魚(yú)用三聯(lián)口服疫苗的制備方法及其對(duì)大菱鲆的免疫效果

張振國(guó)，郝爽，李繼，羅璋，馮守明，吳會(huì)民，姜巨峰，孫志景

（1.天津市水產(chǎn)研究所，天津300221；2.天津市寶坻區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，天津301800）

?

魚(yú)用三聯(lián)口服疫苗的制備方法及其對(duì)大菱鲆的免疫效果

張振國(guó)1，郝爽1，李繼2，羅璋1，馮守明1，吳會(huì)民1，姜巨峰1，孫志景1

（1.天津市水產(chǎn)研究所，天津300221；2.天津市寶坻區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，天津301800）

摘要：為探究海水養(yǎng)殖中安全可靠、經(jīng)濟(jì)適用的疫苗接種方法，以藥用淀粉、麥芽糊精，以及經(jīng)0.5%甲醛滅活的溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、副溶血弧菌V.parahemolyticus和遲緩愛(ài)德華氏菌Edwardsiella tarda為主要原料，采用擠出-滾圓法制備魚(yú)用三聯(lián)口服疫苗，并用其對(duì)大菱鲆Scophthalmus maximus免疫，分別在免疫0、7、14、21、28 d時(shí)測(cè)定溶藻弧菌、副溶血性弧菌和遲緩愛(ài)德華氏菌特異性抗體，以1×109cfu/mL活菌 （3種菌液比例為1∶1∶1）進(jìn)行攻毒試驗(yàn)并計(jì)算免疫保護(hù)率。結(jié)果表明，藥用淀粉150 g、麥芽糊精50 g、菌液60 mL、擠出速度200 r/min、滾圓時(shí)間60 s時(shí)，為比較成熟的三聯(lián)口服疫苗制備工藝，用該疫苗免疫大菱鲆后，3種細(xì)菌的大菱鲆血清和后腸黏膜抗體效價(jià)均顯著高于對(duì)照組，且免疫保護(hù)率達(dá)50%以上。

關(guān)鍵詞：三聯(lián)口服疫苗；大菱鲆；免疫

目前，人工養(yǎng)殖海水魚(yú)細(xì)菌性疾病有逐年增加的趨勢(shì)，尤其是遲緩愛(ài)德華氏菌Edwardsiella tarda、溶藻弧菌 Vibrio alginolyticus和副溶血弧菌V.parahemolyticus的流行，使中國(guó)海水養(yǎng)殖業(yè)受到了嚴(yán)重影響。隨著高產(chǎn)、高效、集約化的新型養(yǎng)殖模式逐漸普及，細(xì)菌性疾病呈現(xiàn)出交叉感染、混合感染和多重感染的新特點(diǎn)，因此，一些學(xué)者進(jìn)行了二聯(lián)疫苗、三聯(lián)疫苗和多聯(lián)疫苗的相關(guān)研究，如用溶藻弧菌和鰻弧菌二聯(lián)疫苗免疫大菱鲆Scophthalmus maximus［1］，用河弧菌和嗜水氣單胞菌二聯(lián)疫苗免疫鯽［2］，用嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌三聯(lián)疫苗免疫大黃魚(yú)［3］。齊彩霞等［4］研發(fā)了針對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰細(xì)菌性疾病的三聯(lián)疫苗。目前，疫苗的接種大多采用浸泡或注射方法，采用浸泡接種方式疫苗用量大、免疫效果不佳，采用注射接種方式則工作量大、過(guò)程繁瑣、傷口易感染。而口服接種疫苗操作方便、不損傷魚(yú)體、費(fèi)用較低，適宜在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用，已成為魚(yú)用疫苗近年來(lái)的研究方向。為此，本研究中建立了溶藻弧菌、副溶血弧菌和遲緩愛(ài)德華氏菌三聯(lián)口服疫苗的制備方法，并對(duì)其免疫大菱鲆的效果進(jìn)行了初步研究，旨在為探求海水養(yǎng)殖中安全可靠、經(jīng)濟(jì)適用的疫苗接種方法提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)用溶藻弧菌、副溶血弧菌和遲緩愛(ài)德華氏菌由天津市水產(chǎn)研究所水生生物防治研究室分離鑒定。試驗(yàn)用大菱鲆幼魚(yú)購(gòu)自天津盛億養(yǎng)殖有限公司，共20尾，體質(zhì)量為30～40 g，體長(zhǎng)為15 cm。

主要儀器有HJ-400-P型微丸機(jī) （重慶榮凱機(jī)械制造有限公司）。主要試劑包括藥用淀粉 （遼寧東源藥業(yè)有限公司）、麥芽糊精 （西王藥業(yè)有限公司）、二甲基-β-丙酸噻亭 （DMPT，東營(yíng)百森有限公司）、丙烯酸樹(shù)脂 （EOBS60，天津愛(ài)勒易醫(yī)藥藥材有限公司）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 （天津市英博生化試劑有限公司）。

1.2方法

1.2.1全菌滅活疫苗的制備 將3株菌接種于LB

1.2.2三聯(lián)口服疫苗的制備

（1）微丸。以藥用淀粉為載體、麥芽糊精為黏合劑，經(jīng)0.5%甲醛滅活的3株菌菌液按照一定比例制成微濕軟材，采用擠出-滾圓法制備微丸。

（2）腸溶層包衣。將腸溶型包衣材料丙烯酸樹(shù)脂溶于90%的乙醇中，制備成一定濃度的懸濁液，并使用包衣機(jī)均勻噴涂于疫苗微丸表面。

（3）誘食劑的噴涂。將二甲基-β-丙酸噻亭（DMPT）溶于水中，制成一定濃度的溶液，并使用包衣機(jī)均勻噴涂于腸溶層表面。

1.2.3三聯(lián)口服疫苗的安全性評(píng)價(jià) 取100 μL全菌滅活苗涂布于普通培養(yǎng)基上，35℃下培養(yǎng)48 h后，觀察有無(wú)菌落長(zhǎng)出；取100 μL菌液 （1×109cfu/mL）注射到健康大菱鲆體內(nèi)，觀察記錄其1～7 d的死亡率。

1.2.4大菱鲆抗體效價(jià)和免疫保護(hù)率 水族箱小水體免疫大菱鲆試驗(yàn)，設(shè)對(duì)照組和口服免疫組?？诜庖呓M每天投喂疫苗2次，連續(xù)投喂2 d，然后投喂正常飼料；對(duì)照組投喂正常飼料。試驗(yàn)期間每7 d采血一次，從每組取4尾魚(yú)，采用ELISA法測(cè)定血清和后腸黏膜中的抗體平均水平。用含0.05%多聚賴(lài)氨酸的包被液在室溫下處理酶標(biāo)板1 h，再用低鹽洗液漂洗2次，加入100 μL抗原（1.0×108cfu/mL），4℃下過(guò)夜；加入 50 μL 0.05%戊二醛22℃下孵育20 min，用低鹽洗液漂洗3次；加入250 μL 1%牛血清白蛋白 （Sigma）22℃下封閉2 h，用低鹽洗液漂洗3次；加入100 μL樣品 （血清或后腸黏膜）4℃下過(guò)夜，用高鹽洗液漂洗5次，最后一次持續(xù)洗5 min；加入100 μL鼠抗大菱鲆Ig M單抗 （Aquatic Diagnostics Ltd）22℃下孵育1 h，漂洗過(guò)程同上一步；加入100 μL辣根過(guò)氧化物酶 （HRP）標(biāo)記的羊抗鼠 IgG （1/8000）22℃下孵育1 h，漂洗過(guò)程同上一步；加入100 μL TMB（四甲基聯(lián)苯胺）避光22℃下顯色5 min，加入50 μL終止反應(yīng)液；使用酶標(biāo)儀（ELX808）于波長(zhǎng)450 nm處讀數(shù)；在加樣品的同時(shí)設(shè)PBS為陰性對(duì)照，當(dāng)S/P≥2時(shí)判為陽(yáng)性 （S為樣品的OD值，P為陰性對(duì)照的OD值）。

免疫試驗(yàn)進(jìn)行28 d后，對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行3株細(xì)菌 （比例為1∶1∶1，菌液濃度為1×109cfu/mL）的人工感染，統(tǒng)計(jì)7 d內(nèi)魚(yú)的死亡率。免疫保護(hù)率 （RPS）計(jì)算公式為

2　結(jié)果與分析

2.1滅活疫苗的制備及安全性

遲緩愛(ài)德華氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌經(jīng)過(guò)0.5%福爾馬林滅活48 h，用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后無(wú)菌落生長(zhǎng)，注射健康大菱鲆7 d內(nèi)無(wú)發(fā)病，說(shuō)明已完全滅活。

2.2口服疫苗的制備工藝

根據(jù)趙偉等［6］的研究可知，影響微丸制備的因素主要有黏合劑糊精用量、水用量、滾圓機(jī)擠出速度、滾圓時(shí)間等。本研究中，根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，選擇150 g藥用淀粉進(jìn)行試驗(yàn)，選擇以上4個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平 （表1），按L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表安排試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1　因素和水平Tab.1 Factors and levels in preparation

以收率 （f）評(píng)價(jià)正交試驗(yàn)的結(jié)果，即f= （12-20）目干燥丸芯的質(zhì)量 （g）/總投料量（g）×100%。由表2可見(jiàn)，4個(gè)因素的極差依次為RA＞RD＞RB＞RC，即影響疫苗收率的主要因素是麥芽糊精用量，工藝因素對(duì)收率影響較小，試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)［6-7］報(bào)道的一致。由極差分析結(jié)果得出最佳制備工藝?yán)碚摻M合為A2B3C3D2，考慮到C1與C3所對(duì)應(yīng)的收率差異不大，且正交試驗(yàn)中A2B3C1D2組合 （6號(hào)試驗(yàn)）的收率最高，由此確定，本試驗(yàn)中最優(yōu)制備工藝條件為藥用淀粉150 g、麥芽糊精50 g、菌液60 mL、擠出速度200 r/min、滾圓時(shí)間60 s，在此工藝條件下，收率達(dá)78%。

2.3免疫效果評(píng)價(jià)

按照文獻(xiàn)［8］中的方法測(cè)定大菱鲆血清和后腸黏膜的抗體效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表3?？诜呙缃M大菱鲆血清和后腸黏膜中的遲緩愛(ài)德華氏菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌的特異性抗體效價(jià)均在14 d時(shí)達(dá)到最大值，抗體效價(jià)顯著高于對(duì)照組 （P＜0.05）。

攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，口服疫苗組攻毒試驗(yàn)7 d時(shí)死亡率遠(yuǎn)低于對(duì)照組，免疫保護(hù)率達(dá)到50%（表4）。說(shuō)明本試驗(yàn)中制備的魚(yú)用三聯(lián)口服疫苗可以有效提高大菱鲆對(duì)3種細(xì)菌的抵抗力。

表2　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Design and results in an orthogonal test

3　討論

3.1三聯(lián)口服疫苗的制備工藝

本試驗(yàn)中研制的三聯(lián)口服疫苗微丸，采用擠出-滾圓造粒法制備，該方法目前在制藥行業(yè)中應(yīng)用廣泛，但在水產(chǎn)疫苗研究方面尚未見(jiàn)報(bào)道。疫苗研制時(shí)，使用微丸機(jī)上不同的孔板擠壓制備成條狀，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)盤(pán)轉(zhuǎn)動(dòng)，依靠轉(zhuǎn)盤(pán)切割力、離心力和自身重力制成不同直徑的微丸，然后自然風(fēng)干、過(guò)分樣篩，得到成品疫苗。酸堿度、溫度、胃蛋白酶等是影響魚(yú)用口服疫苗免疫效果的主要因素，如不進(jìn)行包膜直接口服，胃液會(huì)對(duì)疫苗抗原進(jìn)行破壞，從而降低口服疫苗的效果。常見(jiàn)海水魚(yú)類(lèi)如大菱鲆、牙鲆等，胃液pH一般為2.5～5.5，腸液pH為6.0～7.8。根據(jù)海水魚(yú)胃腸液pH值，可選用天津愛(ài)勒易藥材公司的腸溶型包膜劑，該包膜劑在pH 6.0以上時(shí)才能溶解，可有效保護(hù)口服疫苗在胃液中不被消化酶破壞，在后腸中釋放抗原，并通過(guò)與后腸黏膜充分接觸，發(fā)揮黏膜免疫作用。

表3　血清和后腸黏膜中3種細(xì)菌特異性抗體效價(jià)的平均值Tab.3 Average values of antibody for three bacteria in serum and hindgut

表4　攻毒試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Result in an artificial infection test

3.2三聯(lián)口服疫苗的免疫效果

目前，魚(yú)類(lèi)口服疫苗的研究主要集中在微膠囊疫苗方向。李新華等［9］采用6%PVP-K30和2%海藻酸鈉研發(fā)了針對(duì)銀鯽嗜水氣單胞菌病的口服微膠囊疫苗，免疫保護(hù)率為61.1%，高于全細(xì)胞疫苗組的50%；李梅芳等［10］制備了殼聚糖-海藻酸鈉包被的副溶血弧菌外膜蛋白K微球疫苗，對(duì)大黃魚(yú)免疫保護(hù)率為60%；丁詩(shī)華等［11］以聚乙烯醇和聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLG）為原料，用復(fù)乳揮發(fā)法制備嗜水氣單胞菌口服疫苗，對(duì)魚(yú)的免疫保護(hù)率為42.9%，高于全細(xì)胞疫苗組的32.1%；張小江等［12］和任燕等［13］采用合成高分子聚DL-乳酸-聚乙二醇共聚物（PELA）包裹哈維氏弧菌Vibrio harveyi重組外膜蛋白微球制備口服疫苗；高銘蔚等［14］采用聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）包裹無(wú)乳鏈球菌制備口服疫苗，對(duì)羅非魚(yú)免疫保護(hù)率為57.63%；孫翰昌等［15］以聚丙烯酸樹(shù)脂為材料，采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備腸型點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌疫苗微球。本試驗(yàn)中制備的三聯(lián)口服疫苗采用投喂接種方式，與投喂普通餌料完全相同，省時(shí)省力，選用二甲基-β-丙酸噻亭為新一代誘食劑適合大多數(shù)海水魚(yú)口味，對(duì)大菱鲆免疫保護(hù)率達(dá)50%以上，可有效預(yù)防溶藻弧菌、副溶血弧菌和遲緩愛(ài)德華氏菌引發(fā)的相關(guān)疾病，在海水養(yǎng)殖中具有良好的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

［1］曹宏梅，李健，戰(zhàn)文斌.鰻弧菌和溶藻弧菌二聯(lián)疫苗對(duì)大菱鲆的免疫效果［J］.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2006，13（3）：397-402.

［2］李?lèi)?ài)華，吳玉深，蔡桃珍，等.嗜水氣單胞菌和河弧菌二聯(lián)疫苗對(duì)鯽的免疫效果［J］.水生生物學(xué)報(bào)，2002，26（1）：52-56.

［3］吳志鵬，王三英.三聯(lián)疫苗對(duì)大黃魚(yú)常見(jiàn)細(xì)菌性疾病免疫保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，43（1）：115-118.

［4］齊彩霞，張揚(yáng)，裴家田，等.三聯(lián)疫苗預(yù)防斑點(diǎn)叉尾鮰細(xì)菌性疾病研究［J］.水利漁業(yè)，2005，25（5）：98-99.

［5］沈錦玉，許文軍，尹文林，等.哈維氏弧菌滅活疫苗在養(yǎng)殖大黃魚(yú)中的應(yīng)用與評(píng)價(jià)［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，25（3）：210-213.

［6］趙偉，潘家楨.擠出滾圓造粒法制備淀粉空白微丸芯核的工藝研究［J］.化工裝備技術(shù)，2005，26（2）：13-16.

［7］繆丹丹，朱家壁，卜小培.擠出滾圓法制備胃漂浮空白丸芯及其處方和工藝研究［J］.藥學(xué)進(jìn)展，2007，31（3）：120-123.

［8］王秀華，周凌云，王玉娟，等.多效價(jià)載體疫苗免疫大菱鲆效果評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2011，18（4）：918-923.

［9］李新華，沈錦玉，尹文林，等.銀鯽口服嗜水氣單胞菌疫苗的免疫和免疫組化研究［J］.水生生物學(xué)報(bào)，2007，31（1）：125-130.

［10］李梅芳，毛芝娟，韓雨杉，等.殼聚糖-海藻酸鈉包被的副溶血弧菌外膜蛋白K微球疫苗的制備及其口服免疫效果［J］.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2014，27（5）：301-306.

［11］丁詩(shī)華，王一丁，彭遠(yuǎn)義，等.魚(yú)用嗜水氣單胞菌口服疫苗的免疫保護(hù)效應(yīng)［J］.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，27 （6）：888-891，917.

［12］張小江，任燕，常藕琴，等.斜帶石斑魚(yú)口服PELA-OmpK微球疫苗的示蹤及免疫效果［J］.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2008，15（5）：837-844.

［13］任燕，張小江，常藕琴，等.PELA-OmpK微球疫苗的部分特征及其對(duì)鯽魚(yú)的口服免疫效果［J］.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2011，24（11）：1306-1309.

［14］高銘蔚，田園園，盧邁新，等.羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌PLGA微球口服疫苗免疫效果的研究［J］.免疫學(xué)雜志，2015，31（2）：105-110.

［15］孫翰昌，楊帆.腸型點(diǎn)狀氣單胞菌口服疫苗微粒的制備及體外釋放研究［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2008，27（12）：658-661.

中圖分類(lèi)號(hào)：S942.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.03.004

文章編號(hào)：2095-1388（2016）03-0252-04

收稿日期：2015-08-27

基金項(xiàng)目：天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目 （14ZXNZNC00046，15ZXBFNC00290）；天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項(xiàng)目 （201501030）；天津市水產(chǎn)局青年科技項(xiàng)目 （J2014-14青）

作者簡(jiǎn)介：張振國(guó) （1981—），男，工程師。E-mail：zhangzg8249@163.com

通信作者：馮守明 （1965—），男，博士，研究員。E-mail：smfeng65@163.com液體培養(yǎng)基中，副溶血弧菌和遲緩愛(ài)德華氏菌在35℃下培養(yǎng)24 h，溶藻弧菌在35℃下培養(yǎng)48 h，以5000 r/min離心并收集菌體，用福爾馬林滅活，參考沈錦玉等［5］的方法，以確定合適的福爾馬林濃度和滅活時(shí)間。

Preparation of triple oral vaccine for fish and primary immune effect on turbot Scophthalmus maximus

ZHANG Zhen-guo1，HAO Shuang1，LI Ji2，LUO Zhang1，F(xiàn)ENG Shou-ming1，WU Hui-min1，JIANG Ju-feng1，SUN Zhi-jing1
（1.Tianjin Fisheries Research Institute，Tianjin 300221，China；2.Baodi District Fisheries Technology Extension Station in Tianjin，Tianjin 301800，China）

Abstract：A triple oral vaccine for fish was prepared with medicinal starch，maltodextrin，and killed Vibrio parahemolyticus，Vibrio alginolyticus and Edwardsiella tarda by 0.5%formaldehyde，by extrusion and spheronization method，and turbot Scophthalmus maximus was immuned with the triple oral vaccine prepared.The indirect ELISA was used to measure the antibody titre of V.parahemolyticus，V.alginolyticus and E.tarda in serum and hindgut mucosa 0，7，14，21 and 28 days after vaccination.The relative percent survival（RPS）of the triple oral vaccine was calculated in the turbot challenged with live V.parahemolyticus，V.alginolyticus and E.tarda（1×109cfu/mL，with ratio of V.parahemolyticusto，and V.alginolyticus to E.tarda=1∶1∶1）.There was significantly higher antibody titer of the three bacteria in serum and hindgut mucosa，with RPS of more than 50%for the three bacteria above，in the triple oral vaccine prepared by 150 g of medicinal starch，50 g maltdextrin，60 mL of bacterial liquid，extrusion at 200 r/min，and spheronization in 60 s than that in the control group.

Key words：triple oral vaccine；Scophthalmus maximus；immune