雜交水稻種子純度檢測方法綜述

宋豐順++倪大虎+++倪金龍++李莉++楊劍波

摘要：建立準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的檢測方法監(jiān)控雜交水稻純度對于保障我國水稻安全生產(chǎn)具有至關(guān)重要的作用。本文綜述了用于雜交水稻純度檢測的各種方法，并對各種方法的優(yōu)缺點進(jìn)行了評述，總體來講，我國雜交水稻純度鑒定方法的發(fā)展趨勢是由鑒定周期長向鑒定周期短，由鑒定程序復(fù)雜向簡單，由成本高向成本低的方向發(fā)展。根據(jù)各種檢測方法的特點，認(rèn)為DNA分子標(biāo)記技術(shù)和設(shè)計育種鑒定方法有較大發(fā)展空間，能滿足準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的要求；實時熒光PCR技術(shù)具有美好的前景。

關(guān)鍵詞：雜交水稻；種子純度；檢測；實時熒光PCR；DNA分子標(biāo)計；設(shè)計育種

中圖分類號： S511.03文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）06-006-05

自1976年雜交水稻在我國培育成功以來，其以明顯的產(chǎn)量優(yōu)勢和廣泛的生態(tài)適應(yīng)性受到普遍歡迎，迅速在全國乃至世界范圍推廣開來[1-2]。當(dāng)前雜交水稻種植面積約 1 667萬hm2，約占我國水稻種植總面積的60%，累計增收稻谷逾4億t，每年增產(chǎn)的糧食可多養(yǎng)活7 000萬人[3]，為我國乃至世界的糧食安全作出了巨大貢獻(xiàn)。雜交稻種子純度是保障其增產(chǎn)的關(guān)鍵。雜交稻種子純度是指雜交種子在特征特性方面典型一致的程度。由于雜交水稻制種環(huán)節(jié)多、周期長，在種子生產(chǎn)過程中生物學(xué)混雜和機(jī)械混雜時有發(fā)生，易導(dǎo)致雜交種不純。有研究指出，在一定范圍內(nèi)，雜交稻純度每下降1%，667 m2減產(chǎn)4～5 kg，純度下降10%，雜交稻將失去其增產(chǎn)優(yōu)勢[4]，我國規(guī)定雜交水稻種子純度不得低于96%。因此嚴(yán)格監(jiān)控雜交稻種子質(zhì)量，只允許合格種子進(jìn)入市場和田間，對確保水稻增產(chǎn)具有重要意義。這其中建立準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的雜交種純度檢測方法對于種子質(zhì)量監(jiān)控具有重要意義。目前雜交種純度檢測主要有以下幾種方法。

1海南種植鑒定法

利用海南冬季溫光資源進(jìn)行的田間種植鑒定是當(dāng)前雜交稻純度檢測最常用的方法之一。海南種植鑒定結(jié)果直觀且比較可靠，但種植環(huán)境條件的變化也可能引起某些假雜種與真雜種間難以區(qū)分，導(dǎo)致結(jié)果失真[5]。另一方面，該鑒定方法周期長，需要幾個月時間，如果等待鑒定結(jié)果，再進(jìn)行包裝銷售，將延誤農(nóng)民播種；如果隔年銷售，將增加種子越夏的倉儲費(fèi)用，且儲存不當(dāng)會導(dǎo)致種子發(fā)芽率下降，將給種子公司的經(jīng)營帶來諸多麻煩。當(dāng)前，采用海南種植鑒定的種子公司，在銷售種子時，多數(shù)情況下并不知道種子真實純度，只能憑借經(jīng)驗，根據(jù)天氣和制種田的情況估計純度，海南鑒定結(jié)果只作為售后參考，這給雜交水稻生產(chǎn)埋下了安全隱患，該行業(yè)也被稱為高風(fēng)險行業(yè)，流傳“十年賺錢，不夠一年賠”的說法。

2粒型鑒定法

粒型鑒定法通過觀察種子的形態(tài)特征，與標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行比較，判別種子真假，觀察的主要性狀有大小、形狀、稃殼色、稃尖色、[JP3]稃毛長短和稀密、柱頭色和夾持率等。其優(yōu)點是簡單、快速，但由于親緣關(guān)系較近的種子在形態(tài)上很難區(qū)分，且同一品種內(nèi)各種子形態(tài)并不完全一樣，因此檢驗結(jié)果可靠性差[6]。

3苯酚染色法

苯酚會使不同品種的谷?；蛎琢３尸F(xiàn)不同的顏色。水稻品種的苯酚染色一直被用于秈粳亞種間種子的鑒別，通常秈稻易著色，而粳稻難著色，并表現(xiàn)出程度上的差異。該法對秈、粳亞種間顏色區(qū)別明顯，但對亞種內(nèi)的水稻區(qū)分不明顯。同時，水稻種子成熟度不同，染色后顏色深淺也往往不一樣，所以該方法鑒定雜交種純度易造成人為誤差或錯誤[7]。

4蛋白質(zhì)電泳法

[JP2]由于遺傳上的差異，作物不同品種間的蛋白質(zhì)種類和含量不同。蛋白質(zhì)電泳可將品種間的蛋白差異在凝膠上區(qū)別開來。20世紀(jì)60年代，蛋白質(zhì)電泳技術(shù)即被應(yīng)用到水稻等作物雜交種純度檢測。根據(jù)被檢蛋白質(zhì)的功能，可將其分為種子貯藏蛋白電泳和同工酶電泳兩大類。目前用于純度檢測的種子貯藏蛋白主要有醇溶蛋白、清蛋白、球蛋白和谷蛋白[8-12]。同工酶是指催化反應(yīng)相同而結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)不同的一組酶，它們幾乎存在于所有生物中。被用于品種純度檢測的同工酶主要有酯酶同工酶、過氧化物同工酶、磷酸酶同工酶等。陸士偉等最早報道應(yīng)用幼苗酯酶同工酶測定雜交水稻種子純度[13]。李卓杰等利用胚芽的酯酶同工酶等電聚焦電泳對汕優(yōu)63、博優(yōu)64等進(jìn)行純度鑒定[14]。顏啟傳應(yīng)用種子及幼苗酯酶同工酶電泳鑒定多個雜交稻品種和親本種子[15-16]。陶芳等利用汕優(yōu)64、汕優(yōu)63、特優(yōu)559幼芽的酯酶同工酶譜帶數(shù)量和深淺進(jìn)行鑒定，結(jié)果與田間鑒定相差 1%～2%[17-18]。[JP]

蛋白質(zhì)電泳在純度鑒定中存在以下不足：（1）組織特異性強(qiáng)，不同發(fā)育階段和不同組織的圖譜差異大；（2）結(jié)果與操作過程相關(guān)，蛋白提取液、膠濃度和電泳系統(tǒng)不同，結(jié)果也會不同，導(dǎo)致難以形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[19-20]；（3）多態(tài)性少，對于親緣關(guān)系較近的親本及其雜交種難以鑒定；（4）偏親帶型的出現(xiàn)會使結(jié)果誤判[21]。所以，蛋白質(zhì)電泳法未能列入我國雜交水稻種子純度鑒定的國家標(biāo)準(zhǔn)，實踐中也未得到大規(guī)模應(yīng)用。

5DNA分子標(biāo)記鑒定法

DNA分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)為雜交水稻純度鑒定提供了新的思路。該技術(shù)直接以遺傳物質(zhì)DNA為基礎(chǔ)，所揭示的多態(tài)性直接反映基因組差異。與形態(tài)學(xué)、蛋白質(zhì)等其他鑒定技術(shù)相比，DNA分子標(biāo)記鑒定具有明顯的優(yōu)點：（1）無組織特異性，在生物體的各個組織、各個發(fā)育階段均可檢測，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否的問題[22-23]；（2）許多分子標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性，特別適合雜交種的檢測；（3）數(shù)量眾多，幾乎是無限的，遍布整個基因組；（4）多態(tài)性高，自然界存在許多等位型變異。正是因為上述優(yōu)點，使得DNA分子標(biāo)記技術(shù)在品種鑒定中具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，DNA標(biāo)記主要有RFLP、AFLP、RAPD、SCAR、SSR等。RFLP結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，是共顯性標(biāo)記，缺點是所需DNA量大且質(zhì)量高，操作步驟繁瑣，成本高。AFLP多態(tài)性豐富，所需DNA量小，但也需要酶切，對DNA純度要求也較高，如果基因組不完全酶切會影響結(jié)果，同時，操作程序長、步驟多，電泳繁雜，且主要屬于顯性標(biāo)記[24-25]。因此，這2項技術(shù)應(yīng)用于品種鑒定的報道很少。

1996年，錢前等利用RAPD標(biāo)記，成功實現(xiàn)對真、假Ⅱ優(yōu)63種子的鑒定[26]。同年，楊劍波等應(yīng)用RAPD標(biāo)記在30個隨機(jī)引物中篩選到6個多態(tài)引物能夠區(qū)分雜交水稻汕優(yōu)63及其親本[27]。RAPD操作簡單，但RAPD本身存在重大缺點：（1）結(jié)果受反應(yīng)條件影響很大，在很多情況下，試驗結(jié)果不能重復(fù)；（2）多態(tài)性仍不足，需要大量篩選引物獲得多態(tài)標(biāo)記；（3）主要為顯性標(biāo)記（極少數(shù)為共顯性），鑒定雜交種的能力不足[28]。產(chǎn)生這些缺點的根源是其擴(kuò)增時所用的10 bp隨機(jī)引物，擴(kuò)增位點不確定所致。1999年，楊劍波等將篩選到的多態(tài)性RAPD標(biāo)記進(jìn)行測序，并根據(jù)序列重新設(shè)計由 25～30個堿基組成的引物，將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，解決了RAPD標(biāo)記穩(wěn)定性差的問題[29]。[JP3]但是隨著種子市場的發(fā)展和雜交稻品種的迅速增多，針對特定品種大量篩選引物，用單個多態(tài)標(biāo)記鑒定種子的做法，顯然不能滿足市場需求。[JP]

SSR標(biāo)記的誕生，為確定一套通用引物，鑒定多個品種提供了可能。SSR是一類由幾個堿基組成的基序（motif）串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，它們廣泛分布于基因組的不同位置上，每個座位上基序的重復(fù)數(shù)目不同，因而形成多態(tài)性。SSR兩端的序列多是相對保守的單拷貝序列，可用來設(shè)計特異引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增每個位點，通過電泳分析擴(kuò)增片段的長度差異。

SSR標(biāo)記由于數(shù)量豐富，在染色體上分布均勻，多態(tài)性高，呈共顯性遺傳，重復(fù)性好，操作簡便等特點，而成為一種理想的雜交種檢測分子標(biāo)記。2000年，李莉等對協(xié)優(yōu)63、協(xié)優(yōu)64及其親本進(jìn)行SSR分析，篩選出13對SSR引物，可以對水稻雜交組合與親本之間，以及雜交組合相互之間進(jìn)行區(qū)分和鑒定[30]。此后，諸多的研究采用SSR標(biāo)記鑒定雜交種純度和真實性[31-38]。2006年國家標(biāo)準(zhǔn)《三系雜交水稻及親本真實性和品種純度鑒定DNA分析方法》（GB/T 20396—2006）和2007年農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《水稻品種鑒定DNA指紋方法》（NY/T 1433—2007）的頒布，標(biāo)志著利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定雜交水稻種子純度已經(jīng)成熟，并走向真正的應(yīng)用。2套標(biāo)準(zhǔn)均各自確定了一套多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、染色體分布均勻的通用SSR標(biāo)記，可用于鑒定不同的水稻品種。但是，DNA標(biāo)記技術(shù)，包括SSR標(biāo)記，仍需要專門的實驗室，所需儀器設(shè)備較昂貴，對人員科技水平要求較高，檢測過程較復(fù)雜，且成本較高，限制了該技術(shù)在基層的廣泛應(yīng)用。

6實時熒光PCR檢測法

純度檢測一般需要檢測幾百個單株，上述DNA分子標(biāo)記技術(shù)在檢測雜交種純度時，需要對每個單株分別檢測，工作量大。實時熒光PCR技術(shù)是近年來興起的新興檢驗技術(shù)，可對群體內(nèi)外源片段的含量進(jìn)行檢測，即只要檢測1個樣品。2007年，程毅等依據(jù)已報道的雄性不育特異片段R2-630WA設(shè)計了1對引物和1條TaqMan熒光探針，對17個水稻品種進(jìn)行實時熒光PCR檢測，結(jié)果表明：此探針能特異擴(kuò)增三系雜交稻F1及不育系；純度檢測時，在測定低濃度（10%～40%）樣品時偏差為2%左右，在測定高濃度（50%～100%）樣品時，偏差為5%左右。其對低純度樣品的檢測表現(xiàn)較好、高純度樣品檢測結(jié)果偏差較大，分析了以下幾方面原因：（1）曲線方程的推導(dǎo)需要更多數(shù)量和樣品的重復(fù)；（2）此種絕對定量的方法受PCR體系中反應(yīng)的核酸模板量影響較大，要想獲得更精確的結(jié)果，最好加入含有內(nèi)參基因標(biāo)記的探針，實現(xiàn)相對定量后可大大提高檢驗的準(zhǔn)確性；（3）對于實時熒光PCR這種高靈敏度的技術(shù)來說，其優(yōu)點在于從所有樣品中檢測極少數(shù)陽性樣品，因為反應(yīng)中加入引物和探針的量有限，所以當(dāng)樣品中存在很多陽性模板時，反應(yīng)容易進(jìn)入平臺期，檢測結(jié)果則出現(xiàn)偏大誤差[38]。實時熒光PCR技術(shù)檢測雜交種純度前景看好，但是當(dāng)前的檢測準(zhǔn)確性還需進(jìn)一步提高，檢測標(biāo)記的選擇和設(shè)計方面還需進(jìn)一步優(yōu)化。

7設(shè)計育種鑒定法

遺傳和育種家探索利用苗期標(biāo)記性狀設(shè)計育種，以實現(xiàn)雜交水稻純度的快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)檢測。

7.1除草劑標(biāo)記性狀

2000年，張集文等利用輻射誘變選育出苯達(dá)松敏感致死突變體8077S，該性狀由隱性單基因控制，其自交苗能被除草劑苯達(dá)松殺死，雜交種苗則對該藥劑不敏感，運(yùn)用該方法可在苗期快速檢測和去除雜交稻中混入的兩系不育系種子[39-41]。Pan等克隆了該基因（bel）[42]。黃大年等嘗試用抗除草劑基因快速檢測和提高雜交稻純度[43]。

[HTK]7.2葉色標(biāo)記[HT]

在兩系和三系雜交稻中，給育性不穩(wěn)的不育系，打上易于識別的葉色標(biāo)簽，是解決不育系自交結(jié)實問題的另一條有效途徑。馬志虎等和舒慶堯等對能產(chǎn)生實際應(yīng)用價值的葉色標(biāo)記性狀進(jìn)行了概括，即作為葉色標(biāo)記性狀必須具有以下4個主要條件[44-45]：（1）標(biāo)記性狀遺傳穩(wěn)定，不易受外界環(huán)境因素的影響；（2）標(biāo)記性狀明顯，易目測識別；（3）標(biāo)記性狀未與不良性狀連鎖，生長健壯，對雜交種、不育系、保持系的產(chǎn)量無影響；（4）標(biāo)記性狀為隱性。根據(jù)葉片顏色的不同，可將其分為以下幾類：

（1）白化轉(zhuǎn)綠標(biāo)記。舒慶堯等、吳偉等、楊文清、沈圣泉等、趙海軍等、吳殿星等分別利用培矮64S、廣占63S、Ⅱ-32B、龍?zhí)仄諦種子，育成玉兔S、NHR111S、白豐A、全龍A等白化轉(zhuǎn)綠型葉色標(biāo)記不育系[46-54]。這些材料苗期1～3葉期表現(xiàn)葉緣白化，從第4葉開始轉(zhuǎn)綠[55-57]。趙海軍等以玉兔S為材料研究發(fā)現(xiàn)，白化轉(zhuǎn)綠型突變體受單隱性基因控制[52]。在農(nóng)藝性狀方面，沈圣泉等、趙海軍等的研究結(jié)果表明，這種類型的不育系無論稀播或密播，苗期生長慢于正常綠苗，但不會造成競爭致死[51-52]。Su等報道了培矮64S的白葉突變體ysa（young seedling albino），該突變體3葉期以前為白色葉，3葉期后逐漸轉(zhuǎn)綠，轉(zhuǎn)綠后對農(nóng)藝性狀無影響明顯，該性狀為隱性基因控制，基因已被克隆[58]。

（2）淡綠葉色標(biāo)記。1999年，董鳳高等選育成帶有明顯淡綠葉標(biāo)記性狀的秈型兩系不育系M2S[59]。余新橋等以M2S為供體，與中紅B雜交，再用其F1為母本與珍汕97B雜交，F(xiàn)2代選擇具有明顯淡綠葉標(biāo)記性狀的株系與珍汕97A雜交、回交選育成該類型不育系標(biāo)1A[60]。宋克堡等從安農(nóng)810S繁殖田中發(fā)現(xiàn)了1株水稻淡黃葉隱性突變體，并育成系列淡黃葉兩系不育系[61]。曹立勇等將淡綠色標(biāo)記性狀pgl基因定位于第10條染色體[62]。楊文清等以自選的標(biāo)8S為材料，遺傳分析表明其黃白色性狀受1對隱性主效基因控制，還與生長溫度呈負(fù)相關(guān)[48]。王軍等在粳稻武運(yùn)粳7號中發(fā)現(xiàn)了1個黃綠葉自然突變體，經(jīng)過多代自交形成了穩(wěn)定的突變系，該突變系和武運(yùn)粳7號的正反交F2代遺傳分析表明，該材料的黃綠葉由1對隱性基因控制，命名為[WTBX][STBX]ygl-2[WTBZ][STBZ]，并將其定位在第6染色體RM6298標(biāo)記附近[63]。田振濤等對4個淡綠葉粳稻光溫敏核不育系和正常葉色粳稻不育系浙農(nóng)大11S及秈型不育系培矮64S進(jìn)行了開花習(xí)性的比較，結(jié)果顯示：淡綠葉色不育系的開花天數(shù)、開花率、柱頭外露率都低于正常葉色不育系，日開花率、穎花張開時間和張開角度易受環(huán)境條件影響，表現(xiàn)較大差異；但淡綠葉色不育系的開花高峰都在午前09：00或10：00，表現(xiàn)早花特性[64]。

（3）紫色葉標(biāo)記。曹立勇等采用1份秈型紫葉水稻和兩系不育系W6154S雜交，在F2代選擇紫葉稻回交1次后，以系譜法逐代選擇而育成了帶紫葉標(biāo)記的兩系不育系中紫S[62]；楊騰幫等選育了明紫02S和明紫03S[65-66]；余顯權(quán)等育成綜合性狀優(yōu)良、育性轉(zhuǎn)換明顯的隱性紫葉兩系不育系99H114紫S等[67-68]。吳關(guān)庭等通過平陽霉素與射線復(fù)合處理，從早秈品種陸青早1號中誘變獲得了紫葉突變體PLM12，遺傳分析認(rèn)為該紫葉性狀屬核遺傳，由1對隱性主效基因控制，同時受若干微效基因修飾[69]。同樣，石幫志等將紫香稻與明恢63雜交，F(xiàn)1表現(xiàn)綠葉，F(xiàn)2群體綠葉株與紫葉株的分離比符合3 ∶[KG-*3]1，BC1群體的分離比符合1 ∶[KG-*3]1，證明紫香稻的紫葉性狀是隱性性狀[70]。但是，錢前等和曾大力等利用1份秈型紫葉水稻分別與綠葉秈、粳稻雜交，發(fā)現(xiàn)雜交種F1呈綠色，F(xiàn)2群體中綠葉與紫葉之比為13 ∶[KG-*3]3、55 ∶[KG-*3]9，符合2～3對基因的分離模式，推測綠葉稻品種均帶有1對顯性紫葉抑制基因IPl（t），使得雜交種F1呈綠色，另外還有2對顯性基因控制紫色表型[71-72]。李維明等在其研究的F2群體中，也檢測到13 ∶[KG-*3]3的分離比[73]。謝國生等對紫葉稻品種IC11003的遺傳分析表明，該品種的紫葉性狀受核內(nèi)2對顯性互補(bǔ)基因控制，無細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)[74]。潘學(xué)彪等對W6417S的天然變異紫葉稻進(jìn)行遺傳分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1代植株均為綠色，F(xiàn)2群體綠葉株 ∶[KG-*3]紫葉株分離比有3 ∶[KG-*3]1、13 ∶[KG-*3]3和55 ∶[KG-*3]9等3種類型[75]。牟同敏等利用紫葉稻與22個不同類型的綠葉稻雜交，F(xiàn)1均表現(xiàn)為綠葉，而F2群體綠葉株：紫葉株的分離比為3 ∶[KG-*3]1、13 ∶[KG-*3]3、55 ∶[KG-*3]9、229 ∶[KG-*3]27等4種遺傳分離模型[76]。這些分離比表明，紫葉水稻和綠葉親本間存在1～4對基因的差異，其中1對為顯性抑制基因，雙親之間基因數(shù)目不同，表現(xiàn)出不同的分離比例。鄧國富用紫葉稻IRI552與22個綠葉品種雜交，F(xiàn)1、F2、BCF1、BCF2和F3群體的遺傳分析結(jié)果表明，紫葉稻IRI552的紫葉性狀由核內(nèi)1對隱性紫葉基因（pl-pl）和1對顯性紫葉抑制基因（Ipl-Ipl）控制，同時也受紫葉調(diào)節(jié)基因（Ci-Ci）的作用；對紫葉基因及紫葉抑制基因定位的結(jié)果表明，隱性紫葉基因（pl-pl）位于第6染色體標(biāo)記RM587和RM584之間，紫葉抑制基因（Ipl-Ipl）位于第1染色體SSR標(biāo)記RM9和RM488之間[77]。紫葉稻材料大多數(shù)未能在生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用，究其原因要么是溫敏性太強(qiáng)，要么是配合力、稻米品質(zhì)尚不夠理想等[77-81]。

7.3芽鞘紫線法

胚芽鞘是單子葉植物，特別是禾本科植物胚芽外的錐形套狀物，有保護(hù)胚芽中更幼小的葉和生長錐的作用。在種子萌發(fā)時，能夠看到的第一個器官便是胚芽鞘，胚芽鞘上表現(xiàn)的性狀也是種子萌發(fā)后所能直接觀察到的最早期性狀。

水稻芽鞘紫線是在胚芽鞘兩側(cè)各出現(xiàn)的1條清晰可見的紫色線條。國內(nèi)很多育種家試圖將其運(yùn)用于雜交種的純度鑒定。1985年，沈又佳等發(fā)現(xiàn)化學(xué)殺雄制種的贛化2號雜交種芽鞘具有紫線，其母本IR24芽鞘無紫線，父本獻(xiàn)黨1號芽鞘有紫線。由于化學(xué)殺雄不徹底，雜交種中常混有母本IR24，因此他們提出通過觀察芽鞘紫線鑒別雜交種中混入的母本種子[82]。富昊偉將芽鞘無紫線的三系不育系嘉浙A和中浙A與芽鞘有紫線的父本配組，雜種F1的芽鞘有紫線，據(jù)此在苗期可觀察芽鞘紫線有無鑒別出雜交種中混入的不育系和保持系[83]。但這2種方法都無法將雜交種中混入的父本給區(qū)分開來，更沒有能力區(qū)分串粉株和機(jī)械混雜株。

國外對于芽鞘紫線的遺傳研究較早，印度學(xué)者Dhulappanavar等利用T-160（芽鞘無紫線）和AC-177（芽鞘紫線）配置的F2群體，紫線對無紫線的分離比為 195 ∶[KG-*3]61，認(rèn)為該性狀受2個顯性重疊基因[WTBX][STBX]Pc1、Pc2[WTBZ][STBZ]和1個顯性抑制基因I-Pc、1個顯性反抑制基因Ai-Pc共4個基因控制[84-85]；印度的Maekeawa則認(rèn)為該性狀僅受2個顯性互補(bǔ)基因[WTBX][STBX]Pc-1、Pc-2[WTBZ][STBZ]控制，與褐飛虱抗性連鎖[86]。

1998年，席建民對5個雜交組合（母本均具有紫線、父本均為無紫線）進(jìn)行遺傳分析，F(xiàn)1均表現(xiàn)出紫線，F(xiàn)2紫線 ∶[KG-*3]無紫線分離比有9 ∶[KG-*3]7、15 ∶[KG-*3]1、63 ∶[KG-*3]1、3 ∶[KG-*3]14共4種類型，這表明紫線遺傳受多對基因調(diào)控[87]。2009年，張毅等對水稻芽鞘紫線的遺傳分析發(fā)現(xiàn)了“雙親芽鞘無紫線但其F1有紫線”的現(xiàn)象，該現(xiàn)象由[WTBX][STBX]OsAi和OsC1[WTBZ][STBZ] 2對基因控制，并將[WTBX][STBX]OsAi和OsC1[WTBZ][STBZ]分別定為在Chr.11（RM26384和C11Lz2標(biāo)記間）和Chr.6（RM5754和RM19570之間，該區(qū)間的[WTBX][STBX]LOC_Os06g10350[WTBZ][STBZ]為玉米的同源色素合成基因C），同時提出了選育芽鞘無紫線而其他器官有紫色的不育系（[WTBX][STBX]Osai OsC1[WTBZ][STBZ]）和芽鞘無紫線且其他器官無紫色的恢復(fù)系（[WTBX][STBX]OsAi Osc1[WTBZ][STBZ]），實現(xiàn)雙親互補(bǔ)，配組芽鞘有紫線的雜交種，用于雜交種純度檢測的策略。與葉色法相比，該方法不僅可以區(qū)分雜交種中混有的不育系，還可以區(qū)分恢復(fù)系和無紫線種子的混雜，且芽鞘紫線在發(fā)芽后3 d就可觀察到，近一步縮短了鑒定周期。但該方法與葉色法等其他方法一樣，仍無法區(qū)分外來串粉和有紫線種子的機(jī)械混雜。因為絕大多數(shù)水稻都含有OsAi基因，串粉株也會表現(xiàn)為芽鞘紫線；且如果有芽鞘紫線種子發(fā)生混雜，在雜交種中也無法被識別出來。

8結(jié)語

建立準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的檢測方法監(jiān)控雜交水稻純度對于保障我國水稻安全生產(chǎn)具有至關(guān)重要的作用。海南田間種植鑒定是最古老的鑒定方法，因為其鑒定方法簡單且結(jié)果直觀，仍是當(dāng)前最常用的鑒定方法，但是鑒定周期太長。粒型鑒定和苯酚染色鑒定，由于準(zhǔn)確性差，在純度檢測上已不常用，只在區(qū)別品種間差異時會使用。蛋白質(zhì)電泳法在部分種子公司仍有使用，但是普及率不高。DNA分子標(biāo)記技術(shù)由于其準(zhǔn)確可靠，在種子純度檢測領(lǐng)域得到了大發(fā)展，隨著DNA分子標(biāo)記成本的降低、通量的進(jìn)一步提高，DNA標(biāo)記技術(shù)會有更廣闊的應(yīng)用。實時熒光PCR技術(shù)具有美好的前景，可以把幾百份樣品混合為一個樣品進(jìn)行檢測，大大減小了檢測工作量，但是準(zhǔn)確性仍需要提升，未來很有可能有新技術(shù)在該領(lǐng)域有突破。設(shè)計育種鑒定具有鑒定快速、準(zhǔn)確、成本低的特點，但需要對雜交稻的親本進(jìn)行改良，使不育系攜帶易識別的隱性性狀，且隱性性狀不能影響到農(nóng)藝性狀，很多報道的可用于純度檢測的不育性并沒能在生產(chǎn)上大規(guī)模應(yīng)用，可能與攜帶的隱性性狀影響到農(nóng)藝性狀有關(guān)。該方法在鑒定兩系雜交水稻種子過程中，因遇低溫導(dǎo)致不育系自交結(jié)實，具有很大的應(yīng)用空間?？傮w來講，雜交水稻純度鑒定方法的發(fā)展趨勢是由鑒定周期長向鑒定周期短，由鑒定程序復(fù)雜向簡單，由成本高向成本低的方向發(fā)展。

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