血糖波動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠氧化應(yīng)激及神經(jīng)病變的影響

馬香香　李亞坤　陳慧曉　趙志剛

(鄭州大學(xué)人民醫(yī)院 內(nèi)分泌科　河南 鄭州　450003)

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血糖波動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠氧化應(yīng)激及神經(jīng)病變的影響

馬香香李亞坤陳慧曉趙志剛

(鄭州大學(xué)人民醫(yī)院 內(nèi)分泌科河南 鄭州450003)

【摘要】目的研究血糖波動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠神經(jīng)病變的影響及氧化應(yīng)激的作用。方法將SD大鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組(NC組)、穩(wěn)定高血糖組(DS組)、波動(dòng)高血糖組(DF組)。采用鏈脲佐菌素腹腔注射誘發(fā)糖尿病，DF組每天定時(shí)腹腔注射胰島素及葡萄糖，建立血糖波動(dòng)模型，同時(shí)DS組給予等體積的生理鹽水建立穩(wěn)定高血糖模型。12周后測(cè)定坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度(MNCV)，檢測(cè)血清丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)。 結(jié)果與NC組比較，DS組和DF組大鼠坐骨神經(jīng)MNCV減慢(P<0.05)，血清MDA增高、GSH水平下降(P<0.05)；與DS組相比，DF組MNCV進(jìn)一步減慢(P<0.05)，MDA增高、 GSH水平下降(P<0.05)。結(jié)論波動(dòng)高血糖可使糖尿病大鼠神經(jīng)病變加重，其機(jī)制可能與氧化應(yīng)激水平增高有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】血糖波動(dòng)；神經(jīng)病變；氧化應(yīng)激

糖尿病神經(jīng)病變作為糖尿病并發(fā)癥之一，是主要的致殘?jiān)?，?yán)重影響患者的生存質(zhì)量，發(fā)病機(jī)制尚未明確[1]。以往研究多針對(duì)慢性持續(xù)性高血糖的作用，而關(guān)于波動(dòng)性高血糖對(duì)神經(jīng)損傷的報(bào)道仍屬少見(jiàn)，且主要是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及臨床觀察[2-3]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)血糖波動(dòng)較持續(xù)性高血糖雪旺細(xì)胞氧化應(yīng)激水平表達(dá)增高，細(xì)胞凋亡指數(shù)更高[2]。為此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立糖尿病血糖波動(dòng)模型，通過(guò)檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，探討血糖波動(dòng)對(duì)糖尿病神經(jīng)病變的影響及可能機(jī)制，為臨床選取平穩(wěn)降糖模式，避免血糖波動(dòng)提供基礎(chǔ)證據(jù)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組選擇無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)SD雄性大鼠60只，200 g左右，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組，n=16)和模型組(MC組，n=44)，模型組腹腔注射STZ 60 mg/kg，建立糖尿病模型，72 h后測(cè)隨機(jī)血糖，>16.7 mmol/L表示糖尿病造模成功。將糖尿病模型組隨機(jī)分為持續(xù)高血糖組(DS組，n=20)和血糖波動(dòng)組(DF組，n=20)。DF組于每天(8:30 am，14:30 pm)腹腔注射葡萄糖液2.5 g/kg。于每天(9:00 am，15:00 pm)腹腔注射胰島素3 U制備糖尿病血糖波動(dòng)大鼠模型，NC組和DS組均同時(shí)腹腔注射等量生理鹽水。于12周后頸內(nèi)靜脈取血分離血清，用于血清學(xué)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器STZ(美國(guó)Sigma公司)；谷胱甘肽(glutathione，GSH)、丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde，MDA)、大鼠糖化血紅蛋白測(cè)定試劑盒(南京建成生物研究所)；血糖儀、血糖試紙(拜安康)；NTS-2000肌電圖與誘發(fā)電位儀(上海諾誠(chéng)醫(yī)療器械有限公司)。

1.3血糖及糖化血紅蛋白測(cè)定血糖波動(dòng)組造模成功后，每周檢測(cè)1 d 7個(gè)時(shí)間點(diǎn)血糖，分別是(08:30、09:00、11:00、14:30、15:00、17:00、22:00)。12周末頸內(nèi)靜脈采血測(cè)糖化血紅蛋白。

1.4氧化應(yīng)激標(biāo)志物的檢測(cè)血糖波動(dòng)組造模12周后，頸內(nèi)靜脈取血分離血清，MDA、GSH含量嚴(yán)格按照試劑盒測(cè)定。

1.5坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度測(cè)定血糖波動(dòng)組造模12周后，測(cè)大鼠坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度(motor nerve conduction velocity，MNCV)。方法：麻醉大鼠，固定四肢，分離坐骨神經(jīng)，采用肌電圖與誘發(fā)電位儀測(cè)量坐骨神經(jīng)MNCV。

2結(jié)果

2.1一般情況大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后禁食12 h，注射STZ(60 mg/kg)后，72 h內(nèi)4只大鼠死亡，余存活的40只大鼠隨機(jī)分為DS組20只，DF組20只。12周后NC組大鼠精神好、毛發(fā)光潔、攝食攝水量正常；DF和DS組大鼠均出現(xiàn)多飲多食多尿，毛亂無(wú)光澤，萎靡消瘦；DF組較DS組大鼠活動(dòng)更少，更加消瘦；12周后DF組余16只；持續(xù)余17只，12周后3組大鼠體質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　血糖波動(dòng)12周大鼠體質(zhì)量及HbA1C水平比較±s)

注：與NC組比較，aP<0.05；與DS組比較，bP<0.05，cP>0.05。

2.2血糖波動(dòng)每周1 d 7次進(jìn)行血糖監(jiān)測(cè)，NC組血糖波動(dòng)在4.5～6.5 mmol/L，DS組19.5～25.6 mmol/L，DF組6.4～30.5 mmol/L。12周末測(cè)3組大鼠糖化血紅蛋白(HbA1c)，與NC組相比，DS組和DF組的HbA1c顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與DS組相比，DF組HbA1C稍降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.312周末坐骨神經(jīng)MNCV與NC組相比，DS組和DF組的MNCV明顯減慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與DS組相比，DF組MNCV明顯減慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4第12周氧化應(yīng)激指標(biāo)與NC組相比，DS和DF組MDA水平明顯升高，GSH水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與DS組相比，DF組MDA表達(dá)水平升高，GSH水平表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2　血糖波動(dòng)12周坐骨神經(jīng)MNCV，血MDA、

注：與NC組比較，dP<0.05；與DS組比較，eP<0.05。

3討論

目前研究認(rèn)為糖尿病神經(jīng)病變的機(jī)制主要是高糖毒性、氧化應(yīng)激、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、微血管病變及自身免疫等多因素相互作用，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷，神經(jīng)纖維缺血性脫髓鞘，引起神經(jīng)病變，其中氧化應(yīng)激是神經(jīng)病變的核心機(jī)制。神經(jīng)組織對(duì)氧化應(yīng)激高度敏感，其核心是高糖環(huán)境下線粒體呼吸鏈中活性氧生成過(guò)多，引起氧化應(yīng)激，造成神經(jīng)炎癥、細(xì)胞凋亡導(dǎo)致神經(jīng)損傷[1]。近年研究表明，在HbA1C相同的情況下，血糖波動(dòng)較大者發(fā)生慢性并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)增加[4]。研究發(fā)現(xiàn)，慢性間斷高血糖與持續(xù)高血糖相比，更能引起心肌細(xì)胞、胰島細(xì)胞的凋亡，其氧化應(yīng)激水平更高[5-6]；波動(dòng)高血糖較持續(xù)高血糖更能提高氧化應(yīng)激水平，促進(jìn)腎臟系膜細(xì)胞的凋亡[7]；此外血糖波動(dòng)是死亡率一個(gè)重要的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)[8]。為此本實(shí)驗(yàn)錯(cuò)時(shí)腹腔注射胰島素及葡萄糖，造成1 d內(nèi)血糖最大波動(dòng)幅度，建立血糖波動(dòng)模型，探索血糖波動(dòng)對(duì)糖尿病神經(jīng)病變的影響及可能機(jī)制。

丙二醛(MDA)反映脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，可間接反映細(xì)胞損傷的程度；谷胱甘肽(GSH)是一種低分子自由基、過(guò)氧化氫和脂質(zhì)過(guò)氧化物清除劑，起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用，故MDA、GSH是重要的氧化應(yīng)激標(biāo)志物，提示機(jī)體氧化應(yīng)激水平。本實(shí)驗(yàn)中，與正常組相比，DS及DF組MDA水平顯著增高(P<0.05)，GSH水平明顯下降(P<0.05)，提示穩(wěn)定性高血糖和波動(dòng)性高血糖糖尿病大鼠較正常大鼠氧化應(yīng)激水平明顯增高；與DS組相比，DF組MDA水平升高、GSH水平下降更明顯(P<0.05)，提示血糖波動(dòng)較穩(wěn)定高血糖可加劇糖尿病機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

神經(jīng)傳導(dǎo)速度代表有髓神經(jīng)纖維的功能，已經(jīng)成為診斷周?chē)窠?jīng)病變的“金標(biāo)準(zhǔn)”。與正常組相比，DS組及DF組大鼠坐骨神經(jīng)MNCV明顯減慢(P<0.05)，提示穩(wěn)定高血糖組和波動(dòng)高血糖組大鼠較正常對(duì)照組其神經(jīng)功能?chē)?yán)重受損。與DS組相比，DF組坐骨神經(jīng)MNCV進(jìn)一步減慢(P<0.05)，提示血糖波動(dòng)可加劇神經(jīng)功能受損，加重神經(jīng)病變。

綜上所述，高血糖情況下氧化應(yīng)激是神經(jīng)病變的核心機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果波動(dòng)高血糖組較穩(wěn)定高血糖組有更高的氧化應(yīng)激水平，坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度也進(jìn)一步減慢，提示血糖波動(dòng)可加重神經(jīng)病變，其機(jī)制可能與血糖波動(dòng)增加氧化應(yīng)激水平有關(guān)，因此避免血糖波動(dòng)已成為糖尿病患者治療面臨的又一新挑戰(zhàn)。

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Effects of oscillating blood glucose level on oxidative stress and diabetic neuropathy in diabetic rats

Ma Xiangxiang，Li Yakun，Chen Huixiao，Zhao Zhigang

(DepartmentofEndocrinologyandMetabolism，thePeople’sHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450003，China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the effects of oscillating blood glucose on oxidative stress and diabetic neuropathy in diabetic rats. MethodsSD rats were randomly divided into 3 groups: normal control group (NC group), diabetes sustained hyperglycemia group (DS group), diabetes fluctutating hyperglycemia group (DF group). Streptozotoein-induced diabetic model was established with SD rats and the oscillating high blood glucose animal model was induced by intraperitoneal injection of insulin and glucose at different time points every day. At the same time, DS group was given the same volume of physiological saline to establish the stable high blood glucose animal model. 12 weeks later,sciatic motor nerve conduction velocity (MNCV), blood malondialdehyde (MDA) and glutathione (GSH) were determined. ResultsCompared with NC group, the DS and DF groups had a significant increase of MDA and a decrease of MNCV, GSH(P<0.05). There was a significant increase of MDA and a decrease of MNCV, GSH in the rats with oscillating blood glucose than those with stable high blood glucose(P<0.05). ConclusionOscillating high blood glucose could induce more severe neuropathy and the mechanism may be related to the increased oxidative stress．

【Key words】diabetic neuropathy；oscillating high blood glucose；oxidative stress

通訊作者：趙志剛，E-mail：mxx123xx@126.com。

【中圖分類(lèi)號(hào)】R 363

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.06.002

(收稿日期：2015-10-21)