激素、三十烷醇6種處理對西瓜小孢子存活率的影響發(fā)現(xiàn)，4 ℃低溫預(yù)處理2 d、35 ℃高溫?zé)峒? d、13%蔗糖處理均可顯著提高西瓜小孢子的存活率（P<0.05）；甘露醇、三十烷醇對不同西瓜品種的小孢子存活率影響不同，在培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L 6-BA+04 mg/L 2，4-D的西瓜小孢子存活率最高[24]。

低溫預(yù)處理和高溫?zé)峒な怯坞x小孢子培養(yǎng)中最常用的2種方法。Ashok等研究了Calyps、Cucumis sativus Lr等2個黃瓜品種在花藥離體培養(yǎng)時對溫度預(yù)處理的反應(yīng)，結(jié)果表明，花蕾在 4 ℃ 預(yù)處理2 d、32.8 ℃熱激1 d時反應(yīng)最好[12]。郭尚等通過花粉培養(yǎng)、顯微鏡觀察的方法研究不同溫度、營養(yǎng)條件、保藏條件對花粉生活力的影響，結(jié)果表明，西瓜花粉萌發(fā)的適宜溫度為18～38 ℃，上限、下限溫度分別為48、8 ℃，在較高生長溫度條件下形成的花粉生活力較強(qiáng)；低溫處理時間越長，對花粉發(fā)芽越不利；8 ℃低溫、干燥條件有利于花粉短期保存；營養(yǎng)充足的大型花蕾花粉萌發(fā)較好[25]。朱迎春等以4 ℃低溫預(yù)處理48、72 h時，西瓜花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)率較高，均顯著高于對照，表明4 ℃低溫預(yù)處理可作為花蕾的一種保存方式[26]。詹艷等對10份黃瓜供試材料進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，低溫預(yù)處理有利于胚狀體的誘導(dǎo)，以4 ℃預(yù)處理2～4 d為宜，以處理2 d的胚狀體產(chǎn)量最高[13]。緱艷霞等以具有較多優(yōu)良性狀的F1代西瓜品種春光、拿比特、喜都的花藥為試材，研究影響西瓜花藥愈傷組織誘導(dǎo)率的因素，表明4 ℃低溫預(yù)處理 72 h 可提高西瓜花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率；30 ℃高溫預(yù)培養(yǎng)72 h后置于25 ℃下低溫培養(yǎng)也可提高西瓜花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率[27]。Labbani等以0.3 μmol/L甘露醇預(yù)處理、[JP2]4 ℃ 冷處理小麥小孢子，經(jīng)過3、5、6、7、8、10、12 d等不同時期的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，結(jié)合0.3 g/mol甘露醇和7 d冷處理對胚胎數(shù)量有強(qiáng)烈影響[28]。楊安平等在甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)基中添加秋水仙堿，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可使部分培養(yǎng)無反應(yīng)材料產(chǎn)胚，并提高培養(yǎng)有反應(yīng)材料的產(chǎn)胚量，同時對胚胎的良好發(fā)育具有促進(jìn)作用[29]。[JP]

2.1.5小孢子分離方法獲得游離小孢子是進(jìn)行培養(yǎng)的前提和關(guān)鍵，一般通過自然散落法、機(jī)械擠壓法2種方法獲得游離小孢子。（1）自然散落法。將花蕾消毒、清洗后，于無菌條件下取出花藥并接種到培養(yǎng)基上，任其花粉自然散落。（2）機(jī)械擠壓法。把經(jīng)滅菌、清洗處理后的花蕾放到無菌研缽中，加入少量分離培養(yǎng)基研磨，得到花蕾懸浮液，采用尼龍篩網(wǎng)過濾并濾去殘?jiān)?，濾液多次離心，調(diào)整小孢子密度。

2.1.6培養(yǎng)基及其成分大多數(shù)瓜類花藥培養(yǎng)均選用MS作為基本培養(yǎng)基，也可選用NLN、B5培養(yǎng)基。很多試驗(yàn)采用B5作為洗滌培養(yǎng)基，之后以NLN-13（NLN基本培養(yǎng)基+13%蔗糖）或1/2 NLN培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，也能取得良好效果。謝淼等選用MS和B5作為基本培養(yǎng)基對黃瓜花藥進(jìn)行培養(yǎng)[21]。在關(guān)于絲瓜花藥培養(yǎng)的研究中選用的是N6；在蔬菜作物中常用的胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基一般為NLN或1/2 NLN培養(yǎng)基。在黃瓜游離小孢子培養(yǎng)中，NLN和B5作為基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)獲得的胚狀體產(chǎn)量差異性雖然不明顯，但NLN更有利于球形胚進(jìn)一步發(fā)育成子葉形胚。

碳源是植物組織培養(yǎng)不可缺少的物質(zhì)，它不僅能為外植體提供能量，也能維持一定的滲透壓。常用的碳源有果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、山梨醇等，蔗糖能支持絕大多數(shù)植物離體培養(yǎng)物的旺盛生長，一直作為植物組織培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)碳源被廣泛應(yīng)用。然而近年來許多研究表明，蔗糖并不一定是最佳碳源，不同植物對不同糖類的反應(yīng)不完全相同，并且多數(shù)植物組織培養(yǎng)物以葡萄糖、果糖為碳源時也能良好生長。碳源一般在6%～12%變化范圍內(nèi)即可滿足瓜類植物的營養(yǎng)需求。黃均元等以茄子、黃瓜、番茄、西瓜、甜瓜5種蔬菜作物為研究對象，以不同濃度的蔗糖、硼酸、赤霉素進(jìn)行處理，觀察花粉的萌發(fā)情況，結(jié)果表明，硼酸、赤霉素、蔗糖均能促進(jìn)花粉萌發(fā)[30]。

小孢子培養(yǎng)過程中會產(chǎn)生有毒物質(zhì)，進(jìn)而降低胚狀體的發(fā)生頻率，改變胚的形態(tài)，產(chǎn)生畸形胚，而活性炭可有效吸附有毒物質(zhì)。姜鳳英等認(rèn)為，添加活性炭的培養(yǎng)基有利于魚雷形小孢子胚成苗，100 mg/L活性炭的成苗率增大最明顯，但對子葉形胚成苗的作用不大[31]。申書興等發(fā)現(xiàn)，活性炭的適宜添加量為0.05～0.10 g/L[32]。Lichter指出，活性炭不僅能吸收培養(yǎng)基中的有毒物質(zhì)，也能吸收一些必要元素和植物激素，因此活性炭濃度不宜過高，否則會起負(fù)作用[33]。配制活性炭時最好加少量（0.5%左右）瓊脂糖，因?yàn)闊o瓊脂糖的游離活性炭吸附到小孢子上反而會阻止胚狀體發(fā)生。

楊清等發(fā)現(xiàn)，花椰菜花藥培養(yǎng)中添加62.5 mg/L AgNO3能顯著促進(jìn)胚發(fā)生[34]。Ochatt等發(fā)現(xiàn)，AgNO3對花藥培養(yǎng)具有促進(jìn)作用，對某些基因型的促進(jìn)效果較明顯[35]。Dias等對甘藍(lán)類蔬菜花藥培養(yǎng)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加 10 mg/L AgNO3后出胚率大大增加，而在未加AgNO3的培養(yǎng)基中這些基因型幾乎無胚狀體形成[36-39]。Biddington等指出，對于難出胚的基因型，在培養(yǎng)基中加入乙烯的抑制劑 AgNO3 也許能提高其出胚率[40]。方淑桂等認(rèn)為，AgNO3可促進(jìn)青花菜小孢子的胚胎發(fā)生[41]。于文佳等在小菘菜胚芽分化影響的研究中發(fā)現(xiàn)，在B5固體培養(yǎng)基中添加一定質(zhì)量濃度的AgNO3，[JP]可顯著提高小孢子的胚芽誘導(dǎo)率和平均每胚出芽數(shù)[42]。[JP]

常用于植物組織培養(yǎng)的外源激素有2類，即生長素類（2，4-D、IAA、NAA、IBA）和細(xì)胞分裂素類（KT、6-BA、ZT、TDZ等）。Metwally等研究花藥培養(yǎng)基中蔗糖和2，4-D的用量發(fā)現(xiàn)，添加150 g/L蔗糖、5 mg/L 2，4-D的培養(yǎng)基誘導(dǎo)的南瓜單倍體植株最多[9]。Ashok等研究了Calyps、Cucumis sativus Lr 等2個黃瓜品種在花藥離體培養(yǎng)時對生長調(diào)節(jié)劑的反應(yīng)，認(rèn)為最佳的誘導(dǎo)胚產(chǎn)生愈傷組織是在B5培養(yǎng)基中添加2.0 μmol/L 2，4-D和1.0 μmol/L BAP，在添加0.09 μmol/g蔗糖、0.25 μmol/L NAA、0.25 μmol/L KN的B5培養(yǎng)基中獲得分化的胚胎，在添加5 μmol/L ABA的B5培養(yǎng)基中胚胎發(fā)育，在含有0.09 μmol/L蔗糖的B5培養(yǎng)基中萌發(fā)成苗[12]。朱至清等認(rèn)為，外源激素對花粉細(xì)胞去分化啟動是非必需的，但可防止多細(xì)胞花粉的敗育，使較多細(xì)胞形成愈傷組織[43]。薛光榮等證實(shí)，適當(dāng)提高2，4-D濃度可提高西瓜愈傷組織誘導(dǎo)率，適當(dāng)提高BA或KT濃度可提高直接增殖率和分化率[6]。生長激素是黃瓜組織培養(yǎng)中的重要因素，其中2，4-D作用最明顯，NAA次之，細(xì)胞分裂素中KT的作用差異顯著。甜瓜在較低濃度生長激素調(diào)節(jié)下具有較高分化率和成苗率。關(guān)于葫蘆、冬瓜、南瓜、絲瓜等花藥培養(yǎng)的報(bào)道不多，但許多學(xué)者使用未添加任何外源激素的培養(yǎng)基同樣獲得了數(shù)量和質(zhì)量均較好的胚狀體，因此外源激素在小孢子培養(yǎng)中不是必需的。

2.1.7培養(yǎng)基pH值大多數(shù)植物適合在pH值為5.8～6.0的培養(yǎng)基中生殖，pH值在該范圍內(nèi)可促進(jìn)細(xì)胞分裂與增殖。Barinova等研究發(fā)現(xiàn)，高pH值條件下游離小孢子體內(nèi)的轉(zhuǎn)化酶活性減弱，同時14C標(biāo)記的蔗糖大量進(jìn)入小孢子體內(nèi)，表明處于高pH值條件下的小孢子糖代謝能力減弱，從而造成饑餓脅迫，阻斷了配子體發(fā)育途徑，誘導(dǎo)孢子體發(fā)育[44]。可見，適當(dāng)提高pH值可能有利于誘導(dǎo)小孢子胚胎發(fā)生。

2.1.8小孢子密度小孢子培養(yǎng)密度過大致使培養(yǎng)基養(yǎng)分供應(yīng)不足，易引發(fā)培養(yǎng)基中毒性物質(zhì)過多釋放，導(dǎo)致健康優(yōu)秀的小孢子難以出胚；密度過低則小孢子的競爭優(yōu)勢得不到體現(xiàn)，胚胎發(fā)生比較困難，一般采用的培養(yǎng)密度為10萬～50萬個/mL。詹艷等采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將小孢子密度調(diào)整至10萬個/mL左右，但每次均采用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整小孢子密度使操作過于繁瑣，影響試驗(yàn)進(jìn)程[13]。不少學(xué)者根據(jù) 1 mL 培養(yǎng)基中花蕾的數(shù)量研究小孢子密度對出胚的影響。

2.2胚培養(yǎng)發(fā)育及植株再生

[JP2]一般小孢子培養(yǎng)2～3 d發(fā)生第1次分裂，培養(yǎng)2～3周后形成胚狀體。小孢子胚狀體的類型分為球形、心形、魚雷形、子葉形以及畸形胚。由胚發(fā)育成植株的過程，在游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用中具有重要作用。國內(nèi)外眾多學(xué)者在此方面的研究結(jié)果表明，胚的直接成苗率與培養(yǎng)基、胚的質(zhì)量、供體植株的基因型均有關(guān)。詹艷等將獲得的子葉形胚、部分球形胚和心形胚轉(zhuǎn)移至胚狀體萌發(fā)培養(yǎng)基MS-BA上，培養(yǎng)20 d后，球形胚、心形胚褐化死亡；發(fā)育成熟的子葉形胚正常萌發(fā)，形成根芽俱全的小植株；處于初期的子葉形胚則大部分未能正常分化，出現(xiàn)未變綠、褐化死亡或僅有根分化的現(xiàn)象[13]?？梢姡尤~形胚最易成苗，因此胚狀體能否正常發(fā)育為成熟的子葉形胚是成苗的關(guān)鍵。甘藍(lán)類蔬菜出現(xiàn)肉眼可見的胚狀體后，將其置于搖床上在60 r/min、25 ℃條件下暗培養(yǎng)，形成子葉形胚狀體時轉(zhuǎn)入B5固體培養(yǎng)基，于25 ℃光暗交替條件下繼續(xù)培養(yǎng)。[JP]

谷佳南等研究了黃瓜花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生，將帶有芽點(diǎn)的愈傷組織轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，分化出根狀物后，芽的伸長能力明顯下降，使植株再生極為困難[45]。這可能與基因型有關(guān)，也可能是黃瓜花藥愈傷組織中存在某種激素，在促進(jìn)根分化的同時阻礙了芽的伸長生長，為植株再生帶來一定困難。激素配比尚須調(diào)整，黃瓜花藥再生植株分化有待進(jìn)一步研究。

2.3小孢子再生植株的倍性鑒定

小孢子培養(yǎng)得到的再生植株以單倍體居多，然而培養(yǎng)過程中一般會發(fā)生不同程度的自然加倍，因此小孢子再生植株是由不同倍性植株組成的混合群體，為生產(chǎn)應(yīng)用帶來較大不便，有必要對其進(jìn)行倍性鑒定。常用的倍性鑒定方法有形態(tài)學(xué)鑒定法、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)法、花粉母細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)法、根尖染色體計(jì)數(shù)法、流式細(xì)胞儀DNA含量測定法，且這5種鑒定方法各有優(yōu)劣。不同倍性植株的外部形態(tài)特征存在差異，單倍體植株的生活力、生長勢、各主要器官大小均劣于正常二倍體，而倍性水平高的植株形態(tài)優(yōu)于正常二倍體。

植株形態(tài)鑒定法易受植株長勢、營養(yǎng)條件等因素的影響，且倍性水平高時不易區(qū)分，判斷結(jié)果不準(zhǔn)確，難以有效鑒定。氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)法具有簡便、快捷、準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，但須建立不同倍性葉綠體數(shù)量與倍性之間的關(guān)系，對染色方法、操作技巧等有一定要求。為快速鑒定煙草花粉植株染色體倍性，劉仁祥等采用氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)法[46]。為尋求簡便、快速的西瓜染色體倍性鑒定方法，施先鋒等以二倍體西瓜TS、0517及其同源四倍體為試材，通過觀察葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)來鑒定西瓜染色體倍性，結(jié)果表明，2種倍性間的葉綠體數(shù)差異顯著，二倍體葉綠體數(shù)在15個以下，四倍體葉綠體數(shù)≥15個，氣孔葉綠體數(shù)隨染色體倍性的增加而增加，用氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)預(yù)測植株倍性的準(zhǔn)確率可達(dá)90.2%[47]。可見，采用熒光顯微鏡觀察葉綠體數(shù)可在苗期快速、準(zhǔn)確地確定植株的染色體倍性。

2.4染色體加倍

小孢子再生植株有很大部分不能自然加倍，須采用人工誘導(dǎo)方法進(jìn)行加倍。人工誘導(dǎo)方法有很多，通常采用2種途徑，即培養(yǎng)過程中處理、移栽時誘變劑處理。單倍體人工加倍主要采用0.2～0.4 mg/g秋水仙堿處理單倍體植株，使其加倍。采用秋水仙堿溶液處理根、芽等分生組織或直接加至培養(yǎng)基中，均可起到一定加倍作用。周偉軍等對剛分離的油菜小孢子、移入固體培養(yǎng)基前的胚體進(jìn)行秋水仙堿處理和再生植株浸根處理，研究3種不同時期秋水仙堿處理對小孢子胚胎發(fā)育、成苗、加倍率的影響，結(jié)果表明，采用秋水仙堿直接處理的新分離油菜小孢子培養(yǎng)體系獲得的自發(fā)加倍率顯著高于常規(guī)培養(yǎng)體系，且分離小孢子直接進(jìn)行秋水仙堿加倍染色體更為安全、快速、有效[48]。

3葫蘆科作物小孢子培養(yǎng)存在的問題與展望

近年來，盡管花粉培養(yǎng)取得了很大進(jìn)展，但對葫蘆科作物的研究相對較少，僅在黃瓜、西瓜上獲得了胚狀體或再生植株。小孢子培養(yǎng)在育種、生物技術(shù)等方面用處很大，但關(guān)于小孢子培養(yǎng)技術(shù)的機(jī)制目前仍不清楚。小孢子培養(yǎng)技術(shù)在十字花科、茄科、禾本科作物上已得到實(shí)際應(yīng)用，在葫蘆科作物上目前仍處于實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)階段。存在的主要問題是小孢子無法啟動萌發(fā)或成胚率太低，不同物種或不同基因型間差異較大，形成的愈傷組織或胚狀體無法進(jìn)一步發(fā)育成為單倍體植株。今后的研究將從碳源、生長調(diào)節(jié)劑的種類及濃度、活性炭的應(yīng)用、預(yù)培養(yǎng)的溫度及時間等方面入手，以期建立葫蘆科作物小孢子培養(yǎng)的植株再生體系，使小孢子培養(yǎng)技術(shù)在育種及其他生物技術(shù)的應(yīng)用中發(fā)揮積極作用，通過建立穩(wěn)定、高效地獲得純合二倍體的葫蘆游離小孢子培養(yǎng)體系來解決上述問題。

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