虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥病毒的分離和鑒定

李寶玉，吳鵬程，范玉峰（.蘭州威特森生物科技有限公司，甘肅　蘭州　73000；.蘭州市漁業(yè)技術(shù)推廣中心，甘肅　蘭州　73000）

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虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥病毒的分離和鑒定

李寶玉1，吳鵬程2，范玉峰2
（1.蘭州威特森生物科技有限公司，甘肅蘭州730010；2.蘭州市漁業(yè)技術(shù)推廣中心，甘肅蘭州730020）

摘要：本試驗從甘肅永登爆發(fā)疫情的虹鱒魚養(yǎng)殖場共采集了四次病料，分離出1株優(yōu)勢毒株，對新分離的毒株進(jìn)行培養(yǎng)增殖，在EPC細(xì)胞上增殖良好，且可引起良好的病變；根據(jù)IHNV的保守基因N基因序列，設(shè)計特異性引物，結(jié)果擴(kuò)增出786 bp的片段。對該片段進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)與IHNV的參考序列有較高的相似性，證實該毒株為傳染性造血器官壞死癥病毒。結(jié)果表明傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）在永登虹鱒魚中的存在與傳播，本研究為我國北方地區(qū)IHN疫情動態(tài)監(jiān)測和防控提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：IHNV；虹鱒魚；分離；鑒定

傳染性造血器官壞死癥（Infectious Hematopoietic Necrosis IHN）是彈狀病毒科的虹鱒傳染性造血器官壞死癥病毒（Infectious Hematopoietic Necrosis virus IHNV）引起的分布廣泛、死亡率高、危害極大的鮭科魚類病毒性傳染病。該病1985年開始在我國東北地區(qū)各養(yǎng)蹲場陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，目前有蔓延和加劇的趨勢，對養(yǎng)鱒業(yè)造成了毀滅性打擊［1、2］。近幾年，我國每年從國外引進(jìn)大批的鮭魚魚卵，但因檢疫技術(shù)的不完善，致使危害嚴(yán)重、傳播力強(qiáng)、防治困難的傳染性造血器官壞死癥傳入我國并蔓延開來，使正在發(fā)展中的我國虹鱒養(yǎng)殖業(yè)留下了無窮禍患和潛在危機(jī)。

近年來省內(nèi)的虹鱒魚養(yǎng)殖場大多從外省購進(jìn)發(fā)眼魚卵自行孵化魚苗，當(dāng)上浮稚魚攝食一月左右時大面積爆發(fā)疫情，表現(xiàn)為病稚魚體發(fā)黑，游動遲緩，隨水漂流，有時出現(xiàn)痙孿動作，有時一邊翻滾、一邊漂流，或靜臥池底或狂游沉入池底而死亡，腹部膨大，有淤血斑，肌肉“V”字型或線型出血，尾柄充血，腹鰭基部和肛門周圍充血，有的在肛門拖著長而不透明的白色糞便，死亡率達(dá)90%以上，對虹鱒魚的養(yǎng)殖造成毀滅性打擊，我省境內(nèi)的大多數(shù)虹鱒魚養(yǎng)殖場處于停產(chǎn)狀態(tài)。為保障我市、我省乃至我國的養(yǎng)鱒業(yè)得到快速、健康的發(fā)展，對IHN疫情進(jìn)行監(jiān)測具有很重要的現(xiàn)實意義。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要材料及試劑患病魚是2013年8月采自甘肅永登虹鱒魚養(yǎng)殖場（體重約為20 g）；M199培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清購自杭州四季青生物工程公司；RNA提取試劑盒、PCR試劑盒均購自大連TaKaRa有限公司；pMD18-T載體、感受態(tài)細(xì)胞DH5α、DL-2000、質(zhì)粒提取試劑盒等均為TaKaRa公司產(chǎn)品；鯉魚上皮瘤細(xì)胞（EPC）購自中國動物檢疫研究所；其余試劑均為分析純產(chǎn)品。

1.1.2引物根據(jù)已發(fā)布IHNV的保守基因N基因序列設(shè)計特異性引物，序列為：

利用該特異性引物預(yù)期擴(kuò)增出大小為786 bp的片段，引物終濃度均為20μmol/L。

1.2實驗方法

1.2.1傳染性造血器官壞死癥病毒的分離

1.2.1.1組織病料的處理用組織研磨機(jī)將采集的病料組織樣品（包括腦、肝、胰腺、脾和腎）勻漿，然后用含有雙抗的M199細(xì)胞培養(yǎng)液按1：10的稀釋度制備成組織懸浮液，于4℃過夜孵育。7 000 r/min離心15 min，收集上清液。

1.2.1.2病毒在敏感細(xì)胞上的增殖將上清液用0.45μ的濾膜過濾除菌，然后接種生長狀態(tài)良好的EPC單層細(xì)胞，20℃吸附1 h后，加入含2%胎牛血清的細(xì)胞維持液，置于20℃低溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞感染病毒后出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）后收集細(xì)胞培養(yǎng)物備用。

1.2.2傳染性造血器官壞死癥病毒的RT-PCR鑒定

1.2.2.1IHNV基因組RNA的提取和cDNA模板的合成用RNA提取試劑盒從有明顯病變的細(xì)胞培養(yǎng)物中提取IHNV基因組作為模板，在PCR管中加入20μL模板溶液和2μL引物IHNS，加8μL DEPC水至總體積為30μL，置于70℃水浴反應(yīng)5 min后立即冰浴然后反應(yīng)管中繼續(xù)加入：10μL 5倍逆轉(zhuǎn)錄酶濃縮緩沖液、5μL dNTP、1μL RNA酶抑制劑（20U）、2μL逆轉(zhuǎn)錄酶AMV（10IU），最后加DEPC水定容至50μL，混勻后42℃反應(yīng)60 min，合成模板cDNA。

1.2.2.2N基因的擴(kuò)增用1.2.2.1合成的cDNA作為模板，加入模板和上、下游引物進(jìn)行N基因的擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50μL，反應(yīng)條件：94℃4 min后，變性94℃1 min，55℃退火1 min，72℃延伸 1 min；，30次循環(huán)，最后72℃引伸10 min。

1.2.1.3擴(kuò)增片段序列分析將PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測定、分析，與GENBANK中已登錄的IHNV序列進(jìn)行比較分析。

2　結(jié)果與分析

2.1IHNV在EPC細(xì)胞上的增殖

將采集的病料組織經(jīng)研磨、浸毒和過濾等處理后接種生長兩天的EPC細(xì)胞，在14℃條件下盲傳，傳至第三代五天就可出現(xiàn)典型的病變。（見圖1、見圖2）

圖1　正常的EPC細(xì)胞接種

圖2　IHNV五天后的EPC病變細(xì)胞

2.2從EPC細(xì)胞傳至第五代出現(xiàn)明顯病變后收集的細(xì)胞毒中提取總RNA，用設(shè)計的一對特異性引物經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出大小786 bp的片段，結(jié)果與預(yù)期相符。（見圖3）

2.3將PCR擴(kuò)增的IHNV核蛋白基因產(chǎn)物純化回收，克隆于pMD18-T載體中，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，將提取的陽性質(zhì)粒測序，序列分析結(jié)果顯示目的片段為IHNV部分核蛋白基因，與發(fā)布于NCBI上編號為J04321和IHU50402的核蛋白基因序列的相似性為98.6%和97.2%。

圖3　M為DL-2000 Marker 1、2、3為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用于鑒定IHNV的部分核蛋白基因RT-PCR產(chǎn)物的電泳圖

3　討論

我國是漁業(yè)生產(chǎn)大國，水生動物貿(mào)易在我國進(jìn)出口貿(mào)易中占有重要的地位。但是近年來，從國內(nèi)到國外，水生動物養(yǎng)殖病害普遍加重，嚴(yán)重威脅著漁業(yè)經(jīng)濟(jì)的健康發(fā)展。甘肅冷水資源豐富，是我國虹鱒魚養(yǎng)殖大?。?、4］，但由于近年來IHN持續(xù)爆發(fā)和流行，對養(yǎng)鱒也造成了毀滅性打擊，絕大多數(shù)虹鱒魚養(yǎng)殖場處于停產(chǎn)狀態(tài)。目前為止我國對IHN的研究還比較少，尚未有該病毒檢測方法的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和國家標(biāo)準(zhǔn)，國內(nèi)外也沒有防控該病的疫苗上市，現(xiàn)有的DNA疫苗處于研發(fā)階段［5］。

國外對感染IHNV的病魚采取的措施是全部消毀，養(yǎng)殖場地和設(shè)備進(jìn)行全面消毒。在我國，對于養(yǎng)殖者來說，只考慮當(dāng)前的經(jīng)濟(jì)損失，不考慮長遠(yuǎn)利益，僅僅是想辦法推遲和減輕病魚的死亡，致使IHN傳播范圍愈來愈廣泛。加上IHNV非常穩(wěn)定，對外界環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗力，IHN流行停止后幸存魚群處于帶毒狀態(tài)，這些病毒攜帶者通過排泄物散毒，其卵和精液也帶有IHNV，使養(yǎng)殖環(huán)境持續(xù)處于污染狀態(tài)。因此，對IHN的流行病學(xué)調(diào)查、快速檢測及防治愈發(fā)顯得重要。

參考文獻(xiàn)：

［1］牛魯琪，趙志壯.東北地區(qū)虹鱒IHN和IPN流行病學(xué)的初步研究［J］.水產(chǎn)學(xué)報，1988，（12）：327-331.

［2］趙志壯，牛魯琪.中國本溪虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥（IHN）的初步研究［J］.鮭鱒漁業(yè)，1991（4）：5-6.

［3］羅浩亮.甘肅金鱒養(yǎng)殖技術(shù)研究［J］.水產(chǎn)養(yǎng)殖，2007（11）：8-9.

［4］劉陽河.甘肅省鮭鱒魚養(yǎng)殖現(xiàn)狀與發(fā)展途徑［J］.甘肅農(nóng)業(yè)科技，2004（10）：51-52.

［5］Kurath G，Garver KA.Protective immunity and lack of histopathological damage two years after DNA vaccination against infectious hematopoietic necrosis virus in trout［J］.Vaccine，2006，24（3）：345-54.

中圖分類號：S965.122

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：

文章編號：1006-799X（2015）02-0035-02

作者簡介：李寶玉（1973-），男，甘肅岷縣人，助理研究員，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)。