瞬時(shí)受體電位通道蛋白的跨膜片段分析

蘇秋香，張麗艷，汲坤，張改改，張利華

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1.機(jī)能實(shí)驗(yàn)學(xué)教研室；2.病理生理教研室，沈陽(yáng) 110034）

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瞬時(shí)受體電位通道蛋白的跨膜片段分析

蘇秋香1，張麗艷2，汲坤2，張改改2，張利華2

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1.機(jī)能實(shí)驗(yàn)學(xué)教研室；2.病理生理教研室，沈陽(yáng) 110034）

摘要目的分析瞬時(shí)受體電位（TRP）通道的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。方法采用糖基化的方法，對(duì)傳統(tǒng)TRP通道TRPC5的各疏水片段進(jìn)行膜整合分析。結(jié)果TRPC5通道中，S4～S8片段按順序分別以Ncyt/Cexo和Nexo/Ccyt的方式插入到膜中，C末端位于細(xì)胞內(nèi)。而S1～S3片段可能存在2種膜整合方式：一種是S1和S3整合到膜上，S2位于細(xì)胞外；另一種是混合模式，S1和S3分別位于細(xì)胞內(nèi)，其N末端均位于細(xì)胞內(nèi)。結(jié)論TRPC5通道的S4～S8為跨膜片段，S1～S3片段需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

關(guān)鍵詞瞬時(shí)受體電位通道；膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)；跨膜片段分析

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瞬時(shí)受體電位（transient receptor potential，TRP）通道是一類非選擇性陽(yáng)離子通道，位于細(xì)胞膜上，最早發(fā)現(xiàn)于果蠅的視覺(jué)系統(tǒng)［1］。在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)28種TRP通道亞型，分屬于7個(gè)亞家族，包括TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPP、TRPML和TRPN，每個(gè)亞家族又包含若干通道［2］。TRP通道蛋白分布廣泛，其調(diào)節(jié)機(jī)制各異且功能多樣，參與到多種生理過(guò)程中［3］。哺乳動(dòng)物TRPC通道又被分為TRPC1、TRPC2、TRPC4/5、TRPC3/6/7四個(gè)亞型［4］。由于TRP通道的亞型較多，功能復(fù)雜，直至最近才將TRP結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系基本闡明［5］。所有亞家族結(jié)構(gòu)上均含6個(gè)跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，其氨基酸（N）末端和羧基（C）末端均位于胞內(nèi)，由第5及第6跨膜片段共同構(gòu)成非選擇性陽(yáng)離子孔道。TRPC通道N末端由3～4個(gè)錨蛋白重復(fù)序列、1個(gè)卷曲螺旋和1個(gè)小窩蛋白結(jié)合區(qū)組成；C末端包含TRP標(biāo)志基序（EWKFAR）。雖然TRP通道的基本結(jié)構(gòu)已經(jīng)提出，但具體的跨膜疏水片段以及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)形成機(jī)制并未闡明。VANNIER等［6］于1998年報(bào)道，TRPC3的第1個(gè)疏水片段位于細(xì)胞內(nèi)，而其余的7個(gè)疏水片段按順序整合到膜上，成為跨膜片段。而DOHKE等［7］于2004年報(bào)道，TRPC1的第3個(gè)疏水片段位于細(xì)胞內(nèi)，而其余的7個(gè)疏水片段按順序整合到膜上，成為跨膜片段。離子通道屬于膜蛋白，其結(jié)構(gòu)的闡明對(duì)于了解離子通道的功能非常有幫助。拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析常被用來(lái)研究膜蛋白的結(jié)構(gòu)，研究膜蛋白的各個(gè)跨膜片斷在線粒體蛋白合成的同時(shí)是如何整合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的，并最終形成什么樣的跨膜結(jié)構(gòu)［8］。目前，最常用的方法是糖基化和蛋白酶K水解。本研究采用體外蛋白轉(zhuǎn)錄、翻譯和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)以及糖基化方法分析了TRP家族中比較有代表性的TRPC5通道的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，為闡明TRP通道蛋白的結(jié)構(gòu)與功能提供數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1質(zhì)粒構(gòu)建

1.1.1G?loop導(dǎo)入質(zhì)粒制作：利用PCR方法擴(kuò)出編碼TRPC5中含疏水片段S1～S8的DNA片段（V292?D636），同時(shí)在DNA片段的5′端導(dǎo)入NcoⅠ酶切位點(diǎn)，3′端導(dǎo)入XhoⅠ酶切位點(diǎn)，利用NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)把該DNA片段亞克隆到pCITE?2a載體（美國(guó)Novagen公司）中。然后利用點(diǎn)變異方法，分別在每個(gè)疏水片段之間的連接中根據(jù)有效糖基化的12?14規(guī)則導(dǎo)入EcoⅠ酶切位點(diǎn)，利用酶切的方法，把來(lái)自人帶3蛋白中含有一個(gè)糖基化受體位點(diǎn)的G?loop分別插入到各連接中的EcoⅠ酶切位點(diǎn)上。

1.1.2截短蛋白質(zhì)粒制作：我們利用PCR方法分別擴(kuò)出編碼TRPC5中疏水片段S1、S1～S2、S1～S3、S1～S4、S1～S5、S1～S6、S1～S7、S1～S8的DNA片段，然后利用酶切的方法，把這些DNA片段融合到攜帶有PLg報(bào)告基因的pCITE?2a載體中，PLg報(bào)告基因中含有糖基化位點(diǎn)。

1.2體外蛋白轉(zhuǎn)錄、翻譯及轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

利用狗胰腺粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡和兔網(wǎng)織紅細(xì)胞抽出液模擬體內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)錄、翻譯及轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。首先進(jìn)行mRNA合成，所有質(zhì)粒經(jīng)過(guò)ScaⅠ酶切線性化，在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用T7 RNA多聚酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，37℃，1 h。然后把獲得的mRNA在含有或不含有狗胰腺粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞抽出液系統(tǒng)中進(jìn)行體外蛋白合成和轉(zhuǎn)運(yùn)，37℃，1 h。對(duì)在含有粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)條件下合成的蛋白產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行蛋白水解試驗(yàn)，蛋白水解酶采用蛋白酶K。我們用［35S］蛋氨酸標(biāo)記蛋白，用SDS?PAGE電泳分離蛋白產(chǎn)物，最后進(jìn)行同位素自顯影。

1.3膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析

在未添加粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡的條件下，膜蛋白經(jīng)體外合成后出現(xiàn)一條蛋白帶，這是未被糖基化的蛋白帶。因?yàn)樘腔磻?yīng)僅發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔內(nèi)，而且一個(gè)糖基化受體位點(diǎn)由于接受一個(gè)高甘露糖基寡聚糖，分子量會(huì)增加2 500。因此，在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在下，如果出現(xiàn)1條分子量比未被糖基化的蛋白帶多出約3 000的蛋白帶，就說(shuō)明該蛋白帶被糖基化了，同時(shí)也說(shuō)明該蛋白含有糖基化受體位點(diǎn)的多肽區(qū)域位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)（細(xì)胞外）。在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在下，獲得的蛋白經(jīng)過(guò)蛋白酶K處理后，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔外（細(xì)胞內(nèi)）的多肽會(huì)被蛋白酶K消化降解，蛋白帶縮短或消失。根據(jù)導(dǎo)入的糖基化受體位點(diǎn)是否被糖基化以及合成的蛋白是否被蛋白酶K消化降解，可以推測(cè)出蛋白的多肽鏈?zhǔn)俏挥趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)（細(xì)胞外）還是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔外（細(xì)胞內(nèi)），從而推測(cè)出膜蛋白各疏水區(qū)域是否是跨膜片段，即推測(cè)出膜蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。

2　結(jié)果

2.1TRPC5跨膜疏水片段預(yù)測(cè)

利用Kyte?Doolittle方法對(duì)TRPC5氨基酸序列進(jìn)行疏水性分析（圖1）。S1（328～350）、S2（359～384）、S3（402～418）、S4（437～456）、S5（476～497）、S6（508～532）、S7（567～587）、S8（598～624）這8個(gè)區(qū)域疏水性較高，被認(rèn)為可能成為跨膜片段。

2.2使用N和C末端切除蛋白進(jìn)行TRPC5各片段的膜整合分析

N末端（氨基酸末端）常常會(huì)影響蛋白的體外表達(dá)量，所以在膜蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析中常常使用N 和C末端切除蛋白進(jìn)行體外蛋白的表達(dá)及轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。如圖2A，先構(gòu)建N和C末端切除的TRPC5質(zhì)粒TRPC5（V292?D636），然后在每2個(gè)可能的跨膜疏水片段（S1～S8）的中間連接（loop）中分別導(dǎo)入來(lái)自于人帶3蛋白的含有一個(gè)糖基化位點(diǎn)的G?loop，質(zhì)粒構(gòu)建完成后，體外合成mRNA，在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和蛋白酶K分別存在的條件下，進(jìn)行蛋白合成和轉(zhuǎn)運(yùn)，最后進(jìn)行SDS?PAGE電泳實(shí)驗(yàn)。

SDS?PAGE結(jié)果（圖2B）顯示，在未添加粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡的條件下，TRPC5（V292?D636）經(jīng)體外合成后，出現(xiàn)1條分子量約在55 000的蛋白帶，這是未被糖基化的蛋白帶。在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在下，L358 （S1?S2 loop）、L393（S2?S3 loop）、E467（S4?S5 loop）和P550（S6?S7 loop）出現(xiàn)一條明顯的糖基化蛋白帶，說(shuō)明S1?S2連接、S2?S3連接、S4?S5連接和S6?S7連接位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)（細(xì)胞外），人工導(dǎo)入的G?loop上的的糖基化受體位點(diǎn)被糖基化；其糖基化效率分別為30%、66%、20%和39%（圖2C）。在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在下獲得的蛋白經(jīng)過(guò)蛋白酶K處理后，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔外（細(xì)胞內(nèi)）的肽鏈被蛋白酶K消化降解，蛋白帶消失（圖2B）。

2.3使用截短蛋白進(jìn)行TRPC5各片段的膜整合分析

圖1　TRPC5跨膜片段預(yù)測(cè)和膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析方法圖示Fig.1　Prediction of membrane spanning segments in TRPC5 and cartoons for topological analysis

本研究采用另一種策略，使用截短蛋白對(duì)TRPC5各片段的膜整合又進(jìn)行了分析。在含有不同疏水片段的構(gòu)建體的C末端融合一個(gè)報(bào)告基因PLg，該報(bào)告基因含有一個(gè)糖基化位點(diǎn)（圖3A）。如果該報(bào)告基因在翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)被糖基化，說(shuō)明截短蛋白的C末端位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)（細(xì)胞外）。SDS?PAGE結(jié)果（圖3B）顯示，S1?PLg、S1?S2?PLg、S1?S4?PLg和S1?S6?PLg經(jīng)體外合成后，在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在下分別出現(xiàn)了1條糖基化蛋白帶，且經(jīng)蛋白酶K處理后，仍然有蛋白帶殘留，說(shuō)明截短蛋白的C末端，即S1?S2連接、S2?S3連接、S4?S5連接和S6?S7連接，是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)（細(xì)胞外）的，其之前的最后一個(gè)疏水片段是以Ncyt/Cexo的形式整合到膜上的。每個(gè)截短蛋白的糖基化效率（圖3C）S1?PLg為37%，S1?S2?PLg 為51%，S1?S4?PLg為17%，S1?S6?PLg為34%。

2.4TRPC5通道蛋白膜整合分析

根據(jù)圖2和圖3的數(shù)據(jù)結(jié)果，推測(cè)TRPC5通道蛋白的膜整合可能采取3種基本模式（圖4）。模式Ⅰ：N末端位于細(xì)胞內(nèi)，S1跨膜，而S2位于細(xì)胞外（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)），S3～S8疏水片段按順序跨膜，C末端位于細(xì)胞內(nèi)；模式Ⅱ：N末端和S1位于細(xì)胞內(nèi)，S2～S8疏水片段按順序跨膜，C末端位于細(xì)胞內(nèi)（與VANNIER等［6］1998年報(bào)道的TRPC3模型相同）；模式Ⅲ：N末端位于細(xì)胞內(nèi)，S1和S2跨膜，而S3位于細(xì)胞內(nèi)，S4～S8疏水片段按順序跨膜，C末端位于細(xì)胞內(nèi)（與DOHKE等［7］2004年報(bào)道的TRPC1模型相同）。根據(jù)2種實(shí)驗(yàn)方法均得出的S1?S2連接、S2?S3連接、S4?S5連接和S6?S7連接位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)（細(xì)胞外）的結(jié)果，我們推測(cè)出TRPC5各疏水片段可能的膜整合方式。S4?S5連接和S6?S7連接位于細(xì)胞外，可以推測(cè)出TRPC5的S4～S8疏水片段按順序整合到膜上，成為跨膜片段，C末端位于細(xì)胞內(nèi)。而S1?S2連接、S2?S3連接位于細(xì)胞外，可以推測(cè)出S1～S3疏水片段的膜整合方式存在2種可能性。第1種是TRPC5通道蛋白采用模式Ⅰ的跨膜方式；第2種是TRPC5采用模式Ⅰ與模式Ⅱ的混合跨膜方式。

圖2　使用N和C末端切除蛋白進(jìn)行TRPC5各片段的膜整合分析Fig.2　Membrane integration assays of each transmembrane segment of TRPC5 using N?and C?terminus?deleted proteins

3　討論

通常膜蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的同時(shí)，腔內(nèi)會(huì)發(fā)生糖基化現(xiàn)象，而腔外發(fā)生蛋白水解的現(xiàn)象。根據(jù)這一特點(diǎn)，科學(xué)家們常采用各種無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行蛋白的體外轉(zhuǎn)錄、翻譯和轉(zhuǎn)運(yùn)，在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在的情況下，體外模擬膜蛋白合成和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，觀察目標(biāo)蛋白的糖基化和蛋白水解的現(xiàn)象，從而分析膜蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)［9］。但膜蛋白的糖基化反應(yīng)有效進(jìn)行需要一定的條件，那就是膜蛋白的糖基化受體位點(diǎn)應(yīng)該與膜上寡糖基轉(zhuǎn)移酶的活性位點(diǎn)結(jié)合，而這個(gè)位點(diǎn)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜之間的距離遵守12?14規(guī)則。該規(guī)則認(rèn)為，糖基化受體位點(diǎn)的N端距內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表面至少有12個(gè)殘基的距離，其C端至少有14個(gè)殘基的距離，該受體位點(diǎn)才能被有效糖基化［10］。此規(guī)則已被用來(lái)分析膜蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)［11?12］。

圖3　使用截短蛋白進(jìn)行TRPC5各片段的膜整合分析Fig.3　Membrane integration assays of each transmembrane segment of TRPC5 using truncated proteins

本研究根據(jù)人工導(dǎo)入或自然存在的糖基化位點(diǎn)發(fā)生糖基化需要滿足該位點(diǎn)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔內(nèi)（即細(xì)胞外）的原理，設(shè)計(jì)2種實(shí)驗(yàn)策略來(lái)推測(cè)TRPC5的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。一種是在TRPC5的可能跨膜片段之間的連接上導(dǎo)入含糖基化位點(diǎn)的G?loop，觀察G?loop是否被糖基化，從而推出該連接是否位于細(xì)胞外；另一種是在含可能跨膜片段的TRPC5截短蛋白的C末端連接含糖基化位點(diǎn)的PLg報(bào)告基因，觀察該報(bào)告基因是否被糖基化，推出TRPC5截短蛋白的C末端是否位于細(xì)胞外，從而推出C末端所在的連接是否位于細(xì)胞外。

2種實(shí)驗(yàn)策略的結(jié)果均顯示，TRPC5通道蛋白的S1?S2連接、S2?S3連接、S4?S5連接和S6?S7連接位于細(xì)胞外。根據(jù)該結(jié)果，可推測(cè)出S4～S8疏水片段為跨膜片段，與之前VANNIER［6］和DOHKE［7］發(fā)表的TRPC3和TRPC1的S4～S8為跨膜片段的結(jié)果一致。而S1～S3部分與之前的數(shù)據(jù)不符。我們分析了TRPC3、TRPC1和本研究的TRPC5實(shí)驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)結(jié)果不同可能由于實(shí)驗(yàn)方法的差異。VANNIER的TRPC3實(shí)驗(yàn)用的是全長(zhǎng)的通道蛋白，而DOHKE的TRPC1實(shí)驗(yàn)和我們的TRPC5實(shí)驗(yàn)用的均是去除N端的通道蛋白。TRP通道家族的N端含有錨蛋白結(jié)構(gòu)域，有助于通道形成四聚體結(jié)構(gòu)，而這種四聚體結(jié)構(gòu)的形成很可能抑制疏水片段S1的膜插入功能，這樣S2～S8會(huì)按通常的模式插入膜中，形成TRPC3模式。而N端去除之后，疏水片段S1沒(méi)有限制，但S1應(yīng)該具有一定的跨膜能力，所以S1會(huì)引導(dǎo)一部分通道蛋白插入膜中，形成跨膜片段，最終使得TRPC5的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可能形成TRPC3（Ⅱ型）模式和TRPC1（Ⅲ型）模式的混合體。我們需做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。首先，我們需要檢驗(yàn)各個(gè)疏水片段的膜插入能力，然后，設(shè)計(jì)使用全長(zhǎng)的通道蛋白來(lái)檢測(cè)TRPC5的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，并同時(shí)檢測(cè)錨蛋白結(jié)構(gòu)域在TRP通道蛋白跨膜過(guò)程中的作用。本研究的糖基化結(jié)果顯示，TRPC5的S4～S8疏水片段按順序整合到膜上，成為跨膜片段；而S1～S3疏水片段的膜整合方式存在2種可能性，一種是S2疏水片段位于細(xì)胞外，S1、S3為跨膜片段，另一種是同時(shí)存在2種方式，一部分TRPC5通道的S1位于細(xì)胞內(nèi)、S2～S3為跨膜片段，而另一部分的TRPC5通道的S1～S2為跨膜片段、S3位于細(xì)胞內(nèi)。我們需要進(jìn)行進(jìn)一步研究來(lái)明確TRPC5的S1～S3疏水片段的膜整合方式。

圖4　TRPC5可能的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)模型Fig.4　Possible topological model of TRPC5

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（編輯陳姜）

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：

中圖分類號(hào)R338.8

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)0258-4646（2016）07-0610-06

DOI：10.12007/j.issn.0258?4646.2016.07.008

基金項(xiàng)目：遼寧省科技廳科學(xué)事業(yè)公益研究基金（2014001024）；沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院科學(xué)研究基金（20141005）

作者簡(jiǎn)介：蘇秋香（1962-），女，副教授，本科.

通信作者：張麗艷，E-mail：1580471013@qq.com

收稿日期：2016-04-06

Transmembrane Segment Analysis of Transient Receptor Potential Channel

SU Qiuxiang1，ZHANG Liyan2，JI Kun2，ZHANG Gaigai2，ZHANG Lihua2
（1.Department of Medical Functional Experimentation，College of Basic Medical Sciences，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Department of Pathophysiology，College of Basic Medical Sciences，Shenyang Medical College，Shenyang 110034）

AbstractObjectiveTo investigate the membrane topology of transient receptor potential（TRP）channel.MethodsGlycosylation method was used to investigate the membrane integrations of each hydrophobic segment of canonical TRP（TRPC5）.ResultsIn TRPC5 channel，S4?S8 segments were integrated into membrane with Ncyt/Cexo and Nexo/Ccyt orientations sequentially，and C?terminus was intracellular.S1?S3 segments were integrated into membrane with two possible types.One was that S1 and S3 were integrated into membrane，whereas S2 was left out of the membrane on the cytosolic side；and the other was a mixed type that S1 and S3 were exposed to cytoplasm respectively.Both of them，the N?termi?nus was intracellular.ConclusionS4?S8 segments of TRPC5 are transmembrane segments.The integrations of S1?S3 segments into membrane need to be further investigated.

Keywordstransient receptor potential channel；membrane topology；transmembrane segment analysis