環(huán)磷酰胺腹腔注射法及膀胱灌注法制備膀胱過(guò)度活動(dòng)大鼠模型的研究

段乙南，夏志軍，許海楠

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng) 110004）

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環(huán)磷酰胺腹腔注射法及膀胱灌注法制備膀胱過(guò)度活動(dòng)大鼠模型的研究

段乙南，夏志軍，許海楠

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng) 110004）

摘要目的通過(guò)環(huán)磷酰胺腹腔注射及膀胱灌注2種不同方法制備膀胱過(guò)度活動(dòng)（OAB）大鼠模型，比較2種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。方法隨機(jī)將30只大鼠分為腹腔注射組、膀胱灌注組和對(duì)照組。腹腔注射組及膀胱灌注組分別每3 d腹腔注射或膀胱灌注環(huán)磷酰胺（75 mg/kg體質(zhì)量）1次，共3次，對(duì)照組大鼠不予處理。檢測(cè)3組大鼠最大膀胱容量、最大排尿壓（MVP）和逼尿肌不穩(wěn)定收縮頻率，并比較2組大鼠膀胱病理學(xué)差異、患病率及死亡率。結(jié)果膀胱灌注組與腹腔注射組大鼠最大膀胱容量、最大排尿壓及逼尿肌不穩(wěn)定收縮頻率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與對(duì)照組比較，膀胱灌注組及腹腔注射組最大膀胱容量明顯上升（P＜0.05），最大排尿壓明顯下降（P＜0.05），逼尿肌不穩(wěn)定收縮頻率顯著增高（P＜0.05）。腹腔注射組建模成功率90%，死亡率80%，膀胱灌注組建模成功率50%，死亡率0%。腹腔注射組和膀胱灌注組大鼠膀胱均有病理改變。結(jié)論環(huán)磷酰胺腹腔注射及膀胱灌注均可致大鼠OAB，可以作為可靠模型，腹腔注射成功率高，但死亡率也高，膀胱灌注成功率低，但死亡率也低。

關(guān)鍵詞膀胱過(guò)度活動(dòng)；膀胱灌注；腹腔注射；不同方法

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膀胱過(guò)度活動(dòng)（overactive bladder，OAB）發(fā)病率高，且發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而增高［1-4］。臨床上，如下尿路梗阻、膀胱炎、神經(jīng)源性膀胱及間質(zhì)性膀胱炎等多種原因均可導(dǎo)致OAB癥狀。根據(jù)造模方法的不同，目前OAB大鼠模型主要有膀胱出口梗阻（bladder outlet obstruction，BOO）模型、斷髓模型、細(xì)菌性膀胱炎模型和膀胱炎模型等。有研究［5］報(bào)道應(yīng)用腹腔注射環(huán)磷酰胺的方法可構(gòu)建OAB大鼠模型。本研究擬采用腹腔注射及膀胱灌注環(huán)磷酰胺的方法制備該模型，并比較這2種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雌性SD大鼠30只，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自北京華阜康生物技術(shù)有限公司。建模前檢測(cè)大鼠尿動(dòng)力，以確保納入研究大鼠尿路功能正常。將大鼠隨機(jī)分為膀胱灌注組、腹腔注射組和對(duì)照組，每組各10只。飼養(yǎng)條件為SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)飲食，12 h晝夜節(jié)律，濕度50%～60%，溫度25～27℃。

1.1.2主要試劑：環(huán)磷酰胺購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：（1）腹腔注射組，腹腔注射環(huán)磷酰胺75 mg/kg，每3 d注射1次，共注射3次。第10天在戊巴比妥鈉麻醉下檢測(cè)尿動(dòng)力（排尿間隔時(shí)間、基礎(chǔ)膀胱壓、膀胱最大充盈壓、最大排尿壓），連續(xù)測(cè)定3個(gè)排尿周期。膀胱充盈期逼尿肌不穩(wěn)定收縮幅度＞5 mmHg則認(rèn)為OAB造模成功［6］。（2）膀胱灌注組，膀胱灌注環(huán)磷酰胺75 mg/kg，每3 d灌注1次，共灌注3次。第10天在戊巴比妥鈉麻醉下測(cè)尿動(dòng)力，未成功者繼續(xù)給予膀胱灌注建模。（3）對(duì)照組，不予處置，第10天在戊巴比妥鈉麻醉下測(cè)尿動(dòng)力。1.2.2標(biāo)本采集：待尿動(dòng)力檢測(cè)完成后脫臼處死大鼠，完整切除膀胱，肉眼觀察膀胱大體變化，石蠟包埋切片，HE染色，顯微鏡下觀察膀胱黏膜細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用±s表示，采用t檢驗(yàn)比較組間差異，計(jì)數(shù)資料采用精確概率法進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1尿動(dòng)力學(xué)改變

對(duì)照組正常大鼠膀胱充盈期呈低壓狀態(tài)，排尿期膀胱壓明顯升高，隨排尿活動(dòng)，建模成功后大鼠膀胱在充盈期出現(xiàn)逼尿肌不穩(wěn)定收縮，形成鋸齒形圖案，見(jiàn)圖1；最大膀胱容量和逼尿肌不穩(wěn)定收縮頻率明顯升高，最大排尿壓明顯降低，最大膀胱容量、逼尿肌不穩(wěn)定收縮頻率及最大排尿壓在建模前后的差值與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1　尿動(dòng)力改變Tab.1　Change of urodynamics

2.2病理改變

膀胱灌注組及腹腔注射組膀胱黏膜可見(jiàn)上皮充血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞肥大，膀胱壁增厚，肌細(xì)胞肥大，逼尿肌內(nèi)膠原含量明顯增多。而對(duì)照組大鼠膀胱黏膜上皮由2～3層移行細(xì)胞組成，細(xì)胞扁平，大小一致。見(jiàn)圖2。

2.3OAB大鼠建模成功率和死亡率

結(jié)果顯示，腹腔注射組建模成功率（90%）高于膀胱灌注組（50%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；腹腔注射組死亡率（80%）高于膀胱灌注組（0%），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4大鼠狀態(tài)改變

腹腔注射組大鼠有不同程度的全身癥狀，如精神萎靡，眼角及鼻孔有滲血，進(jìn)食量逐漸減少，可見(jiàn)肉眼血尿，大便逐漸呈稀糊狀，體質(zhì)量下降，建模后成活率低；而膀胱灌注組大鼠精神狀態(tài)佳，活力接近正常大鼠，體質(zhì)量無(wú)明顯下降。

圖1　各組大鼠尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果Fig.1　Urodynamic results of each group

圖2　各組大鼠膀胱病理改變Fig.2　Pathologic changes of the bladders

3　討論

OAB綜合征是一種以尿急癥狀為特征的癥候群，常伴有尿頻和夜尿，也可伴有或不伴急迫性尿失禁癥狀［7］。在尿動(dòng)力學(xué)上，OAB可特征性地表現(xiàn)為膀胱充盈期出現(xiàn)無(wú)意識(shí)的逼尿肌自發(fā)或誘發(fā)的收縮，即逼尿肌過(guò)度活動(dòng)，也可表現(xiàn)為其他形式的尿道-膀胱功能障礙［8］。

環(huán)磷酰胺所致大鼠OAB接近人類［6］，是目前常用的構(gòu)建OAB模型的方法。但既往建模時(shí)多使用腹腔注射的方法，本研究采用膀胱灌注環(huán)磷酰胺的方法構(gòu)建OAB模型，并比較了2種方法建模的特點(diǎn)。

尿動(dòng)力學(xué)檢查可客觀反映下尿路功能狀態(tài)，是臨床診斷排尿功能障礙的重要手段［9］。本研究中，尿動(dòng)力學(xué)檢查結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，腹腔注射組及膀胱灌注組大鼠均有膀胱最大容量升高、最大排尿壓降低以及逼尿肌不穩(wěn)定收縮頻率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但這2組大鼠尿動(dòng)力結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，均為建模成功大鼠。

腹腔注射與膀胱灌注是藥物作用于整體與局部的差別，2種方法所建OAB模型各有優(yōu)缺點(diǎn)。腹腔灌注方法操作簡(jiǎn)單，只需每3 d腹腔注射環(huán)磷酰胺1次，建模成功率高，3次給藥后建模成功率為90%，但大鼠狀態(tài)較差，建模后5 d死亡率可達(dá)80%，與環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠的全身毒性有關(guān)。腹腔注射經(jīng)腹膜吸收，其代謝產(chǎn)物作用于膀胱及全身各器官，產(chǎn)生膀胱過(guò)度刺激，同時(shí)對(duì)其他器官也產(chǎn)生損害。自腹腔注射給藥第8天開(kāi)始，大鼠精神狀態(tài)漸差，逐漸萎靡，呈弓背狀態(tài)，進(jìn)食減少。腹腔灌注方法所建OAB模型不適于長(zhǎng)期活體研究，但膀胱黏膜充血、細(xì)胞增大、肌層膠原增多、肌細(xì)胞肥大等病理改變明顯，可用于病理及病因?qū)W等方面的短期或離體研究。

目前對(duì)膀胱功能的的研究大部分來(lái)自體外實(shí)驗(yàn)，如使用大鼠膀胱逼尿肌的肌肉條［10］。膀胱灌注法建模過(guò)程略復(fù)雜，麻醉后對(duì)大鼠行環(huán)磷酰胺膀胱灌注，麻醉期間環(huán)磷酰胺能夠直接作用于膀胱組織，可使藥物在膀胱滯留以維持藥物濃度，對(duì)其他器官的影響少，但由于麻醉2～3 h后大鼠清醒自主排尿，排出大部分藥物，導(dǎo)致建模成功率較低（約50%），對(duì)建模未成功大鼠可繼續(xù)給藥直至建模成功。膀胱灌注組大鼠尿動(dòng)力同腹腔灌注組，而病理改變較腹腔注射稍輕?？赡苡捎诎螂资切迯?fù)能力很強(qiáng)的器官，停止膀胱給藥后，約10 d左右膀胱通過(guò)自我修復(fù)使尿動(dòng)力逐漸恢復(fù)至接近正常，病理改變也較前減輕，因此，需持續(xù)給藥以維持OAB癥狀。雖然膀胱灌注法操作略復(fù)雜，但大鼠存活率高，精神狀態(tài)及活力佳，無(wú)全身毒性癥狀，有助于建模后OAB癥狀的長(zhǎng)期觀察及后期治療等在體研究。

綜上所述，環(huán)磷酰胺膀胱灌注法與腹腔注射法均能建立可靠的OAB動(dòng)物模型，2種環(huán)磷酰胺給藥方法建模各有優(yōu)缺點(diǎn)，宜根據(jù)特定需要選擇相應(yīng)的方法。

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（編輯王又冬）

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：

中圖分類號(hào)R334.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼B

文章編號(hào)0258-4646（2016）07-0587-04

DOI：10.12007/j.issn.0258?4646.2016.07.003

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技部十二五“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)課題（2012ZX09401004）；遼寧省自然科學(xué)基金（20102255）；遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（2012225017）

作者簡(jiǎn)介：段乙南（1989-），女，碩士研究生.

通信作者：夏志軍，E-mail：xiazj@sj?hospital.org

收稿日期：2015-11-12

ConstructionofExperimentalAnimalModelofOveractiveBladderinRatInducedbyCyclophosphamide IntraperitonealInjectionandIntravesicalInstillation

DUANYinan，XIAZhijun，XUHainan
（DepartmentofGynecologyandPelvicFloorDisease，ShengjingHospital，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110004，China）

AbstractObjectiveTo compare the advantages and disadvantages of two methods for rat overactive bladder（OAB）model construction in?duced by intraperitoneal injection and intravesical instillation cyclophosphamide.MethodsA total of 30 female SD rats weighting 200?250 g were randomlycategorized intothreegroups：intraperitoneal injection?induced OAB（Ip?OAB），intravesical instillation?induced group（Iv?OAB）andcon?trolgroup.Ip?OABratswasi.p.administrated cycbophosphe midethreetimesindoseof75mg/kgbodyweight，whileIv?OABratsreceived intravesi?cal instillation three timesin drugdose of 75mg/kg bodyweight.Control group rats received notreatment.Maximum bladder capacity（MBC），maxi?mum voiding pressure（MVP），frequency of spontaneous contraction of each group were recorded.The incidence，the mortality and the pathology of the three groups were compared.ResultsMBC，MVP and frequency of spontaneous contraction between Ip?OAB group and Iv?OAB group had no statisticallysignificantdifference（P＞0.05）.Comparedwiththecontrolgroup，MBCsignificantlyincreased（P＜0.05），MVPsignificantlydecreased （P＜0.05），and frequency of spontaneous contraction significantly increased（P＜0.05）in Ip?OAB and Iv?OAB rats.The modeling success rate and mortality were 100%and 80%in Ip?OAB group，and were 50%and 0%in Iv?OAB group，and pathological changes were found in the two groups. ConclusionThe construction of experimental animal model of OAB in rat induced by intraperitoneal injection and intravesical instillation cyclo?phosphamide are both reliable methods.Ip?OAB rats exhibit high incidence and mortality rate，while Iv?OAB rats show low incidence and mortality rate.

Keywordsoveractive bladder；intraperitoneal injection；intravesical instillation；different methods