雞Sepp1基因及其蛋白理化性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)的生物信息學分析

王順利，龐瑞華，黃　英，李永能，李琦華，潘洪彬，楊明華*，趙素梅*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，昆明 650201；(2.河南信陽師范學院生命科學學院，河南 信陽 464000;(3.云南農(nóng)業(yè)大學招生就業(yè)處，昆明 650201)

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雞Sepp1基因及其蛋白理化性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)的生物信息學分析

王順利1，龐瑞華2，黃英1，李永能3，李琦華1，潘洪彬1，楊明華1*，趙素梅1*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，昆明 650201；(2.河南信陽師范學院生命科學學院，河南 信陽 464000;(3.云南農(nóng)業(yè)大學招生就業(yè)處，昆明 650201)

摘要：硒是人和動物生命必需的微量元素，硒的生物學功能是通過硒蛋白來實現(xiàn)的，硒蛋白P(Selenoprotein P,Sepp1)是機體含量最多的硒蛋白。利用生物信息學相關(guān)分析軟件和比較基因組學的方法，對雞Sepp1基因序列和氨基酸序列進行理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征進行分析和預(yù)測，并與豬、人、鼠、羊、狗等物種進行比較。結(jié)果顯示，雞Sepp1的CDS序列和編碼的蛋白質(zhì)與禽類動物相似，但和哺乳類動物之間差別較大；Sepp1的功能特性與硒半胱氨酸含量有關(guān)，不同物種Sepp1中硒半胱氨酸含量存在著差異；雞Sepp1蛋白在第170-200位氨基酸殘基區(qū)域具有特定理化性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)，推測該序列可作為調(diào)控雞Sepp1功能的靶位點。研究結(jié)果為以后深入研究雞Sepp1的機體功能、開發(fā)富集Se的動物功能性食品提供理論參考。

關(guān)鍵詞：Sepp1；雞；生物信息學；理化性質(zhì)；分子結(jié)構(gòu)

硒是人和動物生命必需的微量元素，參與谷胱甘肽(GSHPx)的合成，具有抗氧化損傷的作用。硒的生物學功能是通過硒蛋白來實現(xiàn)的。硒蛋白是硒的轉(zhuǎn)運和貯存形式，硒蛋白中硒以硒半胱氨酸(Sec) 和硒蛋氨酸(Se-Met)的形式存在，前者的結(jié)合具有特異性，后者為非特異性結(jié)合。到目前為止發(fā)現(xiàn)硒蛋白家族達25種，其中硒蛋白P(Sepp1)是機體血漿中最主要的硒存在方式[1]。

Sepp1是一種細胞外糖蛋白[1]，由硒元素和蛋白以硒半胱氨酸(Sec)的方式結(jié)合而成，每個肽鏈含有10-12個Sec殘基[2]。Sepp1主要由肝細胞合成，此外腦星形膠質(zhì)細胞、小腦顆粒細胞、橫紋肌細胞也可以產(chǎn)生，然后分泌到外周血中，將硒運輸?shù)狡渌M織供其利用，合成其他種類的硒蛋白[3-6]。Sepp1最早在大鼠血漿中被發(fā)現(xiàn)，后經(jīng)大量實驗研究發(fā)現(xiàn)，Sepp1在人和動物的多個組織中均有表達，例如：肝、心、腸、腎等[7-9]。由于近些年對雞Sepp1的功能及實際應(yīng)用尚未見到深入系統(tǒng)的報道，所以本文利用生物信息學的方法對雞Sepp1基因及其蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)進行分析，為雞Sepp1蛋白的功能研究奠定理論基礎(chǔ)，為開發(fā)富集Se 的雞蛋和肉類等動物功能性特色產(chǎn)品提供理論指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1不同物種Sepp1的編碼序列和氨基酸的獲取

利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得雞、豬、人、鼠、羊和狗的Sepp1編碼和氨基酸登錄號 (見表1)。

表1　6個物種的Sepp1編碼和氨基酸登錄號

1.2構(gòu)建Sepp1蛋白的系統(tǒng)進化樹

利用Ensembl(http://www.ensembl.org/index.html)數(shù)據(jù)庫選取12種物種相應(yīng)的同源基因，利用BioEdit軟件對上述不同動物基因氨基酸序列進行比對分析，構(gòu)建物種之間的系統(tǒng)進化樹。12個物種蛋白編碼登錄號(見表2)。

表2　12個物種蛋白編碼登錄號

1.3雞Sepp1基本性質(zhì)分析

利用在線分析軟件ExPaSy(http://www.expasy.ch/tools/)中的ProtParam和Computer pl/MW以及 ProScale軟件對該編碼蛋白質(zhì)進行基本性質(zhì)分析，并與豬、人、鼠、羊、狗的Sepp1蛋白進行比較。

1.4雞Sepp1信號肽的預(yù)測

利用在線分析軟件SignalP 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)[10]對雞Sepp1的信號肽區(qū)域進行了分析。

1.5 雞Sepp1磷酸化位點的預(yù)測

利用在線預(yù)測軟件NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)[11]進行磷酸化位點預(yù)測，利用Scansite(http://scansite.mit.edu/)[12]分析雞Sepp1基因編碼蛋白中易于被特定蛋白酶磷酸化的位點。

1.6雞Sepp1糖基化位點的預(yù)測

利用在線預(yù)測軟件NetNGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)，對雞的Sepp1進行糖基化位點的預(yù)測。

1.7 雞Sepp1跨膜分析

利用TMHMM2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)[13]跨膜結(jié)構(gòu)分析軟件，分析Sepp1蛋白跨膜區(qū)，并與豬、人、鼠、羊、狗的進行比較分析。

1.8雞Sepp1蛋白質(zhì)卷曲螺旋預(yù)測

利用COILS(http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html)[14]工具分析卷曲螺旋，并與豬、人、鼠、羊、狗的Sepp1蛋白進行比較。

2結(jié)果與分析

2.1Sepp1基因比較及其系統(tǒng)進化樹建立

2.1.1不同物種Sepp1編碼區(qū)序列同源比對

不同物種間Sepp1的CDS序列在DNAMAN軟件分析中，發(fā)現(xiàn)雞與豬Sepp1編碼區(qū)序列的同源性較高(見表3)，達到52.7%，與羊的同源性最低，為48.3%，鼠、人和狗居中，分別為50.5%、51.2%和52.4%?？梢钥闯?，雞Sepp1與其他物種的同源性不高，而其他物種之間同源性都相對較高，在65.3%～80.3%。

表3　雞與其他物種編碼區(qū)(CDS)序列比例

2.1.2不同物種Sepp1蛋白進化樹

選取12個物種構(gòu)建系統(tǒng)蛋白進化樹，結(jié)果顯示雞與鴨和狗的親緣關(guān)系較近，與羊的親緣關(guān)系最遠(見圖1)。雞和鴨的關(guān)系最近，表明Sepp1在禽類中遺傳和表達差異較小。

2.2Sepp1的基本性質(zhì)分析

利用ExPaSy軟件包中的ProtParam、Computer pl/MW工具，對雞Sepp1基因編碼蛋白質(zhì)進行氨基酸組成、分子質(zhì)量、等電點等基本性質(zhì)的分析。雞Sepp1基因CDS序列長位1 149 bp，編碼的蛋白質(zhì)

由384個氨基酸組成，分子量大44 661.8 Da，理論等電點為6.24。在統(tǒng)計雞Sepp1分子氨基酸組成發(fā)現(xiàn)，亮氨酸(Leu)含量最高，甲硫氨酸(Met)的含量最低。將不同物種Sepp1氨基酸組成比較發(fā)現(xiàn)，它們的氨基酸組成中都含有20種常見的氨基酸，除苯丙氨酸(Phe)和谷氨酰胺(Gln)的比例差別不大，其他氨基酸組成成分均有較大差異(見圖2)。

圖1　不同物種Sepp1蛋白進化樹

不同種屬硒代半胱氨酸(Sec)含量和比例存在差異(見圖3)。雞Sepp1含有13個Sec，含量為3.3%；狗Sepp1含有15個Sec，含量為3.8%；羊Sepp1含有0個Sec，含量為0%；豬Sepp1含有14個，含量為3.6%；鼠和人Sepp1含有10個Sec，在機體中含量分別為2.6%和2.4%。

運用 ProScale軟件對雞、狗、牛、人、鼠和豬的Sepp1蛋白進行親水/疏水性分析，繪制疏水性曲線(見圖 4)。正值疏水，負值親水，介于+0.5到-0.5之間的為兩性氨基酸。對所有物種Sepp1蛋白質(zhì)親疏水性比較，總體來看，Sepp1是親水性蛋白。同時發(fā)現(xiàn)所有氨基酸序列在1-20位之間都是極具疏水性的，而200-250位都是極具親水性的。200-250區(qū)域靠近N端的末尾，對這51個氨基酸組成進行分析，發(fā)現(xiàn)雞的親水性氨基酸有31個、豬23個、人有24個、鼠有26個、羊有23個、狗有20個；疏水氨基酸分別為雞10個、豬19個、人18個、鼠15個、羊20個、狗17個。從統(tǒng)計數(shù)據(jù)來看，雞在這一區(qū)域的親水性要比其他物種強。

圖3　不同物種Sec含量和比例差異

圖4　不同物種Sepp1親水/疏水曲線

2.3Spoet的信號肽分析

利用SignalP 4.0分析發(fā)現(xiàn)雞Sepp1的氨基酸序列在第21-22位存在裂解位點，說明雞Sepp1具有信號肽結(jié)構(gòu)(見圖5)。

圖 5　雞Sepp1信號肽分析

2.4Sepp1的磷酸化位點

利用NetPhot 分析發(fā)現(xiàn)，雞Sepp1編碼蛋白有12個 Ser、1個 Thr和 3個Tyr可能是磷酸化位點(見圖6)，真正的磷酸化位點還需要進一步通過實驗來確認。

同時，利用Scansite分析的 motif，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)序列中易于被特定蛋白酶磷酸化的位點，結(jié)果顯示：該蛋白含有1種Src同源群2(SH2)、1種嗜堿性絲氨酸-蘇氨酸激酶群(Baso-ST-kin)、有1種激酶結(jié)合位點群(Kin-bind)、還有1種DNA損傷激酶組(DNA-dam-kin)(見圖7)。

2.5Sepp1的糖基化分析

分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞Sepp1有3個典型的N糖基化位點，分別位于第79、170、184位(見圖8)。

2.6Sepp1的跨膜分析

利用TMHMM2.0分析，發(fā)現(xiàn)雞、豬、人、鼠、羊和狗的Sepp1基因編碼殘基的所有氨基酸都位于細胞膜的表面(見圖9)，與蛋白的疏水性區(qū)域結(jié)果分析基本一致，表明該蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)。

圖6　雞Sepp1序列中磷酸化位點*

*彩圖見電子版(http://swxxx.alljournals.cn/ch/login.aspx)(2016年第2期doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2016.02.04)。

圖7　雞Sepp1序列中易于被特定蛋白酶磷酸化位點*

*彩圖見電子版(http://swxxx.alljournals.cn/ch/login.aspx)(2016年第2期doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2016.02.04)。

圖8　雞Sepp1序列中糖基化位點i*

*彩圖見電子版(http://swxxx.alljournals.cn/ch/login.aspx)(2016年第2期doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2016.02.04)。

圖9　不同物種Sepp1跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果*

2.7Sepp1基因編碼蛋白的卷曲螺旋分析

利用在線工具COILS預(yù)測Sepp1蛋白卷曲螺旋結(jié)構(gòu)(見圖10)，比較可以看出不同物種的卷曲螺旋數(shù)量存在差異，在50-150位氨基酸序列，都存在一個較大的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，相區(qū)別的是雞Sepp1在靠近第200位殘基的位置還存在一個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。

圖10　不同物種Sepp1卷曲螺旋分析*

3討論

在人體和動物體內(nèi)硒以活性硒蛋白形式發(fā)揮生理功能。Sepp1所含Se大約占血漿中全部Se濃度的50%以上，是機體血漿中最主要的硒存在方式。據(jù)報道[15]，不同哺乳動物種屬中Sepp1蛋白氨基酸序列有62%～87%的同源性。本研究結(jié)果表明，雞Sepp1的cDNA全長1 149bp，編碼384個氨基酸。雞Sepp1的CDS序列與其他物種(羊、鼠、狗、人和豬)的同源性為48.3%～52.7%，而其他哺乳動物之間同源性相對較高為65.3%～80.3%。Sepp1蛋白系統(tǒng)進化樹的研究結(jié)果總體與CDS序列分析結(jié)果相似，唯一區(qū)別的是狗和豬跟雞的距離關(guān)系略有差異，這可能跟在Ensembl數(shù)據(jù)庫中找到的物種間氨基酸序列和在NCBI上找到編碼區(qū)氨基酸序列的長度以及氨基酸數(shù)量不盡相同有關(guān)。同時蛋白系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明，雞與鴨和狗的親緣關(guān)系較近，與羊的親緣關(guān)系最遠。雞和鴨的關(guān)系最近，表明Sepp1在禽類中遺傳和表達差異較小?？傊?，Sepp1的CDS序列和蛋白質(zhì)在禽類動物和哺乳類動物之間有一定的差別。

硒蛋白中的硒以硒代半胱氨酸的形式出現(xiàn)，一般的硒蛋白只含有一個硒代半胱氨酸，而Sepp1至少含有10個硒半胱氨酸[16]。哺乳動物硒蛋白mRNA在3’非翻譯區(qū)(3’UTR)都有一個SeCys摻入多肽鏈中所必需的穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)稱為SECIS[17]。編碼雞Sepp1蛋白含有13個Sec，含量為3.3%；狗Sepp1含有15個Sec，含量為3.8%；羊Sepp1含有0個Sec，含量為0%；豬Sepp1含有14個，含量為3.6%；鼠和人Sepp1含有10個Sec，在機體中含量分別為2.6%和2.4%。氨基酸中硒代半胱氨酸所占比例的多少，會影響到微量元素硒在機體內(nèi)吸收、轉(zhuǎn)運、貯存和利用。有研究報道[16]，不同種屬的Sepp1可含有10～17個Sec，人、小鼠、大鼠Sepp1含有10個Sec，牛含有12個Sec，石斑魚含有17個Sec。而本研究表明，雞Sepp1含有13個Sec，含量為3.3%；狗Sepp1含有15個Sec，含量為3.8%；羊Sepp1含有0個Sec，含量為0%；豬Sepp1含有14個，含量為3.6%；鼠和人Sepp1含有10個Sec，在機體中含量分別為2.6%和2.4%。不同種屬中Sec位置高度保守，第一個Sec位于N端。因此，可以推測，雞Sepp1的功能特性與硒代半胱氨酸的數(shù)目和含量密切有關(guān)。

信號肽是蛋白質(zhì)的一個序列片段，信號肽的功能是引導(dǎo)核糖體定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一個通道上，使核糖體附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，并將不斷伸長的蛋白質(zhì)鏈穿透通過通道，隨后信號肽被切割下來，合成完成的蛋白質(zhì)被釋放進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，蛋白最后被轉(zhuǎn)運到胞外[18]。編碼信號肽序列只有疏水性強一些，才能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)順利的引入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。本研究利用生物信息學軟件對各物種的Sepp1的信號肽序列分析發(fā)現(xiàn)，Sepp1在N端前有一段序列為編碼信號肽序列(Sig-Peptide)。同時對所有物種Sepp1親疏水性比較顯示，Sepp1是親水性蛋白，但在1～20位氨基酸極具疏水性的。這表明Sepp1的前端序列屬于信號肽，具有疏水性。在Sepp1 200-250區(qū)域靠近N端的末尾，對這51個氨基酸組成進行分析，發(fā)現(xiàn)雞的親水性氨基酸有31個高于其他物種；疏水氨基酸雞為10個低于其他物種。該結(jié)果表明，雞Sepp1在這一區(qū)域的親水性要比其他物種強。

蛋白質(zhì)的磷酸化是通過酶促反應(yīng)把磷酸基團從一個化合物轉(zhuǎn)移到另一個化合物上的反應(yīng)過程，是生物體內(nèi)存在的一種普遍的酶活性調(diào)節(jié)方式，在細胞信號的傳遞過程中占據(jù)著極其重要的地位。SH2結(jié)構(gòu)域能特異性是被磷酸化的酪氨酸和C端區(qū)的3-6個氨基酸殘基[19]，是酪氨酸激酶信號傳導(dǎo)通路的重要組成結(jié)構(gòu)之一[20]。DNA-PK的表達及其結(jié)合活性與腫瘤疾病有密切的關(guān)系，與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)性，DNA-PK可能成為腫瘤治療新的靶點[21]。本研究的結(jié)果表明，雞Sepp1蛋白含有1個特有Src同源群2(SH2)，1個DNA損傷激酶組(DNA-dam-kin)。該結(jié)果還需要后續(xù)進行實驗驗證，但初步提示Sepp1蛋白的這些位點或許可作為調(diào)控其活性的靶點。

蛋白糖基化是指在蛋白質(zhì)翻譯后進行的修飾過程，在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下把活化的單糖加到合成的蛋白質(zhì)肽鏈上的過程。在連接反應(yīng)的過程中，會出現(xiàn)三種糖基化形式：分別為N-糖苷(N-glycan)、O-糖苷(O-glycan)、糖基磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidylinositol, GPI)[22]。Sepp1是一種細胞外的糖蛋白，在人和大鼠Sepp1序列中分別有6個和5個潛在的糖基化位點，其中2個糖基化位點是保守的。本研究通過對比分析，發(fā)現(xiàn)各物種的Sepp1的N糖基化位點大部分都位于N端區(qū)。有研究發(fā)現(xiàn)[4]，Sepp1的N端區(qū)具有酶活性，糖基化位點在這一區(qū)域集中出現(xiàn)，預(yù)示著糖基化修飾作用可能與蛋白的酶活性有關(guān)。

跨膜結(jié)構(gòu)域是橫跨膜內(nèi)和膜外的一段蛋白質(zhì)序列，是膜內(nèi)在蛋白與膜脂相結(jié)合的主要部位，它固著于細胞膜上起錨定作用，一般由20個左右的疏水氨基酸組成。本研究的分析結(jié)果顯示，不同物種Sepp1氨基酸序列均未發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)域，推測可能是由于Sepp1蛋白含有較多的親水氨基酸的緣故。

由Crick在1953年提出的卷曲螺旋( Coiled-Coil，CC)結(jié)構(gòu)，主要存在于多種天然蛋白質(zhì)中，是一類由兩股或兩股以上右手α螺旋相互纏繞而形成的平行或反平行左手超螺旋結(jié)構(gòu)的總稱[23]。Sepp1有轉(zhuǎn)運硒的功能，對微量元素硒的運輸發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。因此，有必要對其卷曲螺旋結(jié)構(gòu)進行信息學分析[24]。本研究比較不同物種Sepp1的卷曲螺旋數(shù)量表明，在50-150位氨基酸中，都存在一個較大的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，相區(qū)別的是雞Sepp1在靠近第200位殘基的位置還存在一個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。而且前在大致170-200位氨基酸之間，雞Sepp1均存在磷酸化位點和糖基化位點，可以推論雞的這個螺旋結(jié)構(gòu)可以作為一些靶蛋白的作用區(qū)域。

4結(jié)論

利用多種生物信息學軟件分析了雞Sepp1基因同豬、人、鼠、羊、狗的CDS同源性比對，預(yù)測了編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成特點、理化性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)Sepp1的CDS序列和編碼的蛋白質(zhì)在禽類動物和哺乳類動物之間有一定的差別。(2)Sepp1的功能特性與硒半胱氨酸含量有關(guān)，不同物種Sepp1中硒半胱氨酸含量存在著差異，因此，不同物種Sepp1的功能可能存在差異。(3)對雞Sepp1蛋白的糖基化位點、磷酸化位點、疏水性以及卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的研究表明，在第170-200位氨基酸殘基區(qū)域具有特定理化性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)，推測該序列可作為調(diào)控Sepp1功能的靶位點。該研究結(jié)果將為進一步研究Sepp1的功能及其與它的特殊功能性，以及與其他蛋白相互作用的機制提供了生物信息學參考，也為進一步探究硒Sepp1在家禽中所起到的作用提供幫助，為通過調(diào)控活性位點開發(fā)富集Se的動物功能性產(chǎn)品提供新的思路和途徑。

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Bioformatic analysis of chickenSepp1 gene and its protein property and ptructure

WANG Shunli1，PANG Ruihua2，HUANG Ying1，LI Yongneng3，LI Qihua1，PAN Hongbin1，YANG Minghua1*，ZHAO Sumei1*

(1.YunnanKeyLabofAgriculturalAnimalNutritionandFeedScience,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201，China;(2.CollegeofLifeScience,HeNanXinyangNormalUniversity,XinyangHenan464000,China;(3.AdmissionandEmploymentOffice,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China)

Abstract：Selenium is the life essential trace elements for human and animal. The biological function of selenium is exerted through selenoproteins. Selenoprotein P (selenoprotein P, sepp1) is the maximum content of selenoprotein in body. In this study, the characteristics of chicken Sepp1 gene sequence and amino acid sequence were analyzed and predicted as well as were compared with that of pig, human, rat, sheep, dog and other species by bioinformatics analysis software and comparative genomics method. The results showed the similar chicken Sepp1 CDs sequence and coding protein among poultry animals, but big difference among mammalian animals. Chicken Sepp1 functional properties were related to Sec content. Variant Sec of Sepp1 content exist difference among species. The 170 to 200 amino acid residues region of chicken sepp1 protein with specific physicochemical properties and molecular structure suggests that the sequence could be regarded as the target regulation site of selenoprotein P. The results would provide theoretical basis for further study on body functions of chicken selenoprotein P and development the functional animal food of Se enrichment.

Keywords：Sepp1;Chicken; Bioinformatics;Physicochemical properties; Molecular structure

收稿日期：2016-01-26；修回日期：2016-03-13.

基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(No.2011AA100305)。

作者簡介：王順利，男，碩士，研究方向：動物分子營養(yǎng)與代謝調(diào)控；E-mail:895718696@qq.com. *通信作者：楊明華，女，講師，碩士，研究方向：動物分子營養(yǎng)與代謝調(diào)控；E-mail:11612058476@qq.com; 趙素梅，女，教授，博士,研究方向：動物分子營養(yǎng)與代謝調(diào)控；E-mail:zhaosm2009@126.com.

doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2016.02.04

中圖分類號：Q343.3+1

文獻標志碼：A

文章編號：1672-5565(2016)02-084-11