24個Y-STR基因座熒光標記復合擴增體系的建立

劉　宏，李　越，劉長暉，劉　超，葛斌文，陳林麗（.廣州市刑事科學技術研究所 廣東省法醫(yī)遺傳學重點實驗室，廣東 廣州 50030；.無錫中德美聯(lián)生物科技有限公司，江蘇 無錫 474）

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24個Y-STR基因座熒光標記復合擴增體系的建立

劉宏1，李越1，劉長暉1，劉超1，葛斌文2，陳林麗2
（1.廣州市刑事科學技術研究所 廣東省法醫(yī)遺傳學重點實驗室，廣東 廣州 510030；2.無錫中德美聯(lián)生物科技有限公司，江蘇 無錫 214174）

摘要：目的 構(gòu)建包含24個Y-STR基因座的熒光標記復合擴增體系。方法 選擇DYS531、DYS630、DYS622、DYS552、DYS510、DYS449、DYS459a/b、DYS446、DYS443、DYS635、DYS587、DYS527a/b、DYS460、Y-GATA-A10、DYS520、DYS557、DYS522、DYS481、DYS570、DYS385a/b、DYS444 24個Y-STR基因座，構(gòu)建熒光復合擴增體系。檢測該體系的特異性、同一性、靈敏度、擴增均衡性、抗干擾性和準確性，調(diào)查其在廣東地區(qū)人群的基因多樣性。結(jié)果 建立的復合擴增體系在檢測的非人類及女性樣本中未發(fā)現(xiàn)譜帶，同一個體不同組織檢測結(jié)果一致，0.1ng以上標準品9948可檢測獲得完整分型結(jié)果。常見抑制物中體系內(nèi)加入120～200μmol/L血紅素、1.5～2.0mmol/L鈣離子時出現(xiàn)等位基因丟失，對靛藍、腐殖酸、EDTA具有較強抗干擾性。通過146例無關個體與Yfiler系統(tǒng)平行檢測比對，24 Y-STR檢測體系分型準確。廣東地區(qū)人群單倍型多樣性（HD）為0.99972，優(yōu)于Yfiler系統(tǒng)（HD=0.99858）。結(jié)論 本研究建立的24個Y-STR基因座熒光標記復合擴增體系法醫(yī)學應用前景廣闊，可用于案件檢驗、親權(quán)鑒定與Y-STR數(shù)據(jù)庫建設。

關鍵詞：法醫(yī)遺傳學；Y染色體；短串聯(lián)重復序列；熒光復合擴增

熒光標記復合擴增檢驗是目前應用最廣泛的檢驗技術之一［1］，基于這一技術開發(fā)的各種商品化試劑盒，如PowerPlex?Y試劑盒與AmpFeSTR?Yfiler?試劑盒（簡稱Yfiler試劑盒）等，已經(jīng)在法醫(yī)DNA檢驗中得到了廣泛應用［2］。但這些試劑盒主要選取歐美人群的推薦基因座進行研發(fā)，其中不少基因座在中國人群中多態(tài)性較低，如在中國人群中的基因多樣性（GD）DYS391小于0.4［3］、DYS438小于0.5［4］，加之基因座數(shù)量少，導致檢驗系統(tǒng)在中國人群中整體識別力低，在

1　材料與方法

1.1樣本及模板制備

種屬特異性檢測樣本：牛、羊、豬、貓、狗、雞、鼠、魚和大腸桿菌樣本（來源于廣州市刑事科學技術研究所科研積累）。性別特異性檢測樣本：女性無關個體血樣10例。個體同一性檢測樣本：同一男性個體取肌肉組織、血痕、口腔拭子共10例。準確性及基因多樣性檢測樣本：男性無關個體血樣146例（在知情同意下取自廣州市刑事科學技術研究所日常檢案）。上述樣本采用Freedom EVO工作站（瑞士Tecan公司）提取DNA［6］。

靈敏度檢測模板制備：取標準品9948（美國Ori-Gene公司）加水稀釋至每份模板含9948分別為1.0、0.5、0.25、0.1、0.05、0.02ng。

抗干擾性檢測模板制備：分5組，向0.5 ng標準品9948中，分別加入血紅素、靛藍、腐殖酸、鈣離子、EDTA等抑制物。模板中抑制物濃度分別為：血紅素80、120、160、200μmoL/L，靛藍500、750、1000μmoL/L，腐殖酸5、10、20 ng/μL，鈣離子1.0、1.5、2.0 mmoL/L，EDTA 0.6、0.8、1.0μmoL/L。

1.2引物序列、熒光標記與引物濃度

Y-STR檢測體系引物序列、引物濃度及熒光標記見表1。熒光標記引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。

表1　24 Y-STR檢測體系引物序列、體系引物濃度、熒光標記及產(chǎn)物片段大小

續(xù)表1

1.3復合擴增體系、擴增程序與電泳檢測

擴增體系組成：PCR緩沖混合液（Tris-HCl buffer 125 mmoL/L，KCl 125 mmoL/L，dNTPs 7.5 mmoL/L、MgCl22.0mmoL/L）10.0μL；引物（濃度0.04～1μmol/L，見表1）5.0μL；熱啟動Taq酶（5U/μL）0.8μL；DNA模板與ddH2O補足至25.0μL。擴增程序：95℃ 11min；94℃ 1min，59℃ 1min，72℃ 1min，30個循環(huán)；60℃60min。擴增產(chǎn)物在3130xl型遺傳分析儀上電泳。

1.4等位基因命名及等位基因分型標準物的制備

使用非熒光標記引物對無關個體樣本進行單基因座擴增，DYS385a/b、DYS527a/b與DYS459a/b雙拷貝基因座等位基因數(shù)為2時，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色后，切取不同片段大小條帶，進行純化回收，對擴增產(chǎn)物進行測序，根據(jù)測序結(jié)果按重復單位的重復次數(shù)命名各等位基因。選取不同等位基因樣本，用熒光標記引物單基因座擴增后混合擴增產(chǎn)物，制成等位基因分型標準物。

1.5準確性檢測與基因多樣性統(tǒng)計分析

對146例廣東地區(qū)男性無關個體，應用本研究建立的24 Y-STR檢測體系與Yfiler試劑盒平行檢測。DYS385a/b、DYS527a/b與DYS459a/b為雙拷貝基因座，分型結(jié)果作為一個單倍型進行統(tǒng)計。比較兩系統(tǒng)共有的DYS365、DYS385a/b基因座分型結(jié)果。用直接計數(shù)法計算各等位基因頻率，基因座第i個等位基因的頻率Pi=第i個等位基因頻數(shù)/n（n為群體樣本數(shù)）。GD及單倍型多樣性（HD），按公式HD=n（1-∑Pi2）/（n-1）計算，n為樣本例數(shù)，Pi為等位基因（或單倍型）頻率。并計算累積GD值（TGD），按公式TGD＝1-（1-GD1）（1-GD2）……（1-GDn）計算，GDn為各基因座的GD值。

2　結(jié)果

2.124 Y-STR檢測體系性能評估

本研究建立的24 Y-STR檢測體系，等位基因分型標準物峰高均衡、明確，等位基因覆蓋完整（圖1）。

特異性檢測結(jié)果：對牛、羊、豬、貓、狗、雞、鼠、魚和大腸桿菌等種屬樣本及女性無關個體樣本檢驗結(jié)果均未檢見譜帶。

個體同一性檢測結(jié)果：對10例男性個體肌肉、血痕、口腔拭子樣本檢測，結(jié)果均獲得相同分型。

靈敏度檢測結(jié)果：標準品9948模板量在0.1～1ng時所有基因座結(jié)果準確、均衡，無非特異性峰，同色熒光RFU值差異小于50%（圖2），0.05、0.02 ng模板量出現(xiàn)等位基因丟失。

抗干擾性檢測結(jié)果：對加入不同抑制物的0.5ng標準品9948進行檢測，除加入血紅素濃度為120～200μmoL/L、鈣離子濃度為1.5～2.0mmoL/L時出現(xiàn)等位基因丟失現(xiàn)象，其他均未出現(xiàn)等位基因丟失。

準確性檢測結(jié)果：通過146例男性無關個體樣本批量檢測，各樣本均能有效、明確獲得目標Y-STR基因座分型，未發(fā)現(xiàn)影響結(jié)果判讀的非特異性峰。與Yfiler試劑盒比對檢測，兩系統(tǒng)在共有的DYS635、DYS385a/b基因座結(jié)果一致，說明24 Y-STR檢測體系結(jié)果準確可信。

2.2系統(tǒng)基因多樣性及與Yfiler系統(tǒng)基因多樣性比較

經(jīng)計算，24 Y-STR檢測體系共得到145種單倍型，其中144種單倍型出現(xiàn)1次，1種單倍型出現(xiàn)2次，GD值為0.55（DYS531）～0.96（DYS385a/b），HD值為0.999 72，TGD值為1-1.88×10-14；Yfiler系統(tǒng)共得到143種單倍型，其中141種單倍型出現(xiàn)1次，1種單倍型出現(xiàn)2次，1種單倍型出現(xiàn)3次，單位點GD值為0.36（DYS389）～0.96（DYS385a/b），HD值為0.998 58，TGD值為1-4.97×10-9；24 Y-STR檢測體系與Yfiler系統(tǒng)聯(lián)用共得到145種單倍型，其中144種單倍型出現(xiàn)1次，1種單倍型出現(xiàn)2次，HD值為0.99972，TGD值為1-1.066×10-20。

3　討論

本研究旨在建立一種針對中國人群的高識別力Y-STR多基因座熒光標記復合擴增體系，作為目前常用商品化試劑盒的補充，以解決在日常Y-STR檢驗過程中遇到的系統(tǒng)識別力低的難題，為大規(guī)模YSTR家系比對數(shù)據(jù)庫的建設提供更多的基因座檢測試劑。因此，該系統(tǒng)既要有較高的識別力來滿足大樣本數(shù)據(jù)庫比對的要求，同時還要性能穩(wěn)定。驗證實驗顯示，本研究建立的24 Y-STR檢測體系種屬及性別特異性好、個體同一性好、檢測靈敏度高，對血紅素、靛藍、腐殖酸、鈣離子、EDTA等常見抑制劑抗干擾性較強，性能穩(wěn)定，結(jié)果可靠，檢測峰值均衡，分型易讀，操作簡單，具有進一步產(chǎn)業(yè)化推廣應用的基礎。

通過對146例男性無關個體的群體遺傳學參數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果表明，針對所檢測的廣東地區(qū)人群，本研究選取的24個Y-STR基因座其遺傳多樣性從整體上要優(yōu)于Yfiler試劑盒17個Y-STR基因座。24 YSTR檢測體系中GD值小于0.7的基因座僅為3個（DYS531、DYS520、Y-GATA-A10）占12.5%，TGD值為1-1.88×10-14，而Yfiler試劑盒所包含的17個Y-STR基因座在相同人群中GD值小于0.7的基因座為10個（DYS439、DYS390、DYS456、DYS389I、DYS19、DYS438、Y-GATA-H4、DYS391、DYS393、DYS437），占58.8%，TGD值為1-4.97×10-9，特別是DYS391、DYS438兩個基因座在所統(tǒng)計人群中GD值僅為0.41和0.36，說明本研究建立的Y-STR檢測體系所選取的基因座針對所統(tǒng)計人群具有更好的基因多樣性，這與本研究的預定目標一致。在相同的人群中本研究建立的24 Y-STR檢測體系共獲得了145種單倍型，多于Yfiler試劑盒獲得的141種單倍型，在人群中具有更高的HD值?？傊?，本研究建立的24 Y-STR檢測體系作為針對中國人群而設計研制的高識別率Y-STR檢測系統(tǒng)比目前最常用的商業(yè)化Yfiler試劑盒，針對所統(tǒng)計的廣東地區(qū)男性人群具有更好的基因多樣性與識別能力，特別是與Yfiler試劑盒聯(lián)用時，有效YSTR檢測數(shù)量可以達到38個，TGD值可以達到1-1.066×10-20，可以應用于法醫(yī)DNA日常檢驗，在YSTR數(shù)據(jù)庫建設上應用前景廣闊。

參考文獻：

［1］王永在，榮遼江，歐拉.法醫(yī)DNA檢驗的現(xiàn)狀及發(fā)展［J］.刑事技術，2005，（2）：28-30.

［2］陳曉輝，李紅霞，葛璐璐.應用Y染色體及常染色體STR檢驗成功串并兩宗命案［J］.中國法醫(yī)學雜志，2007，22（S0）：84.

［3］Tang JP，Hou YP，Li YB，et al.Characterization of eight Y-STR loci and haplotypes in a Chinese Han population［J］.Int J Legal Med，2003，117（5）：263-270.

［4］Dai HL，Wang XD，Li YB，et al.Characterization and haplotype analysis of 10 novel Y-STR loci in Chinese Han population［J］.Forensic Sci Int，2004，145（1）：47-55.

［5］Shi M，Bai R，Yu X，et al.Haplotype diversity of 22 Y-chromosomal STRs in a southeast China population sample（Chaoshan area）［J］.ForensicSciInt Genet，2009，3（2）：e45-e47.

［6］楊電，劉宏，劉超，等.國產(chǎn)磁珠結(jié)合自動化工作站批量提取生物檢材DNA的應用［J］.中國法醫(yī)學雜志，2009，24（6）：404-406.

（本文編輯：李成濤）

中圖分類號：DF795.2

文獻標志碼：A

doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.03.005

文章編號：1004-5619（2016）03-0180-04

基金項目：廣東省法醫(yī)遺傳學重點實驗室資助項目（2010A06 0801001）；廣東省科技計劃資助項目（2013B021500010）

作者簡介：劉宏（1979—），男，碩士，副主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)DNA檢驗和研究；E-mail：79liuhong@163.com

通信作者：劉超，男，博士，主任法醫(yī)師，博士研究生導師，主要從事法醫(yī)遺傳學研究；E-mail：liuchaogzf@163.com實際應用中有局限性，特別是近年隨著Y-STR技術的拓展應用，在很多案件中Y-STR數(shù)據(jù)被用來進行群體和家系排查，現(xiàn)有Y-STR檢測系統(tǒng)識別力不能滿足實際應用需求，也成為建立大區(qū)域Y-STR數(shù)據(jù)庫的瓶頸。因此，研發(fā)一種針對中國人群的高識別力Y-STR檢測新體系十分必要。本研究根據(jù)近年國內(nèi)外的相關報道［5］選取在中國人群中多樣性較高，且等位基因片段長度差距小的DYS531、DYS630、DYS622、DYS552、DYS510、DYS449、DYS459a/b、DYS446、DYS443、DYS635、DYS587、DYS527a/b、DYS460、YGATA-A10、DYS520、DYS557、DYS522、DYS481、DYS570、DYS385a/b和DYS444共24個基因座建立復合擴增檢測系統(tǒng)（簡稱24 Y-STR檢測體系），其中DYS385a/b、DYS527a/b與DYS459a/b為雙拷貝基因座，上述基因座中未包括在現(xiàn)有商品試劑盒體系內(nèi)的基因座有21個，與Yfiler試劑盒體系相同的基因座有3個（DYS635、DYS385a/b）。

收稿日期：（2015-04-03）

Development of a Fluorescence Multiplex Amplification System with 24 Y-STR Loci

LIU Hong1，LI Yue1，LIU Chang-hui1，LIU Chao1，GE Bin-wen2，CHEN Lin-li2
（1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Forensic Genetics，Guangzhou Institute of Forensic Science，Guangzhou 510030，China；2.AGCU ScienTech Incorporation，Wuxi 214174，China）

Abstract：Objective To establish a novel multiplex amplification system which comprises 24 Y-STR loci.Methods Total 24 Y-STR gene loci，concluding DYS531，DYS630，DYS622，DYS552，DYS510，DYS449，DYS459a/b，DYS446，DYS443，DYS635，DYS587，DYS527a/b，DYS460，Y-GATA-A10，DYS520，DYS557，DYS522，DYS481，DYS570，DYS385a/b，DYS444，were chosen for establishing the fluorescence multiplex amplification system.The specificity，identity，sensitivity，balance of the amplification，anti-interference and accuracy of the system were detected and the gene diversity was investigated in the population of Guangdong.Results No band was found in nonhuman and female samples that were tested by the established multiplex amplification system.The same genotyping results were obtained from different tissues of the same person.Complete profiles could be obtained from more than 0.1 ng of the standard sample 9948.The loss of alleles was found when the common inhibitors such as hemoglobin and calcium ion were added 120-200μmol/L and 1.5-2.0mmol/L respectively to the system which with a strong anti-interference to the indigo，humic acid and EDTA.The typing of 24 Y-STR system could give the reliable results when 146 unrelated male individuals were detected and compared with the Yfiler system parallelly.The haplotype diversity（HD）of the population in Guangdong reached 0.999 72 that was better than the result retained from Yfiler system，which the HD was 0.998 58.Conclusion The fluorescence amplification system with 24 Y-STR loci established in present study has a wildly application prospect and can be used for cases inspection，paternity tests and Y-STR database construction.

Key words：forensic genetics；Y chromatosome；tandem repeat sequences；fluorescent multiplex amplification