甜瓜T-DNA插入突變體的構(gòu)建

許榮華，姜陸，寧雪飛，李冠

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊　830046)

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甜瓜T-DNA插入突變體的構(gòu)建

許榮華，姜陸，寧雪飛，李冠

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊830046)

摘要：【目的】構(gòu)建激活標(biāo)簽載體并將其轉(zhuǎn)入甜瓜中，獲得甜瓜T-DNA插入突變體，為甜瓜功能基因組學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。【方法】用PCR法擴(kuò)增目的DNA片段，經(jīng)EcoRI和SacI順序酶切，將目的片段連接到pCAMBIA2301載體上，構(gòu)建含4×35s Enhancer DNA片段的激活標(biāo)簽載體。以甜瓜品種 ‘伽師’為材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化甜瓜愈傷組織，獲得甜瓜T-DNA插入突變體?！窘Y(jié)果】獲得4株T0代甜瓜轉(zhuǎn)化幼苗，通過(guò)Kan篩選和PCR鑒定甜瓜轉(zhuǎn)化幼苗的DNA中是否含有目的基因，證明其中3株甜瓜轉(zhuǎn)化幼苗為轉(zhuǎn)基因植株。【結(jié)論】獲得了突變植株，為甜瓜重要性狀基因發(fā)掘奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甜瓜；激活標(biāo)簽；T-DNA插入突變體

0引 言

【研究意義】甜瓜(CucumismeloL．)是全球的10大水果之一[1]，也是葫蘆科基因組學(xué)研究的模式種。新疆作為厚皮甜瓜的次生起源中心之一,甜瓜品種類(lèi)型之多、品質(zhì)之佳、分布之廣、栽培面積之大均居全國(guó)首位，有許多品質(zhì)優(yōu)良的甜瓜種質(zhì)資源,然而各品種均存在抗病性差、不耐弱光等問(wèn)題[2]。盡管2012年甜瓜基因組測(cè)序的完成獲得了大量甜瓜基因組序列的數(shù)據(jù)[3]，但是DNA或者蛋白質(zhì)本身不能為基因的各項(xiàng)生物學(xué)功能提供足夠的信息。研究基因功能最直接的方法之一是破壞基因的表達(dá)并分析由此帶來(lái)的表型變化。由于除了能破壞插入位點(diǎn)基因的表達(dá)，插入的片段還能在分析突變體時(shí)用作分子標(biāo)記，轉(zhuǎn)座子和農(nóng)桿菌T-DNA插入突變已經(jīng)成為最廣泛應(yīng)用的方法。由于T-DNA插入拷貝數(shù)低，平均每一個(gè)轉(zhuǎn)化植株只含1.5個(gè)拷貝，而且能在后代穩(wěn)定遺傳，農(nóng)桿菌T-DNA插入突變已經(jīng)成為研究功能基因組學(xué)應(yīng)用最廣泛的方法大規(guī)模構(gòu)建甜瓜突變體，對(duì)表型特異突變體進(jìn)行篩選與分析，明確相關(guān)基因的功能為甜瓜優(yōu)良基因資源的利用奠定了基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】1992年，Hayashi等[4]創(chuàng)造出來(lái)激活標(biāo)簽(Activation tagging)技術(shù)，構(gòu)建了帶有四個(gè)串聯(lián)花椰菜病毒35S啟動(dòng)子是增強(qiáng)子序列的T-DNA載體，轉(zhuǎn)入植物中獲得基因過(guò)表達(dá)的突變體。激活標(biāo)簽技術(shù)在基因功能組學(xué)研究中發(fā)揮著重要的作用，激活標(biāo)簽法構(gòu)建突變體已應(yīng)用到擬南芥[5]，水稻[6]，棉花[7],油菜[8]，番茄[9],矮牽牛[10]等植物基因功能研究中,并取得較好成果。運(yùn)用激活標(biāo)簽法,已從擬南芥中分離出lep、sturdy等30多種新的基因,并對(duì)ft、myb、yucca等基因進(jìn)行了詳細(xì)的功能研究。其中ft基因編碼的蛋白產(chǎn)物是成花激素，是擬南芥誘導(dǎo)開(kāi)花途徑中的重要基因；MYB轉(zhuǎn)錄因子基因編碼的MYB轉(zhuǎn)錄因子參與植物次級(jí)代謝過(guò)程，在木質(zhì)部合成和分化過(guò)程中起重要調(diào)控作用；與生長(zhǎng)素含量有關(guān)的yucca基因編碼黃素類(lèi)單加氧酶，YUCCA酶是色胺途徑中形成吲哚-3-乙醛肟的關(guān)鍵酶，YUCCA基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致吲哚-3-乙醛肟過(guò)剩，生長(zhǎng)素含量上升，表現(xiàn)為高激素顯性[11-15]。而且Tani等發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的激活標(biāo)簽載體不僅可用于研究植物的生長(zhǎng)發(fā)育，也可用于發(fā)現(xiàn)抗病基因[16]。【本研究切人點(diǎn)】目前國(guó)內(nèi)外主要采用EMS化學(xué)誘變的方法獲得甜瓜突變體,結(jié)合高通量測(cè)序的方法點(diǎn)突變進(jìn)行檢測(cè)[17]。而插入突變的方法在甜瓜構(gòu)建突變體研究中并未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。通過(guò)T-DNA激活標(biāo)簽法獲得甜瓜突變體，可實(shí)現(xiàn)對(duì)甜瓜基因功能的深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】構(gòu)建激活標(biāo)簽載體并轉(zhuǎn)化甜瓜愈傷組織，獲得再生植株，為甜瓜重要性狀基因的發(fā)掘奠定基礎(chǔ)，為分子標(biāo)記輔助改良甜瓜品種提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材 料

1.1.1植物材料

甜瓜品種為卡拉克賽(又名伽師瓜)，種子購(gòu)自于新疆哈密瓜種業(yè)有限責(zé)任公司。該品種的特點(diǎn)是晚熟(生育期110～119 d)、耐貯藏和耐運(yùn)輸，高產(chǎn)，品質(zhì)中等，致命弱點(diǎn)是抗病性差。

1.1.2菌種和質(zhì)粒

E．coliDH5α，農(nóng)桿菌菌株Gv3101為實(shí)驗(yàn)室保存；pCAMBIA2301質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)室保存；pBinGlyRed3-35S質(zhì)粒(含4×35s Enhancer)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的張椿雨先生所贈(zèng)。

1.1.3工具酶和主要試劑

限制性?xún)?nèi)切酶(EcoRI和SacI)、T4DNA連接酶、Taq酶、DNA marker購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA回收試劑盒購(gòu)自上海寶生物工程公司；卡那霉素(Kanamycin)、頭孢(Cephalosporins)、利福平(Rifampicin)，其余常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方 法

1.2.1PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)pBinGlyRed3-35s質(zhì)粒所含的4×35s Enhancer DNA序列，設(shè)計(jì)含有EcoRI(下劃線(xiàn)部分)上有引物：5’-GGAATTCCGCAGCGTATGGAT-3’和SacI(下劃線(xiàn)部分)下游引物：5’-CGAGCTCGATATAGAGGAAGGGTCT-3’。引物由上海生物工程公司合成。

1.2.2激活標(biāo)簽載體的構(gòu)建

以pBinGlyRed3-35s為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性4 min ,94℃變性45 s,56℃退火45 s,72℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán), 72℃延伸10 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR 產(chǎn)物檢測(cè)、測(cè)序。利用EcoRI和SacI順序酶切目的片段和pCAMBIA2301，切膠回收，16℃過(guò)夜連接，在T4DNA連接酶作用下構(gòu)建激活標(biāo)簽載體pCAMBIA2301-35s，熱激法將激活標(biāo)簽載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E．coli中，經(jīng)菌液PCR和酶切鑒定、測(cè)序。

1.2.3農(nóng)桿菌Gv3101感受態(tài)細(xì)胞及轉(zhuǎn)化

制備農(nóng)桿菌Gv3101感受態(tài)細(xì)胞，利用凍融法[18]將構(gòu)建好的激活標(biāo)簽載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌Gv3101感受態(tài)細(xì)胞中，并保存于 -80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4農(nóng)桿菌介導(dǎo)甜瓜轉(zhuǎn)化及培養(yǎng)

取無(wú)菌培養(yǎng)條件下萌發(fā)的甜瓜子葉,切取子葉中段，接種于預(yù)培養(yǎng)基(MSB+1.0mg/L 6-BA)上預(yù)培養(yǎng)3～5 d；取出外植體置于含有農(nóng)桿菌菌液(OD600=0.5～0.7)的YEB液體培養(yǎng)中浸泡10 min,用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面過(guò)多菌液,置于培養(yǎng)基(MSB+1.0 mg/L 6-BA)上暗培養(yǎng) 3～5 d；用200 mg/LCef水洗外植體后轉(zhuǎn)接到篩選分化培養(yǎng)基(MSB+1 mg/L 6-BA+500 mg/L Cef+50 mg/L Kan)上培養(yǎng)；待芽長(zhǎng)至2 cm左右,切取小芽,轉(zhuǎn)入伸長(zhǎng)培養(yǎng)基(MSB+0.1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L GA3+500 mg/L Cef+50 mg/L Kan)；最后置于生根培養(yǎng)基中(MSB+MSB+0.01 mg/L NAA)中生根。

1.2.5轉(zhuǎn)化苗PCR鑒定

DNA提取參照陸璐等[19]CTAB 法進(jìn)行,以轉(zhuǎn)化苗DNA為模板，用4×35s Enhancer基因序列擴(kuò)增的引物按照如下程序擴(kuò)增：94℃預(yù)變性4 min后，94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.14×35 s Enhancer基因克隆

以pBinGlyRed3-35s為模板，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)(EcoRI，SacI)的引物，PCR擴(kuò)增4×35 s Enhancer DNA片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)與預(yù)期大小相符。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京六合華大基因測(cè)序，測(cè)序表明PCR擴(kuò)增目的基因序列正確。圖1

M：DL2000 marker；CK：陰性對(duì)照；1，2：4×35s Enhancer PCR結(jié)果

M：DL2000 marker；CK：negative control；1，2：PCR products of 4×35s Enhancer

圖1帶有酶切位點(diǎn)的4×35s Enhancer PCR擴(kuò)增

Fig.1 The amplification of 4×35s Enhancer with the two restricted sites ofEcoRI andSacI

2.2激活標(biāo)簽載體的構(gòu)建

用EcoRI和SacI順序酶切目的片段和pCAMBIA2301，切膠回收并過(guò)夜連接，后轉(zhuǎn)化到DH5α中，挑取具Kan抗性的陽(yáng)性克隆，試劑盒提取重組質(zhì)粒DNA，經(jīng)EcoRI和SacI順序酶切鑒定酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證表明激活標(biāo)簽載體pCAMBIA2301-35s構(gòu)建成功，該載體含有4×35s EnhancerDNA片段。構(gòu)建好的激活標(biāo)簽載體經(jīng)凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌Gv3101中，在篩選培養(yǎng)基(含Kan和Rif)上培養(yǎng)，挑取克隆在含有Kan和Rif的YEB液體培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)48 h，菌落PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示有目的片段，表明已得到含有4×35s Enhancer DNA片段的Gv3101工程菌，可以用于愈傷組織的侵染。圖2，3

M：DL15000 marker；1:pCAMBIA2301；2：4×35s Enhancer；3：EcoRI和SacI順序酶切結(jié)果

M：DL15000 marker；1: pCAMBIA2301；-：4×35s Enhancer；3：EcoRI andSacI enzyme digestion

圖2重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-35s的EcoRI和SacI順序酶切鑒定

Fig.2Recombinant plasmid pCAMBIA2301-35s byEcoRI

M：DL2000 marker；+:陽(yáng)性對(duì)照；-：陰性對(duì)照；1-8：菌落PCR

M：DL2000 marker；+:positivecontrol；-：negative control；1-8：PCR product of 8 transformedAgrobacteriumclons

圖3Gv3101工程菌菌落PCR擴(kuò)增

Fig.3PCR product of transformedAgrobacteriumclons

2.3農(nóng)桿菌介導(dǎo)甜瓜轉(zhuǎn)化及培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下培養(yǎng)卡拉克塞種子3～5 d獲得無(wú)菌苗，切取子葉中段接種于預(yù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d，經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后接種于MS培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3～5 d，共培養(yǎng)后的外植體置于篩選培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)，21 d左右外植體長(zhǎng)出從生芽，切取外植體上的從生芽并接種到不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，獲得再生苗，待再生苗長(zhǎng)至3～5 cm時(shí)，自其基部切下并轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基，生根。圖4

A：伽師瓜幼苗；B：預(yù)培養(yǎng)的外植體；C：農(nóng)桿菌侵染外植體；D：抗性愈傷組織預(yù)分化；E：轉(zhuǎn)化植株幼苗；F：轉(zhuǎn)化植株的生根練苗

A：Jiashi melon seeding；B：explants of pre-culture；C：Agrobacteriumtumef aciens infected explants ；D：pre-differentiation of resistant callus；E：seeding of transgenic plants；F：rooting and strengthening of transformed plantlets

圖4甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程

Fig.4The process of genetic transformation in melon

2.4轉(zhuǎn)基因甜瓜苗的PCR鑒定

研究共獲得3株正常生長(zhǎng)的陽(yáng)性植株，用目的基因的引物對(duì)篩選出的T0代轉(zhuǎn)基因甜瓜幼苗進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。結(jié)果表明，有3 株轉(zhuǎn)化苗可擴(kuò)增出與目的片段大小一致的目的條帶，初步表明4×35s Enhancer DNA片段已轉(zhuǎn)入甜瓜基因組中。圖5

M：DL2000 marker；-：陰性對(duì)照；1-4：4株轉(zhuǎn)化苗PCR結(jié)果

M：DL2000 marker；-：negative control；1-4：PCR product of 4 transgenic melons

圖5轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.5The PCR results of the transgenic plants

3討 論

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)甜瓜的轉(zhuǎn)化和組織培養(yǎng)過(guò)程中必須保證全程無(wú)其他雜菌，因此需要做好種子消毒工作。甜瓜種子帶有內(nèi)生菌，消毒不徹底會(huì)使再生苗受到污染而不能使用，經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)放置時(shí)間較久的種子帶有的內(nèi)生菌較多，因此，應(yīng)選擇當(dāng)年獲得的種子作為合適的實(shí)驗(yàn)材料[20]。

激活標(biāo)簽法是引入增強(qiáng)子或強(qiáng)啟動(dòng)子，通過(guò)改變臨近基因的表達(dá)模式與表達(dá)水平，使其過(guò)量表達(dá)或異時(shí)空表達(dá)，而產(chǎn)生功能獲得型突變，從而對(duì)該基因進(jìn)行分離和鑒定的方法[21]。構(gòu)建含4×35s Enhancer的激活標(biāo)簽載體，并插入到植物基因組中，附近的基因表達(dá)活性可能大大增強(qiáng)，這可用于擬南芥，甜瓜等植物突變體庫(kù)的創(chuàng)建和篩選。激活標(biāo)簽法在植物基因的分離、鑒定和植物基因功能的研究中發(fā)揮重要的作用。

4結(jié) 論

克隆了4×35s Enhancer目的片段，通過(guò)EcoRI和SacI順序酶切目的片段和載體pCAMBIA2301后，成功構(gòu)建了激活標(biāo)簽載體pCAMBIA2301-35s，用于甜瓜的遺傳轉(zhuǎn)化。通過(guò)農(nóng)桿菌侵染甜瓜愈傷組織，進(jìn)行甜瓜的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得甜瓜T-DNA插入突變體，經(jīng)PCR檢測(cè)，初步證明4×35s Enhancer已導(dǎo)入甜瓜基因組中。待甜瓜轉(zhuǎn)基因幼苗成長(zhǎng)并在當(dāng)代產(chǎn)生顯性突變，后通過(guò)基因定位技術(shù)確定基因的位置，確定該基因的功能，為發(fā)掘和利用甜瓜優(yōu)良基因奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)(References)

[1] 蘇芳,郭紹貴,宮國(guó)義,等.甜瓜基因組學(xué)研究進(jìn)展[J].分子植物育種,2007,(4):540-547.

SU Fang,GUO Shao-gui, GONG Guo-yi, et al.(2007).Progress in Research on Melon Genomics [J].MolecularPlantBreeding, (4): 540-547. (in Chinese)

[2] 王賢磊.甜瓜遺傳圖譜的構(gòu)建與抗病基因遺傳分析[D].烏魯木齊：新疆大學(xué)博士論文,2011.

WANG Xian-lei.(2011).GeneticMapConstructionandDiseaseResistanceGeneAnalysisofCucumisMeloL.[D]. PhD Dissertation. Xinjiang University, Urumqi. (in Chinese)

[3] 馬榮良.西班牙科學(xué)家完成甜瓜基因組測(cè)序[N].中國(guó)食品安全報(bào), 2012.

MA Rong-liang.(2012).Spanish Scientists Completed Melon Genome Sequencing [N].ChniaFoodSafetyNews,(in Chinese)

[4] Hayashi, H., Czaja, I., Lubenow, H., Schell, J., & Walden, R. (1992). Activation of a plant gene by t-dna tagging: auxin-independent growth in vitro.Science, 258(5086):1,350-1,353.

[5] 關(guān)艷龍,李婉莎,殷奎德,等.激活標(biāo)簽法構(gòu)建擬南芥突變體庫(kù)及其表型分析[J].植物分類(lèi)與資源學(xué)報(bào),2010,32(1):53-59.

GUAN Yan-Long, LI Wan-sha, YIN Kui-de, et al.(2010).Constructing and Phenotypic Analyzing an Activation Tagging Arabidopsis Mutant Pool [J].PlantDiversityandResources, 32(1):53-59. (in Chinese)

[6] 陳志輝. 水稻T-DNA插入突變體庫(kù)構(gòu)建與利用及miRNA基因功能研究 [D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文,2015.

CHEN Zhi-hui.(2015).GenerationandUtilizationofRiceT-DNAInsertionalMutantLibraryandFunctionStudiesofmiRNAGenes[D]. PhD Dissertation. Huazhong Agricultural University，Wuhan . (in Chinese)

[7] 楊作仁. 棉花T-DNA激活標(biāo)簽突變體pag1分子機(jī)制的研究與應(yīng)用 [D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2014.

YANG Zuo-ren. (2014).ThemolecularmechanismofaT-DNAactivating-taggedcottonmutantanditsapplication[D]. PhD Dissertation. Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing. (in Chinese)

[8] 黃琪,鄭香峰,馬忠?guī)r,等.激活標(biāo)簽法初步構(gòu)建甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)突變體庫(kù)[C]//.2013全國(guó)植物生物學(xué)大會(huì)論文集.2013.

HUANG Qi, ZHENG Xiang-feng, MA Zhong-yan, et al. (2013).PreliminaryConstructiontheMutantPoolwithActivatorTagApproachinBrassicanapus[C]//. National Congress of Plant Biology, NCPB-2013. (in Chinese)

[9] 蘇彩霞,李君明,霍秀文.激活標(biāo)簽法及其在番茄功能基因組的應(yīng)用[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2007,(8):172-176.

SU Cai-xia, LI Jun-ming, HUO Xiu-wen.( 2007). Activation Tagging and Its Application in Tomato Functional Genomics [J].ActaAgriculturaeBoreali-Sinica, (8):172-176. (in Chinese)

[10] Zubko, E., Adams, C. J., Macháèková, I., Malbeck, J., Scollan, C., & Meyer, P. (2002). Activation tagging identifies a gene from petunia hybrida, responsible for the production of active cytokinins in plants.PlantJournal, 29(6):797-808.

[11] Graaff, E. V D, Dulk-Ras, A. D., Hooykaas, P. J., et al.( 2000) . Activation tagging of the LEAFY PETIOLE gene affects leaf petiole development in Arabidopsis thaliana.Development, 127(22):4,971-4,980.

[12] Huang S, Sm. B D B, Re. C. (2001). Cloning of an Arabidopsis patatin-like gene, STURDY, by activation T-DNA tagging.PlantPhysiology, 125(2):573-584

[13] Suzuki, T., Itoh, K., Hagiwara, T., Nakayama, H., Honjyo, K., & Hirota, Y., et al. (2000). Activation tagging of the floral inducer FT.CurrentMicrobiology, 286(5446):1,962.

[14] Borevitz, J. O., Xia Y, Blount. J., Dixon，R. A., Lamb, C. (2001). Activation Tagging Identifies a Conserved MYB Regulator of Phenylpropanoid Biosynthesis [J].PlantCell, 12(12):2,383-2,394.

[15] Henz, S. (2006). A role for flavin-containing monooxygenases in auxin biosynthesis. Science, (291):306-309.

[16] Tani H, Chen X, Nurmberg, P., Nurmberg, P., Grant,t J. J., & Santamaria, M.(2004). Activation tagging in plants: a tool for gene discovery.Functional&IntegrativeGenomics, 4(4):258-266.

[17] 宋燕妮,杜黎黎,王學(xué)征,等.甜瓜突變體庫(kù)的構(gòu)建M2群體表型變異的研究[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào),2015,(6):1 338-1 344.

SONG Yan-ni, DU Li-li, WANG Xue-zheng, et al.(2015).Construction of Mutant Library and Research on Phenotypic Variation of Me Population in Melon [J].JournalofPlantGeneticResources, (6):1,338-1,344. (in Chinese)

[18] 張邊江,陳全戰(zhàn).質(zhì)粒導(dǎo)人不同種農(nóng)桿菌凍融法的探討[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2007, 46(3):329-331.

ZHANG Bian-jiang, CHEN Quan-zhan. (2007). Study on the Freeze- thaw Method of Transforming Plasmid DNA into Two Different Agrobacterium tumefaciens [J].HubeiAgriculturalSciences, 46(3): 329-331. (in Chinese)

[19] 陸璐,趙長(zhǎng)增,陶興林.從甜瓜子葉中提取總DNA[J].果樹(shù)學(xué)報(bào),2005, 22(6):748-750.

LU Lu, ZHAO Chang-zeng, TAO Xing-lin. (2005). Extraction of total DNA from cotyledons of melon (CucumismeloL.) [J].JournalofFruitScience, 22(6): 748-750. (in Chinese)

[20] 張鐵剛,寧雪飛,王賢磊,等.新疆甜瓜"皇后"再生體系的建立[J].北方園藝,2012,(15):122-125.

ZHANG Tie-gang, NING Xue-fei, WANG Xian-lei, et al.(2012). Comparison of Three Optimized Method for Isolating Total RNA from Grapevine Tissues [J].NorthernHorticulture, (15):122-125. (in Chinese)

[21] 鄭繼剛,李成梅,肖英華,等.激活標(biāo)簽法及其在植物基因工程上的應(yīng)用[J].遺傳,2003, 25(4):471-474.

ZHENG Ji-gang, Ll Cheng-mei, XIAO Ying-hua, et al. (2003). Activation Tagging and the Application in Plant Genetic Engineering [J].Heredity, 25(4):471-474. (in Chinese)

Fund project:Supported by national college students innovation and entrepreneurship training project and NSFC (Grant No.3126025)

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.06.010

收稿日期(Received)：2016-02-26

基金項(xiàng)目:國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)實(shí)訓(xùn)項(xiàng)目；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(3126025)

作者簡(jiǎn)介:許榮華(1994-)，女，重慶人，本科，研究方向?yàn)橹参锷砩c分子生物學(xué)，(E-mail)952138547@qq.com 通訊作者(Cotresponding author):李冠(1949-)，男，湖北人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参锷砩c分子生物學(xué),(E-mail)guanli@xju.edu.cn

中圖分類(lèi)號(hào)：S652

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-4330(2016)06-1048-06

The Construction of T-DNA Insertional Mutants in Melons

XU Rong-hua, JIANG Lu, NING Xue-fei, LI Guan

(CollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China)

Abstract：【Objective】 In order to gain the T-DNA insertional mutants in melons and provide references for further research on the functional genetics of melons, the activation tagging carrier was constructed and transformed into melons.【Method】The target DNA was amplified from Saussurea involucrate Kar. & Kir by PCR, after EcoR I and Sac I digestion, the target enhancer was sub-cloned to pCAMBIA2301 vector. The activation tagging carrier was constructed. And the vector was transformed into the callus of Jiashi melons by using Agrobacterium tumefaciens. T-DNA insertional mutants were obtained.【Result】There were three regenerative plants that were transgenic plants identified by Kanamycin(Kan)screening and PCR.【Conclusion】The T-DNA insertional mutants were obtained, and the transgenic melons are likely to be used for the discovery of melon important trait gene.

Key words:melon； activation tagging；T-DNA insertional mutants