大花三色堇FPNI—PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

李婧++曾媛++龔勝

摘要：融合引物與巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（fusion primer and nested integrated PCR，F(xiàn)PNI-PCR）是一種分離并擴(kuò)增已知序列旁未知序列的有效方法。以大花三色堇（Viola×wittrockiana Gams.）為材料，為提高FPNI-PCR產(chǎn)物特異性，增加條帶清晰度，降低非特異性條帶的干擾，對FPNI-PCR反應(yīng)體系中第1輪的模板DNA濃度進(jìn)行對比，優(yōu)化了第3輪反應(yīng)中引物濃度、Taq DNA 聚合酶濃度、緩沖液用量，篩選了第3輪特異性引物的退火溫度，進(jìn)一步完善了FPNI-PCR反應(yīng)體系。各因素優(yōu)化比對試驗(yàn)表明：FPNI-PCR第1輪反應(yīng)體系應(yīng)以稀釋后的DNA為模板，20 μL體系中，用量在4.5～10 ng。第3輪最優(yōu)反應(yīng)體系為：20 μL反應(yīng)體系中，特異性引物濃度0.2 μmol/L，引物SP2濃度 0.75 μmol/L，Taq DNA酶用量1.0 U，dNTP用量2 μL，10×buffer（20 mmol/L，Mg2+ plus）用量2 μL，模板1 μL（第2輪反應(yīng)稀釋100倍后取1 μL為模板），ddH2O補(bǔ)足。第3輪反應(yīng)中，退火溫度為64 ℃或66 ℃時(shí)條帶最為清晰。

關(guān)鍵詞：大花三色堇；FPNI-PCR；體系優(yōu)化

中圖分類號(hào)： Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

融合引物與巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（fusion primer and nested integrated PCR，F(xiàn)PNI-PCR）是一種基于熱不對稱交錯(cuò)PCR （thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR）技術(shù)原理的PCR方法[1]，主要是利用目標(biāo)序列旁的已知序列設(shè)計(jì)3 個(gè)嵌套特異性引物，與給出的9個(gè)特殊設(shè)計(jì)的隨機(jī)簡并引物（arbitrary degenerate prime，AD）相結(jié)合，進(jìn)行1次巢式反應(yīng)，并在簡并引物的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)2個(gè)嵌套的特殊引物替換第1輪PCR所用隨機(jī)引物用于第2、3輪的擴(kuò)增。FPNI-PCR中融合引物（fusion primer），即特殊設(shè)計(jì)的隨機(jī)簡并引物，由3′端的隨機(jī)寡核苷酸（arbitrary degenerate oligonucleotides）和5′端可設(shè)計(jì)特異引物的一段序列組成，該序列用以替換初次PCR所用簡并引物。經(jīng)過熱不對稱循環(huán)后的產(chǎn)物含有特異引物結(jié)合位點(diǎn)，能有效降低產(chǎn)物稀釋后非特異性擴(kuò)增的影響[2]。FPNI-PCR具有高效靈敏、產(chǎn)物特異性高、重復(fù)性好、能夠在較短的時(shí)間內(nèi)獲得目標(biāo)片段等優(yōu)點(diǎn)，是擴(kuò)增基因側(cè)翼序列特別是啟動(dòng)子的有效方法[3]。

FPNI-PCR與TAIL-PCR技術(shù)類似，其反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性、可重復(fù)性明顯受到反應(yīng)體系模板、引物、Taq DNA 聚合酶、Buffer以及3輪退火溫度等因素的影響[4]。在進(jìn)行 FPNI-PCR 反應(yīng)獲取未知序列時(shí)，有必要根據(jù)上述因素，對不同因素進(jìn)行優(yōu)化組合，以獲得最優(yōu)的反應(yīng)結(jié)果。

大花三色堇（Viola×wittrockiana Gams.）是重要的冬春季花卉，有著十分豐富的花色和花斑類型，是研究植物花斑形成的理想植物[5]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室先前的研究表明，二氫黃酮醇還原酶（dihydroflavonol reductase，DFR）和花青素合成酶 （anthocyanidin synthase，ANS）基因是三色堇花斑由無色轉(zhuǎn)向著色的關(guān)鍵性基因[6]。關(guān)于DFR和ANS的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，其啟動(dòng)子中含有的眾多調(diào)控元件，與花色素調(diào)控密切相關(guān)[7-9]。因而這2個(gè)基因的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可能是花斑位置形成的一個(gè)關(guān)鍵性因素，其啟動(dòng)子的克隆，對于進(jìn)一步研究三色堇色斑的形成具有十分重要的意義。FPNI-PCR技術(shù)是克隆啟動(dòng)子序列的有效方法，而目前關(guān)于三色堇FPNI-PCR技術(shù)研究尚無相關(guān)報(bào)道，本研究以三色堇為材料，對其FPNI-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，為三色堇VwDFR和VwANS基因啟動(dòng)子的克隆提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

大花三色堇品種“賓哥”，花色為黃底黑斑，栽培于海南大學(xué)園藝園林學(xué)院基地。

1.2方法

1.2.1模板DNA的提取

提取三色堇幼葉DNA，步驟參考尚嘯等的改良CTAB法[10]，僅核酸分離時(shí)改用加1/10體積的5 mol/L NaAc。提取的DNA用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，電泳結(jié)果通過凝膠成像儀（Dolophin- Doc，美國）拍照，利用紫外分光光度計(jì)測濃度。小管分裝-20 ℃保存。

1.2.2試驗(yàn)中用到的引物包括FPNI-PCR反應(yīng)體系中的第1輪、第2輪、第3輪的簡并引物、特殊引物（表1）[1]以及根據(jù)VwANS基因設(shè)計(jì)的特異引物（表2）。

1.2.3FPNI-PCR體系的優(yōu)化（1）模板DNA濃度篩選。將提取的DNA稀釋100、200倍，然后將未稀釋的DNA和稀釋不同倍數(shù)的DNA作為第1輪PCR反應(yīng)的模板，反應(yīng)采用表1中的FP5、FP6、FP7、FP9這4條簡并引物，反應(yīng)程序見表3，反應(yīng)體系為20 μL，具體組分見參考文獻(xiàn)。

（2）FPNI-PCR反應(yīng)退火溫度的梯度篩選。根據(jù)設(shè)計(jì)的特異性引物GSP3的TM值，對第3輪退火溫度進(jìn)行梯度篩選，篩選溫度分別是62、64、66 ℃。

（3）引物、10×buffer（20 mmol/L，Mg2+ plus）、Taq DNA酶用量的對比。 PCR反應(yīng)采用20 μL反應(yīng)體系，分別對影響第3輪反應(yīng)體系中的主要參數(shù)：引物、10×buffer（Mg2+ plus）、Taq DNA酶，設(shè)置不同的濃度梯度，具體參數(shù)值見表3。此外，每20 μL反應(yīng)體系中均含有dNTP（2.5 mmol/L）2 μL、特異性引物0.2 μmol/L，模板為第2輪反應(yīng)產(chǎn)物稀釋100倍取1 μL，加ddH2O補(bǔ)足至20 μL。逐一優(yōu)化每個(gè)參數(shù)值，優(yōu)化時(shí)，其他參數(shù)值均采用表3所列反應(yīng)參數(shù)的第一水平值，引物采用參考文獻(xiàn)中的FP5、FP6、FP7、FP9這4條簡并引物 （表1），反應(yīng)程序見表4。

2結(jié)果與分析

2.1DNA的提取結(jié)果

以三色堇嫩葉為材料提取DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測，濃度為（0.901±0.019）μg/L，D260 nm/D280 nm介于1.8～2.0之間，說明樣品DNA中雜質(zhì)較少。0.8%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，點(diǎn)樣孔無滯留，條帶清晰明亮，無明顯拖尾現(xiàn)象，說明RNA等雜質(zhì)去除較干凈。結(jié)果表明，采用改良CTAB法可以有效地提取三色堇幼葉的DNA[10]，對于后續(xù)PCR反應(yīng)有利。

2.2DNA的濃度對FPNI-PCR的影響

模板DNA的用量對FPNI-PCR反應(yīng)有著非常直觀的影響，過多或者過少都會(huì)造成產(chǎn)物的不穩(wěn)定或者無法產(chǎn)生條帶。普通方法提取的DNA通常含有雜質(zhì)，而雜質(zhì)對PCR產(chǎn)物的影響是非常顯著的。為了獲得清晰條帶，降低非特異性擴(kuò)增，本試驗(yàn)以3個(gè)濃度的DNA為模板，利用FP5、FP7、FP9這3種簡并引物分別擴(kuò)增，其他條件相同，結(jié)果如圖2所示。

以未稀釋DNA為模板，3輪擴(kuò)增后均無清晰條帶（圖2）。將DNA模板分別稀釋100、200倍，隨著DNA稀釋倍數(shù)的增加，簡并引物FP5擴(kuò)增出的條帶數(shù)量明顯增加，且條帶清晰度明顯提升；簡并引物FP9擴(kuò)增的結(jié)果，100倍稀釋比200倍稀釋擴(kuò)增條帶數(shù)量更多、條帶更加清晰（圖2）。同時(shí)，7號(hào)引物在多個(gè)模板濃度下皆無明顯條帶，說明利用FPNI-PCR進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，模板的稀釋倍數(shù)應(yīng)配合不同的簡并引物進(jìn)行篩選，以期降低雜質(zhì)等對反應(yīng)的影響，才能獲得更為清晰的條帶。

2.3退火溫度對擴(kuò)增產(chǎn)物的影響

通過對5、7、9號(hào)引物擴(kuò)增反應(yīng)的第3輪擴(kuò)增的退火溫度進(jìn)行篩選，篩選溫度為62、64、66、68 ℃，結(jié)果見圖3?？傮w來看，64、66 ℃反應(yīng)效果更好，但是不同引物反應(yīng)的最佳退火溫度不同，如FP5引物64 ℃下擴(kuò)增效果較好，F(xiàn)P9號(hào)中超過700 bp 的條帶，在66 ℃下更清晰。

2.4Taq酶的用量對FPNI-PCR的影響

Taq酶在PCR反應(yīng)體系中用量少，卻極為重要，Taq酶的類型、用量，甚至是生產(chǎn)商，都會(huì)對PCR產(chǎn)物造成明顯的影響。在本研究中，分別對以FP6和FP7簡并引物擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行Taq酶的優(yōu)化，其他條件全部相同，結(jié)果如圖4所示。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Taq酶的用量對反應(yīng)條帶的數(shù)量和清晰度都有一定影響，隨著Taq酶用量的增加，F(xiàn)P6和FP7擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的量均有所提高，但FP6更為明顯，能獲得較為清晰的條帶，而FP7無明顯的清晰條帶。以簡并引物FP6擴(kuò)增，Taq酶用量1.5 U時(shí)比1.0 U時(shí)條帶亮度只略有提升，且非特異性擴(kuò)增也更為明顯，表明Taq酶用量1.0 U更為合適。

2.510×Taq buffer（Mg2+ plus）用量對FPNI-PCR的影響

分別以簡并引物FP6和FP7進(jìn)行擴(kuò)增，通過改變10×Taq buffer（Mg2+ plus）用量，其他條件均相同，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，以簡并引物FP6擴(kuò)增，3種緩沖液用量均獲得條帶，但用量為2 μL時(shí)，目的條帶更為清晰；以簡并引物FP7擴(kuò)增，緩沖液為1.5 μL時(shí)無條帶，由1.75 μL增至2 μL時(shí)，條帶數(shù)量增加，清晰度略有增加。

2.6引物濃度對FPNI-PCR的影響

以FP6和FP7這2種簡并引物擴(kuò)增，對第3輪引物SP2濃度進(jìn)行篩選。結(jié)果（圖6）顯示，引物濃度為0.25 μmol/L時(shí)，均無條帶，隨著引物濃度的上升，條帶數(shù)量、亮度明顯增加，非特異性擴(kuò)增同樣增加，條帶出現(xiàn)模糊現(xiàn)象。由圖6可知，以FP6和FP7為簡并引物擴(kuò)增，第3輪引物SP2濃度為0.75～1.0 μmol/L時(shí)，均有較好結(jié)果。但從節(jié)約成本、提高條帶清晰度、減少非特異性擴(kuò)增角度考慮，0.75 μmol/L時(shí)更佳。

3結(jié)論與討論

3.1結(jié)論

從試驗(yàn)結(jié)果來看，F(xiàn)PNI-PCR適合以低濃度DNA為模板，第1輪反應(yīng)以稀釋后的DNA為模板，20 μL體系中，用量在4.5～10 ng。對三色堇FPNI-PCR第3輪體系進(jìn)行優(yōu)化，最優(yōu)反應(yīng)體系是：20 μL反應(yīng)體系中，特異性引物濃度 0.2 μmol/L，引物SP2濃度0.75 μmol/L，Taq DNA酶用量10 U，dNTP用量2 μL，10×buffer（20 mmol/L，Mg2+ plus）用量2 μL，模板為第2輪反應(yīng)稀釋100倍后取1 μL，ddH2O補(bǔ)足。第3輪反應(yīng)經(jīng)溫度篩選，退火溫度64 ℃或66 ℃時(shí)條帶最佳。

3.2討論

FPNI-PCR是基于熱不對稱PCR技術(shù)原理的PCR方法，共包括3輪PCR反應(yīng)。其中，第1輪反應(yīng)中，含3次高嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)，目的是使高退火溫度的特異性引物SP1與模板序列退火延伸；1次低嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)，目的是使簡并引物結(jié)合到較多的目的序列上；5次熱不對稱的高低特異性循環(huán)交替反應(yīng)，使目的片段得以指數(shù)性擴(kuò)增。第2、3輪為普通PCR反應(yīng)，通過特異性嵌套引物進(jìn)一步擴(kuò)增目的條帶。它與普通TAIL-PCR的主要區(qū)別在于給出了經(jīng)過優(yōu)化后的一系列簡并引物，并在簡并引物的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了嵌套的特殊引物FSP1、FSP2用于第2、3輪的擴(kuò)增[2]。特異性嵌套引物的存在，使非目的條帶得不到大量擴(kuò)增，而非目標(biāo)序列中的發(fā)卡結(jié)構(gòu)也能抑制其擴(kuò)增，從而提高了目的片段擴(kuò)增的準(zhǔn)確性[11]。

由于FPNI-PCR反應(yīng)步驟較多，因此影響擴(kuò)增結(jié)果的因素也較多。首先，第1輪的高低嚴(yán)謹(jǐn)熱不對稱反應(yīng)是目標(biāo)片段擴(kuò)增的最初環(huán)節(jié)，而本試驗(yàn)證明，模板濃度是影響第1輪反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵因素。在研究中發(fā)現(xiàn)，低濃度的DNA模板更容易獲得擴(kuò)增結(jié)果，且模板DNA的稀釋倍數(shù)對不同簡并引物擴(kuò)增的影響不同。在其他PCR反應(yīng)的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，植物DNA模板的濃度對于目的片段的擴(kuò)增具有很大的影響[12]。在TAIL-PCR中，通常需要對模板進(jìn)行稀釋，才能獲得較為清晰的條帶[4，13]。原因可能是DNA中所含雜質(zhì)的影響，未稀釋的高濃度DNA中所含雜質(zhì)更多，影響條帶擴(kuò)增，另外，不同簡并引物對模板的濃度要求也可能不同，所適應(yīng)的模板濃度存在差異。

在FPNI-PCR反應(yīng)中，第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物因條帶雜、濃度低，往往無法通過凝膠成像顯示，需要通過第2輪對目標(biāo)條帶的進(jìn)一步擴(kuò)增獲得初步結(jié)果。通過第2輪產(chǎn)物凝膠成像，以有條帶的第2輪稀釋產(chǎn)物為模板，通過第3輪反應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)增，以期獲得較第2輪更為清晰的條帶。因此，第3輪反應(yīng)體系的優(yōu)化對最終結(jié)果的獲得具有重要作用。

本研究中，針對第3輪PCR反應(yīng)中部分因素進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與buffer（Mg2+ plus）、Taq DNA酶用量相比，引物的濃度影響最為顯著，隨著引物濃度的上升，條帶數(shù)量、亮度明顯增加。需要注意的是，較高的引物濃度雖有利于擴(kuò)增，但會(huì)造成條帶模糊、非特異性條帶增加，這與其他PCR反應(yīng)類似[14]，不利于與第2輪條帶比對推測目的條帶。雖然 FPNI-PCR中融合引物特殊且相對較短，有利于與DNA模板結(jié)合擴(kuò)增目的條帶，但經(jīng)過3輪反應(yīng)雖然在一定程度上降低了非特異條帶的干擾，但雜條帶的影響仍是影響試驗(yàn)結(jié)果的重要原因[15]。因此，在第3輪反應(yīng)中選出最適當(dāng)?shù)囊餄舛?，具有十分重要的作用。含Mg2+ 的buffer緩沖液主要對引物和模板的退火、Taq DNA酶的穩(wěn)定起作用，當(dāng)緩沖液低于一定限度不能產(chǎn)生條帶，但用量過多也會(huì)使dNTP過量結(jié)合，非特異性條帶增加，不利于反應(yīng)[16-17]。與緩沖液相對應(yīng)，Taq DNA酶用量的多少，同樣對PCR反應(yīng)存在直接影響，不同的Taq酶需要配合相應(yīng)的緩沖液使用，過少無法產(chǎn)生條帶，過多也會(huì)造成非特異性擴(kuò)增[18-19]。在本試驗(yàn)中，較高的buffer濃度和Taq DNA酶均有利于擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)中除各因素外，退火溫度對目的條帶的獲取同樣具有重要作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，對熱不對稱PCR第3輪反應(yīng)退火溫度的優(yōu)化，能有效地促進(jìn)目的片段的富集[20]。本試驗(yàn)第3輪PCR反應(yīng)中，特異性引物的Tm值為65 ℃，通過溫度篩選得出，退火溫度為64 ℃或66 ℃時(shí)，條帶更為清晰。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，在FPNI-PCR中通過優(yōu)化反應(yīng)體系中各因素的濃度或用量，篩選3輪PCR的退火溫度，均能有效地增加目的條帶的清晰度，減少非特異性擴(kuò)增，為后續(xù)研究打下良好基礎(chǔ)，為其他物種基因啟動(dòng)子的研究提供一定的借鑒作用。

[HS2*2][HT8.5H]參考文獻(xiàn)：[HT8.SS]

[ZK（#]Wang Z，Ye S F，Li J J，et al. Fusion primer and nested integrated PCR （FPNI-PCR）：a new high-efficiency strategy for rapid chromosome walking or flanking sequence cloning[J]. BMC Biotechnology，2011，11（1）：16697-16702.

[2]李昆鵬，朱化彬，郝海生，等. 基于PCR方法的基因序列全長獲取策略[J]. 中國生物工程雜志，2012，32（11）：115-123.

[3]方子義. 蠟梅查爾酮合成酶基因（CHS）啟動(dòng)子及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的克隆與功能分析[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[4]鄭岑，張立平，唐忠輝，等. TAIL-PCR技術(shù)及其在植物基因中的克隆[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28（3）：544-548.

[5]張其生，包滿珠，盧興霞，等. 大花三色堇育種研究進(jìn)展[J]. 植物學(xué)報(bào)，2010，45（1）：128-133.

[6]李琴. 三色堇花色素合成結(jié)構(gòu)基因的克隆與表達(dá)差異分析[D]. ?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)，2013.

[7]唐杏姣，韓科廳，胡可，等. 菊花CmDFR與CmANS基因啟動(dòng)子序列克隆與瞬時(shí)表達(dá)分析[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2012，28（5）：81-88.

[8]Dong W，You Y X，Niu L L，et al. Isolation and analysis of the promoter of an anthocyanin synthase gene from purple-fleshed sweet potato tubers[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2014，36（10）：2637-2649.

[9]Gollop R，Even S，Colova-Tsolova V，et al. Expression of the grape dihydroflavonol reductase gene and analysis of its promoter region[J]. Journal of Experimental Botany，2002，53（373）：1397-1409.

[10][ZK（#]尚嘯，王健，龔勝，等. 三色堇葉片DNA不同提取方法比較[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（20）：4999-5002.

[11]劉慧，劉貫山，劉峰，等. 煙草T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列擴(kuò)增方法的篩選與優(yōu)化[J]. 中國煙草科學(xué)，2014，35（1）：96-101，107.

[12]李宗菊，熊麗，桂敏，等. 非洲菊基因組DNA提取及[ISSR-PCR擴(kuò)增模板濃度優(yōu)化[J]. 云南植物研究，2004，26（4）：439-444.

[13]羅靜瑤，陳云云，謝俊，等. TAIL-PCR的技術(shù)改良及對香蕉[WTBX][STBX]NBS-RGC5[WTBZ][STBZ]基因側(cè)翼序列的克隆[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，40（10）：143-145，170.

[14]劉陽，楊淑霞，李敏惠，等. 引物濃度與退火溫度不當(dāng)導(dǎo)致巢式PCR非特異性擴(kuò)增[J]. 成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，3（2）：111-114.

[15]胡丹. 月季“月月紅”酵母單雜交cDNA文庫及RrMYB7誘餌載體的構(gòu)建[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[16]Liu X D，Zheng D，Zhou Y N，et al. Restriction endonucleases digesting DNA in PCR buffer[J]. Journal of Forestry Research，2005，16（1）：58-60，85-86.

[17]王云，秦偉，王永豐. 新疆野蘋果S基因特異性PCR體系優(yōu)化[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，50（11）：2023-2030.

[18]李謀強(qiáng)，師桂英，葉樹輝，等. ‘蘭州百合ISSR-PCR體系的優(yōu)化[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，49（6）：76-81.

[19]周雨晴，杜沛霖，傅鵬，等. 青天葵ISSR-PCR體系優(yōu)化及引物篩選[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（21）：95-99.

[20]陳軍營，沈向磊，辛玉茹，等. 改良TAIL-PCR技術(shù)在小麥PM H+-ATPase基因啟動(dòng)子克隆中的應(yīng)用[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，42（1）：1-5.