刺絡(luò)瀉血對(duì)原發(fā)性肝癌大鼠血清AFP、SF的影響

吳　云　趙慧玲　劉新燕　魏　珂　陳子晨　譚　麗　戰(zhàn)慧敏

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京，100029； 2 豐臺(tái)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京,100072)

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實(shí)驗(yàn)研究

刺絡(luò)瀉血對(duì)原發(fā)性肝癌大鼠血清AFP、SF的影響

吳云1趙慧玲1劉新燕1魏珂2陳子晨1譚麗1戰(zhàn)慧敏1

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京，100029； 2 豐臺(tái)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京,100072)

摘要目的：觀察刺絡(luò)瀉血對(duì)原發(fā)性肝癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)模型大鼠甲胎蛋白(Alpha-Fetoprotein，AFP)、鐵蛋白(Serum Ferritsn，SF)及肝功能相關(guān)指標(biāo)的影響，探究刺絡(luò)瀉血對(duì)HCC的預(yù)防作用及相關(guān)機(jī)制。方法：將40只健康Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(10只)、模型組(15只)、刺血預(yù)防組(15只)。除正常對(duì)照組外，其余兩組均采用二乙基亞硝胺(Diethylnitrosamine，DEN)腹腔注射建立HCC模型，刺血預(yù)防組在造模開(kāi)始同時(shí)取肝經(jīng)淺表絡(luò)脈刺血，0.5 mL/次，2次/周，至13周。第13周末，腹主動(dòng)脈取血5 mL，采用ELESA法測(cè)定3組大鼠血清肝功能丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alamine Aminotransferase，ALT)、堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(Gamma Glutamyl Transpeptidase，GGT)和腫瘤標(biāo)志物AFP、SF含量。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清ALT、ALP、GGT、AFP、SF含量均明顯升高(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，刺血預(yù)防組大鼠血清ALT、ALP、GGT、AFP、SF含量均降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：刺絡(luò)瀉血療法對(duì)HCC的發(fā)展有一定程度的抑制作用，其作用機(jī)制可能與降低血清肝功能指標(biāo)，保護(hù)肝臟，下調(diào)腫瘤標(biāo)志物AFP、SF水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞刺絡(luò)瀉血；原發(fā)性肝癌；甲胎蛋白；鐵蛋白；大鼠

原發(fā)性肝癌是指肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞發(fā)生的癌腫，該病一般起病隱匿，發(fā)展迅速，且致死率高，因此有“癌中之王”之稱(chēng)[1]。目前臨床上針對(duì)HCC的治療西醫(yī)主要采用手術(shù)切除或放、化療法，價(jià)格昂貴且不良反應(yīng)較大，近年來(lái)研究顯示，中醫(yī)針灸在防治HCC方面有很好的療效[2-5]。刺絡(luò)瀉血作為針灸療法的一種，系通過(guò)三棱針或其他針具刺破人體血絡(luò)或腧穴，放出適量血液，以治療或防治疾病的方法，擁有上千年歷史，近年來(lái)在肝病防治方面，取得了一定進(jìn)展，日益受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。

研究表明[6]，刺絡(luò)瀉血療法具有祛瘀生新、清熱解毒、消癥散結(jié)等作用，可以有效降低血清肝功及肝纖四樣的含量，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞凋亡，防治肝纖維化，而肝纖維化是肝癌癌前病變[7]，本研究擬建立DEN誘發(fā)大鼠肝癌模型，觀察肝經(jīng)淺表絡(luò)脈刺血對(duì)肝功ALT、AST、GGT，及腫瘤標(biāo)志物AFP、SF的影響，初步探究刺絡(luò)瀉血對(duì)HCC的預(yù)防作用及相關(guān)機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組清潔級(jí)雄性Wistar大鼠40只，體重(200±10)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。許可證號(hào):SCXK(京)2012-0001。于室溫22 ℃，相對(duì)濕度45 %清潔條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，采用隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分為3組，即A.正常對(duì)照組10只；B.模型組15只；C.刺血預(yù)防組15只，實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)相關(guān)規(guī)定。

1.2主要試劑DEN(美國(guó)Sigma公司，批號(hào):Sigma-N0756)；ALT、ALP、GGT測(cè)定試劑盒(北京環(huán)宇金科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)；10%水合氯醛(北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室配制)；4%多聚甲醛溶液(北京百諾威生物科技有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1造模方法采用改良型DEN誘導(dǎo)的原發(fā)性肝癌大鼠模型[8]，將劑量為50 mg/kg的DEN溶于100 mg/kg生理鹽水中，配置成濃度為50.00 mg/kg的溶液，每次腹腔注射前進(jìn)行大鼠體重測(cè)量，以確定注射量，2次/周，每次間隔3～4 d(約84 h)，連續(xù)4周后改為1次/周，以保證大鼠生存率，連續(xù)13周誘癌成功。造模成功指征：造模大鼠出現(xiàn)精神萎靡，毛發(fā)黃，體重減輕，鼻腔出血、貧血、尿血、腸脹氣、腹水等并發(fā)癥，解剖肉眼觀察肝臟形態(tài)出現(xiàn)質(zhì)地變硬，萎縮變小，表面出現(xiàn)大小不一的結(jié)節(jié)；肝臟組織病理切片顯示肝細(xì)胞深染、細(xì)胞核多形、腫瘤灶誘導(dǎo)形成。

1.3.2干預(yù)方法刺血預(yù)防組在造模開(kāi)始同時(shí)，取后肢肝經(jīng)淺表絡(luò)脈刺血，75%乙醇消毒。持針?lè)ǎ耗?、食指持針，中指抵住針尖上方，一是控制針刺方向，二是控制針刺深度；進(jìn)針?lè)ǎ盒√?hào)三棱針直刺進(jìn)針，迅速出針，以出血為度；出血量：少量，兩穴總計(jì)0.5 mL，3次/周。模型組腹腔注射DEN，正常組同一部位注射生理鹽水，3組予相同時(shí)間相同方法抓取固定。

1.3.3標(biāo)本采集與檢測(cè)13周后，各組大鼠禁食、不禁水12 h，10 %水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血5 mL，靜置離心(4 ℃，3 500 r/min，10 min)后取上層血清送肝功及相關(guān)腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)檢測(cè)，采用ELISA法測(cè)定。脫頸、開(kāi)腹，觀察記錄各組肝臟的形態(tài)、顏色、質(zhì)地。取肝組織用4%多聚甲醛緩沖液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色。

2結(jié)果

2.1各組大鼠血清肝功能ALT、ALP、GGT比較與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清ALT、ALP、GGT含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，刺血預(yù)防組大鼠血清ALT、ALP、GGT含量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠血清肝功能指標(biāo)比較±s)

注:與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

圖1　各組大鼠血清肝功能指標(biāo)比較

2.2各組大鼠血清腫瘤標(biāo)志物AFP、SF比較與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清AFP、SF含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，刺血預(yù)防組大鼠血清AFP、SF含量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

3討論

中醫(yī)以辨證論治為核心，是目前治療HCC的重要方法之一，將其與手術(shù)，放、化療有機(jī)結(jié)合，有助于減少放、化療的毒副反應(yīng)，穩(wěn)定病情，提高生存質(zhì)量。此外，中醫(yī)提倡未病先防，既病防變，其重在調(diào)體，在癌癥的預(yù)防和抗復(fù)發(fā)方面優(yōu)勢(shì)亦顯著。HCC可歸屬于中醫(yī)“脅痛、積聚、鼓脹”等范疇，其基本病理變化為正氣不足，氣滯、血瘀、痰結(jié)、濕聚、熱毒等相互膠著，日久漸積成塊。而“久病必瘀”，瘀血貫穿肝癌發(fā)病始終，本虛標(biāo)實(shí)是其基本病機(jī)[9]。張從正認(rèn)為：“出血者，乃所以養(yǎng)血也”，瀉血即為扶正，瘀血不除，新血難生，刺血療法可以祛瘀生新,祛邪扶正，正好針對(duì)原發(fā)性肝癌的病因病機(jī)。

表2　各組大鼠血清腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)比較±s)

注:與正常對(duì)照組比較,**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

圖2　各組大鼠血清腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)比較

按照世界衛(wèi)生組織關(guān)于疾病和有關(guān)健康問(wèn)題的國(guó)際統(tǒng)計(jì)分類(lèi)(ICD10)對(duì)疾病的分類(lèi)，發(fā)現(xiàn)刺血療法適宜病種共涉及18大類(lèi)系統(tǒng)，262個(gè)病種。其中包括“癥瘕”“積聚”，而原發(fā)性肝癌屬于中醫(yī)學(xué)“癥瘕”“積聚”范疇，所以可以認(rèn)為是刺血療法的適應(yīng)證之一。刺血治療腫瘤病，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》年代就有記載，《靈樞?九針論》曰：“八風(fēng)之客于經(jīng)絡(luò)之中，為瘤病者也，故為之治針，必甬其身而鋒其末，令可以瀉熱出血而癌病竭”。

AFP、SF等是當(dāng)前HCC實(shí)驗(yàn)室診斷常用指標(biāo)[10-11]，AFP被認(rèn)為是HCC診斷和預(yù)后的首選標(biāo)志物[12]。SF為第二肝癌腫瘤標(biāo)志物，特別是對(duì)AFP陰性者[13]。SF在肝臟合成，肝病肝細(xì)胞受損，清除SF障礙，或癌細(xì)胞合成SF量增加，均可導(dǎo)致血清SF高濃度表達(dá)[14-15]。本研究結(jié)果顯示，相較正常對(duì)照組，模型組與預(yù)防組大鼠AFP、SF含量均有不同程度升高，說(shuō)明兩組大鼠肝臟都存在不同程度的惡變；但與模型組比較，刺血預(yù)防組AFP、SF水平均顯著降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示刺絡(luò)瀉血在一定程度上起到了有效減輕并預(yù)防肝癌發(fā)生發(fā)展的作用，其機(jī)制可能與降低AFP、SF含量，祛瘀生新，促使癌毒及代謝產(chǎn)物排泄有關(guān)。ALT、ALP、GGT最能反映肝細(xì)胞受損程度，是目前最常用的肝功能指標(biāo),血清GGT主要來(lái)源于肝臟，具有癌胚蛋白的性質(zhì)，與AFP聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HCC早期診斷具有較高的準(zhǔn)確性[16-17]。本實(shí)驗(yàn)采用幾項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)方法，可有效提高診斷靈敏度，減少單一檢測(cè)漏診率。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，刺絡(luò)放血可使瘀滯在局部的病理性產(chǎn)物得以清除，改善微循環(huán)障礙，保護(hù)肝臟，提高機(jī)體免疫力，緩解疼痛[18]。田葉紅[19]等采用刺血拔罐治療癌性不全性腸梗阻21例，有效率達(dá)71.4%。本研究結(jié)果也顯示刺絡(luò)瀉血療法可使侵入機(jī)體的毒邪隨血排出，通過(guò)祛瘀生新，理血調(diào)氣，調(diào)節(jié)臟腑功能，激發(fā)機(jī)體免疫力，從而抑制毒邪的擴(kuò)展與再生，一定程度上降低腫瘤標(biāo)志物相關(guān)指標(biāo)，保護(hù)肝臟，對(duì)HCC發(fā)生發(fā)展起到預(yù)防并延緩的作用。刺絡(luò)瀉血療法是一種天然針刺療法，因其“簡(jiǎn)、便、廉、驗(yàn)”的特點(diǎn)而應(yīng)用于臨床各個(gè)系統(tǒng)百余種疾病的防治和保健[20-22]，值得進(jìn)一步繼承和發(fā)展，但刺絡(luò)瀉血療法的操作方法缺乏統(tǒng)一規(guī)范，其作用機(jī)理仍待深入探討。

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(2015-12-05收稿責(zé)任編輯：張文婷)

Research on the Influence of Pricking Blood on Colleterals Therapy on Serum AFP and SF in the Rat Model of Primary Liver Cancer

Wu Yun1,Zhao Huiling1,Liu Xinyan1,Wei Ke2,Chen Zichen1,Tan Li1,Zhan Huimin1

(1SchoolofAcupuncture-MoxibustionandTuina,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China;2FengtaiIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicineHospital,Beijing100072,China)

AbstractObjective:To observe the effect of pricking blood on colleterals therapy on AFP and SF in rats model of primary liver cancer (HCC),and explore its preventive effect and related mechanism.Methods:Forty healthy Wistar rats were randomly divided into control group (n=10),model group (n=15) and pricking blood group (n=15).In addition to the control group,the other two groups were injected with DEN (Diethylnitrosamine) intraperitoneally to establish liver cancer model.Rats in pricking blood group was performed of blood letting on the superficial veins of hind leg along the liver meridian,0.5 mL each time and 2 times per week,till the eighteenth week.At the end of the week,taking 5 mL blood from the abdominal aorta and using ELESA method to determine ALT (Alamine Amino Transferase),ALP (Alkaline Phosphatase),GGT (Gamma Glutamyl Transpeptidase),AFP and SF levels in serum.Results:Compared with the control group,the serum levels of ALT,ALP,GGT,AFP and SF in model group were significantly increased,and the difference was statistically significant (P<0.05).Compared with the model group,the serum levels of ALT,ALP,GGT,AFP and SF in the prevention group were lower,and the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion:Blood pricking on colleterals therapy has inhibitory effect on HCC,which might due to the fact that it can decrease the liver serum levels and tumor signals AFP and SF.

Key WordsBlood pricking on colleterals therapy; Primary liver cancer; AFP; SF; Rats

作者簡(jiǎn)介:吳云(1988.11—)，女，碩士，北京中醫(yī)藥大學(xué)，研究方向：刺絡(luò)瀉血療法作用機(jī)理研究，E-mail：1002375051@qq.com 通信作者：趙慧玲(1957.7—)，女，主任醫(yī)師，教授，北京中醫(yī)藥大學(xué)，研究方向：刺絡(luò)瀉血療法的文獻(xiàn)、實(shí)驗(yàn)及臨床研究，E-mail：zhaohuiling3895@sohu.com

中圖分類(lèi)號(hào)：R245

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.06.032