胃癌組織中HER?2和Survivin蛋白的表達(dá)及臨床意義

楊慶林，郭曉東，張睿，陸航，張紅

（錦州醫(yī)科大學(xué)1.附屬第三醫(yī)院腫瘤外科，遼寧 錦州 121001；2.附屬第一醫(yī)院胃腸外科，遼寧 錦州 121001）

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胃癌組織中HER?2和Survivin蛋白的表達(dá)及臨床意義

楊慶林1，郭曉東1，張睿1，陸航2，張紅1

（錦州醫(yī)科大學(xué)1.附屬第三醫(yī)院腫瘤外科，遼寧 錦州 121001；2.附屬第一醫(yī)院胃腸外科，遼寧 錦州 121001）

摘要目的探討胃癌組織中HER?2和Survivin蛋白的表達(dá)情況以及二者與臨床病理特征的關(guān)系。方法采用免疫組化方法及圖像分析技術(shù)分別對(duì)70例胃癌組織中HER?2和Survivin蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，并分析二者與胃癌患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果胃癌組織中HER?2和Survivin蛋白的表達(dá)與分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（均P＜0.05），與性別、年齡及腫瘤大小無(wú)關(guān)。陽(yáng)性率相關(guān)性分析及蛋白半定量相關(guān)性分析均顯示HER?2蛋白與Survivin蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（均P＜0.01）。結(jié)論HER?2和Survivin蛋白的表達(dá)均與分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且胃癌組織中HER?2蛋白和Survivin蛋白之間具有正向調(diào)節(jié)關(guān)系。

關(guān)鍵詞胃癌；HER?2；Survivin

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胃癌在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中的死亡率居于首位，雖然近年治療效果有所提高，但胃癌患者的5年生存率仍然低至20%～30%。隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，胃癌的靶向治療已逐漸被患者及臨床醫(yī)生所接受，人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor?2，HER?2）和Survivin正是近年的研究熱點(diǎn)。HER?2和Survivin在胃癌中均有高表達(dá)且都與預(yù)后不良密切相關(guān)［1?3］，2種蛋白表達(dá)之間可能具有某種內(nèi)在聯(lián)系。因此，本研究目的是對(duì)胃癌組織中HER?2和Survivin蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，并探討胃癌組織中HER?2和Survivin蛋白表達(dá)與臨床病理因素間的關(guān)系，為胃癌的預(yù)后及靶向治療提供可能的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

收集錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤外科及錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科2014年7月至2015年4月間手術(shù)切除的原發(fā)性胃癌患者標(biāo)本70例，其中男45例，女25例，年齡在41～87歲，中位年齡62歲。腫瘤＜5 cm 24例，≥5 cm 46例。病理分化程度：高分化20例，中、低分化50例。國(guó)際抗癌聯(lián)盟TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期22例，Ⅲ+Ⅳ期48例。無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例。標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)，患者入院前及在院期間均未行放、化療。取部分胃癌組織標(biāo)本常規(guī)固定、石蠟包埋，每例標(biāo)本制4 μm切片，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑

兔抗人HER?2單克隆抗體（即用型）、兔抗人Survivin多克隆抗體（即用型）、免疫組織化學(xué)Ultra?SensitiveTMSP超敏試劑盒（即用型）、DAB顯色試劑盒，均購(gòu)自福州邁新公司。

1.3免疫組化方法檢測(cè)HER?2和Survivin的表達(dá)以及結(jié)果的判定

1.3.1免疫組織化學(xué)SP法染色：用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。對(duì)組織切片脫蠟、水化后采用檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）行高壓抗原修復(fù)，冷卻至室溫后內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。PBS清洗后滴加正常非動(dòng)物免疫血清孵育10 min，除去血清加HER?2和Survivin抗體4℃過(guò)夜。經(jīng)過(guò)二抗和鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液處理后，DAB溶液顯色。蘇木紫復(fù)染后脫水、封片。

1.3.2HER?2免疫組化結(jié)果的判定：在高倍鏡下（× 400）隨機(jī)觀察，HER?2陽(yáng)性染色位于細(xì)胞膜，釆用修訂后的HercepTest評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)定。0表示無(wú)染色或＜10%的細(xì)胞有細(xì)胞膜染色；1+表示≥10%的細(xì)胞有輕微細(xì)胞膜染色；2+表示≥10%的細(xì)胞有弱的完全或基底外側(cè)膜染色；3+表示≥10%的細(xì)胞有中到強(qiáng)的完全或基底外側(cè)膜染色。0和1+表示陰性，2+和3+表示陽(yáng)性。

1.3.3Survivin免疫組化結(jié)果判定：Survivin陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性表達(dá)按細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒計(jì)分。0分，無(wú)色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。同時(shí)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：陰性，0分；＜10%，1分；10%～＜50%，2分；50%～＜75%，3分，≥75%，4分。兩者相乘，0～3分為0，4～5分為1+，6～7分為2+，8分以上為3+。0和1+表示陰性，2+和3+表示陽(yáng)性。

1.3.4圖像軟件的處理：陽(yáng)性染色均呈棕黃色顆粒，HER?2陽(yáng)性染色位于細(xì)胞膜，Survivin蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。對(duì)相同部位相同面積的陽(yáng)性反應(yīng)視野照像，采用IMAGE PRO?PLUS 6.0圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，分析計(jì)算其積分光密度（intergral opti?cal density，IOD）值進(jìn)行蛋白半定量分析。IOD值與棕黃色區(qū)域的面積和著色的深淺成正比，IOD值越大代表其測(cè)定的蛋白表達(dá)含量越高。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料2組間比較采用χ2檢驗(yàn)，二者相關(guān)性分析采用Kendall等級(jí)相關(guān)分析以及Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1胃癌組織中HER?2和Survivin蛋白的表達(dá)水平與胃癌臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

胃癌組織中HER?2和Survivin蛋白的表達(dá)均與病理分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，HER?2 和Survivin蛋白在中低分化、Ⅲ+Ⅳ分期、有淋巴轉(zhuǎn)移的胃癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)（P＜0.05），而與患者的性別、年齡及腫瘤大小無(wú)關(guān)（P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.2胃癌組織中HER?2蛋白與Survivin蛋白的表達(dá)情況

2.2.1胃癌組織中HER?2蛋白與Survivin蛋白陽(yáng)性率分析：HER?2的陽(yáng)性表達(dá)染色為棕黃色，主要定位于細(xì)胞膜（圖1A）。70例胃癌組織中19例HER?2蛋白表達(dá)為陽(yáng)性，HER?2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為27.14%。Survivin的陽(yáng)性表達(dá)染色為棕黃色，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，少量存在于胞核內(nèi)（圖1B）。70例胃癌組織中39例Survivin蛋白表達(dá)為陽(yáng)性，Survivin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為55.71%。HER?2與Survivin在胃癌中共同表達(dá)15例（21.43%），其中Survivin陰性組中HER?2陽(yáng)性4例（4/31），Survivin陽(yáng)性組中HER?2陰性24例（24/39），Kendall相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析顯示，HER?2 與Survivin之間呈正相關(guān)（rk=0.396，P＜0.001），見(jiàn)表2。

2.2.2胃癌組織中HER?2蛋白與Survivin蛋白半定量表達(dá)情況：在蛋白的表達(dá)上，進(jìn)一步利用圖像分析系統(tǒng)對(duì)70例胃癌組織陽(yáng)性反應(yīng)區(qū)相同部位相同面積的HER?2蛋白與Survivin蛋白表達(dá)的IOD值進(jìn)行測(cè)定。Spearman相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析顯示，HER?2蛋白表達(dá)與Survivin蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.411，P＜0.01），進(jìn)一步驗(yàn)證了胃癌組織中HER?2與Survivin蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。

3　討論

HER?2基因定位于人類染色體17q21，是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中眾多的重要啟動(dòng)因子之一，其編碼的跨膜蛋白具有酪氨酸激酶活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖。HER?2在正常情況下處于非激活狀態(tài)，但當(dāng)其受到一種或多種致癌因素作用后被激活，進(jìn)而使細(xì)胞無(wú)節(jié)制生長(zhǎng)并向惡性轉(zhuǎn)化［4］?，F(xiàn)階段HER?2已經(jīng)被普遍認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子，是公認(rèn)的腫瘤標(biāo)志物之一。其在乳腺惡性腫瘤中被研究的最多，在乳腺癌中具有高表達(dá)［5］，同樣胃癌組織中也有HER?2的過(guò)表達(dá)。本研究結(jié)果顯示：HER?2的陽(yáng)性表達(dá)率為27.14%，此結(jié)果與J?RGENSEN等［6］采用免疫組化方法檢測(cè)HER?2蛋白在胃癌中的過(guò)表達(dá)率為23%的結(jié)果相比略高，說(shuō)明HER?2在胃癌中明顯高表達(dá)。也有人認(rèn)為因?yàn)樵u(píng)分系統(tǒng)不同，HER?2高表達(dá)的判斷結(jié)果可在4%～53%之間變動(dòng)［7］。本研究顯示HER?2蛋白過(guò)度表達(dá)與胃癌的分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，這與相關(guān)研究結(jié)果一致［8］，可以肯定的是HER?2的檢測(cè)對(duì)胃癌患者的預(yù)后判斷及治療有一定的臨床意義。

表1　HER-2和Survivin蛋白在胃癌中的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系Tab.1　The expression of HER-2 and Survivin protein in gastric cancer and the relationship between clinicopathological factors

圖1　胃癌組織中HER-2和Survivin蛋白的表達(dá) ×400Fig.1　The expression of HER-2 and Survivin protein in gastric cancer tissue×400

表2　胃癌組織中HER-2與Survivin陽(yáng)性表達(dá)相關(guān)性Tab.2　The correlation about the positive expression of HER-2 and Survivin in gastric cancer tissue

Survivin能有效對(duì)抗細(xì)胞的凋亡，Survivin的抗凋亡途徑可能有2種，一種是caspase途徑，直接抑制caspase?3和caspase?7的活性，另一種則是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞分裂從而抑制細(xì)胞凋亡。Survivin在成人除胸腺和生殖腺以外發(fā)育正常的組織中幾乎不表達(dá)，只在胚胎和發(fā)育的胎兒組織中有不同程度的表達(dá)。其在腫瘤組織中被激活后發(fā)生過(guò)度表達(dá)，繼而使細(xì)胞增殖增加、凋亡減少，并有促進(jìn)腫瘤血管生成等作用，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生、發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，Survivin在人類多種惡性腫瘤組織中特異性高表達(dá)，其中包括胃癌［9］，已知Survivin陽(yáng)性表達(dá)率在40%～65%之間［10?11］。同樣本研究結(jié)果顯示：Survivin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為55.71%，與以往的研究結(jié)果一致，也表明了在胃癌組織中Survivin具有較高的過(guò)表達(dá)率。本研究結(jié)果同樣顯示Survivin蛋白過(guò)度表達(dá)與胃癌的分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與患者年齡、性別以及腫瘤的大小無(wú)關(guān)，此結(jié)果與GU等［12］對(duì)Survivin在胃癌中的研究結(jié)果符合，這說(shuō)明Survivin也是一種潛在的腫瘤標(biāo)志物，有可能成為新的腫瘤治療靶點(diǎn)。以上結(jié)果說(shuō)明，胃癌的發(fā)生發(fā)展可能與HER?2和Survivin促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管生成等生物學(xué)特性有關(guān)，提示胃癌的惡性演進(jìn)過(guò)程可能與HER?2和Survivin的過(guò)度持續(xù)表達(dá)關(guān)系密切，通過(guò)對(duì)HER?2和Survivin的檢測(cè)可以預(yù)測(cè)病情的發(fā)展變化及指導(dǎo)臨床治療方案的選擇。

通過(guò)對(duì)以上結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)的整理發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中HER?2及Survivin均具有過(guò)度表達(dá)且均與預(yù)后不良高度相關(guān)，因此可以推測(cè)Survivin與HER?2可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制上有著緊密的聯(lián)系。雖有研究證實(shí)在乳腺癌組織中HER?2蛋白與Sur?vivin蛋白之間具有正相關(guān)性，且可能通過(guò)P?AKT途徑調(diào)節(jié)，但在胃癌組織中二者間的關(guān)系并不十分明確。本研究基于二者之間的關(guān)聯(lián)性，通過(guò)進(jìn)一步對(duì)HER?2與Survivin的陽(yáng)性率結(jié)果及利用圖像分析技術(shù)半定量測(cè)定的HER?2蛋白和Survivin蛋白表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果均顯示二者之間具有高度相關(guān)性。以上結(jié)果說(shuō)明HER?2和Survivin在蛋白水平表達(dá)呈正相關(guān)，二者之間存在正相關(guān)性。根據(jù)已有的研究，推測(cè)二者在促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖以及抑制癌細(xì)胞的凋亡作用上可能具有相互協(xié)同作用。

綜上所述，HER?2及Survivin在胃癌組織中具有高度表達(dá)，并且HER?2與Survivin在蛋白水平表達(dá)呈明顯正相關(guān)，HER?2與Survivin在臨床上與胃癌的分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，通過(guò)對(duì)二者進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)可能對(duì)胃癌的治療及預(yù)后的判斷起到一定的指導(dǎo)意義，但二者間具體通過(guò)何種通路以及具體的機(jī)制還有待更進(jìn)一步的研究。

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（編輯陳姜）

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：

中圖分類號(hào)R735.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)0258-4646（2016）07-0616-04

DOI：10.12007/j.issn.0258?4646.2016.07.009

基金項(xiàng)目：遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（2014022016）

作者簡(jiǎn)介：楊慶林（1989-），男，碩士研究生.

通信作者：張紅，E-mail：zhanghongjz0416@163.com

收稿日期：2015-12-07

Expression and Clinical Significance of HER?2 and Survivin in Gastric Cancer Tissue

YANG Qinglin1，GUO Xiaodong1，ZHANG Rui1，LU Hang2，ZHANG Hong1
（1.Department of Surgical Oncology，The Third Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University，Jinzhou 121001，China；2.Department of Gastrointestinal Surgery，The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University，Jinzhou 121001，China）

AbstractObjectiveTo investigate the expression of human epidermal growth factor receptor?2（HER?2）and Survivin protein in gastric cancer tissue，and explore its relationship with clinicopathological characteristics.MethodsImmunohistochemistry assay was used for detection of HER?2 and Survivin protein expression in 70 gastric cancer biopsy samples.The relationship with the clinicoathological parameters in patients with gas?tric cancer was analyzed.ResultsThe expression of HER?2 and Survivin protein was correlated with tumor differentiation，TNM stage and lymph node metastasis（allP＜0.05），but not with sex，age，the diameter of tumor.The correlation analysis of positive rate and the semi?quantitative pro?tein expression showed that the expression of Survivin and HER?2 was significantly positively related（allP＜0.01）.ConclusionThe positive ex?pression of HER?2 and Survivin protein in gastric cancer correlates with tumor differentiation，TNM stage and lymph node metastasis.HER?2 ex?pression significantly correlates with Survivin at the protein level in gastric cancer tissues.

Keywordsgastric cancer；human epidermal growth factor receptor?2；Survivin