響應面法優(yōu)化魷魚墨黑色素的制備工藝

劉顯威，劉淑集，張學勤，肖美添，，吳靖娜，許旻，劉智禹

(1. 福建省水產(chǎn)研究所，國家海水魚類加工技術研發(fā)分中心(廈門)，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門361013；2.福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門 361013；3. 華僑大學化工學院，福建 廈門361021)

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響應面法優(yōu)化魷魚墨黑色素的制備工藝

劉顯威1,2,3，劉淑集1,2，張學勤3，肖美添3，1,2，吳靖娜1,2，許旻1,2，劉智禹1,2

(1. 福建省水產(chǎn)研究所，國家海水魚類加工技術研發(fā)分中心(廈門)，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門361013；2.福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門 361013；3. 華僑大學化工學院，福建 廈門361021)

摘要：為了研究魷魚墨黑色素提取的最佳工藝條件，根據(jù)黑色素特有的性質(zhì)，采用堿溶酸沉法從魷魚墨囊中提取魷魚墨黑色素，在考察NaOH濃度、堿提液料比、堿提溫度、堿提時間、酸沉pH值5個單因素試驗的基礎上，選擇NaOH濃度、堿提液料比、酸沉pH值為自變量，以魷魚墨黑色素的提取率為響應值，利用Design-Expert軟件中的Box-Behnken中心組合設計方法設計3因素3水平試驗方案，通過響應面分析，建立數(shù)學模型，確定魷魚墨黑色素的最佳提取工藝條件是：NaOH濃度為1.18 mol·L-1、堿提液料比為17 ∶1、酸沉pH值為1.85，在此條件下魷魚墨黑色素提取率的理論值16.72 %，驗證實測平均值為16.69 %.通過紅外光譜圖分析結果表明魷魚墨黑色素在3 400 cm-1和1 600 cm-1處有黑色素特有的吸收峰，并且含有羥基、氨基及芳香環(huán)等結構.

關鍵詞：魷魚墨黑色素； 提取率； 響應面分析法

魷魚(Squid)學名槍烏賊[Lolig chinensis(Gray,1849)]，是軟體動物門(Mollusca)頭足綱(Cephalopoda)槍形目(Teuthoidea)槍烏賊科(Loliginidae)的統(tǒng)稱[1].魷魚因其味極鮮美，高蛋白、低脂肪，富含人體必需的氨基酸而倍受人們喜愛，有著“窮人的鮑魚”的美稱[2-4].近年來，我國魷魚產(chǎn)量已躍居世界前列，2014年我國魷魚年產(chǎn)量已達到125.32萬t，魷魚捕撈已成為我國海洋漁業(yè)的重要組成部分[5].我國的魷魚捕撈品種以阿根廷滑柔魚、太平洋褶柔魚和秘魯魷魚3種魷魚為主，這3種魷魚也是我國魷魚加工產(chǎn)業(yè)的主要原料[6].目前，魷魚的加工主要是利用其胴體，加工產(chǎn)品較為多樣，如冷藏制品、干制品、魷魚絲、即食魷魚等[7]，但加工過程中所產(chǎn)生的副產(chǎn)物大部分被拋棄或加工成低值飼料，造成了極大的資源浪費和環(huán)境污染.魷魚加工副產(chǎn)物中墨囊約占魷魚體重的1.3 %[8]，墨囊中的魷魚墨是由黑色粒狀物組成的高密度混懸液，黑色粒狀物分為內(nèi)外兩層，魷魚墨黑色素就存在于內(nèi)核中[9].魷魚墨黑色素具有清除自由基、防紫外線輻射、鰲合重金屬離子等功能[10-11]，在日用輕工業(yè)、食品加工工業(yè)、醫(yī)藥化工、農(nóng)業(yè)等眾多領域應用廣泛[12-14].

魷魚墨黑色素的提取方法目前主要有高速離心法、酸/堿水解法、酶解法.高速離心法操作雖然簡單，但只能去除墨汁中的水溶性雜質(zhì)，不溶于水的雜質(zhì)仍還未被除去，所制備得到的黑色素制品的純度仍不高[15].酸/堿水解法主要是利用在酸性或堿性條件下蛋白質(zhì)被水解為小分子氨基酸，或使脂肪從組織里游離出來，從而分離黑色素.此方法制備的黑色素雖然純度較高，但酸/堿法水解過程過于劇烈，會損傷黑色素的顆粒，不利于黑色素的完整性[16].Liu Yong等[17]的研究表明，強酸水解黑色素會導致其脫除羧基，而且容易使黑色素結合蛋白轉變成類似色素物；強堿處理會導致黑色素的形態(tài)發(fā)生變化.酶解法制備黑色素的優(yōu)點在于酶解條件溫和，不會破壞黑色素的結構及表面形態(tài)，但酶解法無法去除黑色素中其他不被酶解的雜質(zhì)[18].因此本文利用黑色素在堿性條件下可溶解而在酸性條件下會沉淀的特有性質(zhì)來提取魷魚墨黑色素，此方法所制得的黑色素純度較高，而且黑色素結構和表面形態(tài)都未被破壞.在考察魷魚墨黑色素制備的單因素試驗基礎上，利用響應面實驗設計軟件Design Expert version 8.0中的Box-Behnken模式對各主要影響因素之間的單一和交互作用等進行了研究，優(yōu)化了魷魚墨黑色素的制備工藝，得出最佳的制備工藝參數(shù)，這為從魷魚墨囊中提取魷魚墨黑色素的工業(yè)化利用提供了理論基礎.

1材料與方法

1.1材料與儀器材料：魷魚墨囊，由莆田市匯豐食品工業(yè)有限公司提供.

主要試劑：魷魚墨黑色素標準品為生化試劑，Sigma-Aldrich公司；氫氧化鈉、鹽酸等化學試劑均為分析純.

主要儀器：離心機(5804R)，北京博儀恒業(yè)科技發(fā)展有限公司；電熱恒溫水槽(SSW-600-2S)，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；真空冷凍干燥機(SCIENTZ-10N)，寧波新芝生物科技股份有限公司；pH計(FE-20)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；傅立葉變換紅外光譜儀(AVATAR370)，美國Thermo 公司.

1.2試驗方法

1.2.1魷魚墨黑色素的制備工藝魷魚墨囊常溫解凍，5倍體積水浸泡，10 000 r·min-1離心15 min，棄上清液保留沉淀，沉淀真空冷凍干燥，然后稱取沉淀，按一定液料比加入一定濃度的NaOH溶液，放置在一定溫度的水浴鍋中浸提一段時間后，離心，取上清液，用6.00 mol·L-1HCl溶液調(diào)pH至一定值，靜置后，10 000 r·min-1離心15 min，取沉淀水洗3次，將沉淀于真空中冷凍干燥，計算提取率(extraction rate, ER).

1.2.2單因素試驗以魷魚墨黑色素提取率為指標，分別考察NaOH濃度、堿提液料比、堿提溫度、堿提時間、酸沉pH值對提取率的影響.

1.2.3響應面法優(yōu)化分析根據(jù)響應面實驗設計軟件Design Expert version 8.0中的Box-Behnken中心組合設計原理，利用SPSS軟件對單因素試驗結果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，選取差異較為顯著的3因素，即NaOH濃度、堿提液料比、酸沉pH值進行3因素3水平的響應面分析，優(yōu)化魷魚墨黑色素的制備工藝.以魷魚墨黑色素的提取率為響應值(Y)，以NaOH濃度(X1)、堿提液料比(X2)和酸沉pH值(X3)為自變量 ，每一個自變量的試驗水平分別以-1，0，1進行編碼(見表1).

表1　Box-Behnken試驗設計因素及水平

1.2.4魷魚墨黑色素的紅外光譜表征分別稱取約0.1 g KBr固體和0.01 g魷魚墨黑色素置于研缽中，充分研磨后，放在紅外燈下干燥10 min，通過制樣器壓成圓形半透明的片狀物質(zhì)，并將其放入紅外光譜儀中檢測.

2結果與討論

2.1堿溶酸沉法制備魷魚墨黑色素的單因素試驗結果

2.1.1NaOH濃度對魷魚墨黑色素制備的影響固定堿提液料比為20 ∶1，堿提溫度為60 ℃，堿提時間為2 h，離心，取上清液調(diào)節(jié)pH值為1.50，考察NaOH濃度對魷魚墨黑色素提取率的影響，結果如圖1.

由圖1可知，隨著NaOH濃度的增加，魷魚墨黑色素的提取率先升高后降低，NaOH濃度為1.00 mol·L-1時魷魚墨黑色素的提取率最大.隨著NaOH濃度的增加，一些堿溶性雜質(zhì)溶解量會增加，這會影響魷魚墨黑色素在酸沉過程的析出，導致魷魚墨黑色素提取率的降低.因此，選擇NaOH濃度為1.00 mol·L-1來進行試驗優(yōu)化.

2.1.2堿提液料比對魷魚墨黑色素制備的影響固定NaOH濃度為1.00 mol·L-1，堿提溫度為60 ℃，堿提時間為2 h，離心后取上清液，調(diào)節(jié)pH值為1.50，考察堿提液料比對魷魚墨黑色素提取率的影響，結果見圖2.

由圖2可知，隨著液料比的增加，魷魚墨黑色素的提取率先升高后降低，這是因為隨著液料比的增加，內(nèi)外魷魚墨黑色素濃度差就增大，傳質(zhì)推動力就增大，有利于魷魚墨黑色素溶解在堿溶液中，當液料比達到20 ∶1時魷魚墨黑色素的提取率最大.之后，隨著液料比的增加魷魚墨黑色素的提取率在逐漸降低，這可能是因為隨著液料比的增加，魷魚墨中其他堿溶性雜質(zhì)的溶解也在增加，致使墨黑色素被雜質(zhì)包裹，導致墨黑色素在酸沉過程中沉淀量減少，提取率降低.因此，選堿提液料比20 ∶1來進行試驗優(yōu)化.

2.1.3堿提溫度對魷魚墨黑色素制備的影響固定NaOH濃度為1.00 mol·L-1，堿提液料比20 ∶1，堿提時間為2 h，離心后取上清液，調(diào)節(jié)pH值為1.50，考察堿提溫度對魷魚墨黑色素制備的影響，結果如圖3.

根據(jù)傳質(zhì)系數(shù)方程可知，溫度的升高可以增大分子擴散系數(shù)，減小固體表面滯流層厚度，從而有利于提取率的提高.但是溫度升高時不僅目標產(chǎn)物的提取率在增加，同時可溶于提取劑的雜質(zhì)量也在增加[19].由圖3可得，隨著堿提溫度的升高，魷魚墨黑色素的提取率先升高后降低，溫度為40 ℃時魷魚墨黑色素的提取率最大.這可能是因為在堿提過程中，溫度升高會使蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物等雜質(zhì)增多，提取液的粘度增大，從而導致魷魚墨黑色素的提取速率減慢之緣故.同時溫度的升高也可能破壞魷魚墨黑色素的結構，造成魷魚墨黑色素的提取率降低.因此，選擇40 ℃為堿提溫度.

2.1.4堿提時間對魷魚墨黑色素制備的影響固定NaOH濃度為1.00 mol·L-1，堿提液料比為20 ∶1，堿提溫度為60 ℃，離心后取上清，液調(diào)節(jié)pH值為1.50，考察堿提時間對魷魚墨黑色素制備的影響，結果見圖4.

由圖4可得，隨著堿提時間的增加魷魚墨黑色素的提取率先升高后降低，堿提時間為1 h時提取率最大.之后隨著堿提時間的增加，魷魚墨黑色素提取率雖然有所降低，但是其降低幅度較小.因此，選擇1 h為堿提時間.

2.1.5酸沉pH值對魷魚墨黑色素制備的影響固定NaOH濃度為1.00 mol·L-1，堿提液料比為20 ∶1，堿提溫度為60 ℃，堿提時間為2 h，考察酸沉pH值對魷魚墨黑色素制備的影響，結果見圖5.

由圖5可知，隨著酸沉pH值的增加，魷魚墨黑色素的提取率先升高后降低.在酸沉pH=2.00的時候魷魚墨黑色素的得率最大.這可能是因為黑色素含有—COOH和—NH2結構[20]，與蛋白質(zhì)同樣為兩性電解質(zhì)，在pH值為2.00時為黑色素的等電位點，此時黑色素分子以兩性離子形式存在，凈電荷為零，黑色素分子在溶液中因沒有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產(chǎn)生沉淀，在等電點時黑色素溶解度最小，最易形成沉淀物.因此在pH值為2.00時魷魚墨黑色素的提取率最大，故選擇酸沉pH=2.00來進行試驗優(yōu)化.

2.2 響應面分析及試驗結果

2.2.1響應面分析方案及結果在單因素試驗的基礎上，選取NaOH濃度、堿提液料比、酸沉pH值進行3因素3水平的響應面分析，試驗方案及結果見表2.

表2　響應面分析方案及試驗結果

利用Design-expert軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合，得到回歸方程：

對所得的模型及方程系數(shù)進行顯著性分析，結果見表3.從回歸方程可知，各變量對提取率Y的影響順序依次為：酸沉pH值(X3)>NaOH濃度(X1)>堿提液料比(X2)，并且用上述方程來描述各因素和響應值之間的關系時，其因變量和全部自變量之間的線性關系十分顯著(r=1.96/1.97=0.99)，并且模型的R2值為0.994 7，非常接近1，說明通過二次回歸得到的魷魚墨黑色素提取率的模型和實驗擬合較好，并且方程的失擬項不顯著，表明方程實驗誤差小.

表3　響應面ANOVA方差分析

注：“**”表示P< 0.01，差異極顯著；“*”表示P< 0.05，差異顯著.

表4　模型分析

表4的數(shù)據(jù)表明，模型預測R2=0.994 7，校準系數(shù)為0.987 8，說明此模型能解釋98.78%的試驗結果.離散系數(shù)為0.83%說明模型能較好地反應各因素與魷魚墨黑色素提取率之間的真實試驗值，試驗的可靠性高.回歸方程各項的方差分析結果還表明，各具體實驗因子對響應值的影響不是簡單的線性關系.根據(jù)數(shù)據(jù)分析進行回歸分析，并作出響應面圖和等值線圖，分別見圖6—8.

由圖6—8可知，NaOH濃度和堿提液料比、堿提液料比和酸沉pH值的交互作用對魷魚墨黑色素的提取率影響較顯著，其等高線呈橢圓形，響應面均為開口向下的凸形曲線，并且有極值最高點.而NaOH濃度和酸沉pH值等高線圖呈圓形，其交互作用對魷魚墨黑色素的提取率影響不顯著.

2.2.2優(yōu)化條件驗證因此上述回歸方程即可確定魷魚墨黑色素的最佳提取條件.對回歸方程取一階偏導數(shù)等于零，解得方程X1=1.18，X2=16.87，X3=1.85，即提取魷魚墨黑色素的最佳條件為：NaOH濃度為1.18 mol·L-1、堿提液料比為16.87 ∶1、酸沉pH值為1.85.為方便實際生產(chǎn)，現(xiàn)將魷魚墨黑色素制備條件優(yōu)化：NaOH濃度為1.18 mol·L-1、堿提液料比為17∶1、酸沉pH值為1.85.在此條件下，魷魚墨黑色素的提取率理論值可以達到16.72%.

為了驗證分析結果的可靠真實性，采用上述工藝條件進行實驗驗證，三次平行實驗所測得的提取率為16.69%、16.68%、16.70%，接近理論數(shù)據(jù).因此，響應面所得的最優(yōu)工藝參數(shù)準確可靠，具有實際意義.

2.3魷魚墨黑色素的紅外光譜圖將制備的魷魚墨黑色素進行紅外光譜掃描，以魷魚墨黑色素標準品為對照，結果如圖9所示.由圖9可知，兩者在3 300～3 500 cm-1處都有強吸收，表明魷魚墨黑色素含有羥基或氨基結構；兩者在1 651 cm-1和1 515 cm-1處為芳香環(huán)骨架的伸縮振動和CHCH平面振動所產(chǎn)生的峰.Liu Y 等[22]的研究表明，黑色素的紅外光譜在3 μm與6 μm處有特征吸收峰，Mbonyiryivuze[23]和Xin C[24]的研究同樣表明了黑色素的紅外光譜在相同位置有特征吸收峰，因此，可以初步推測所提取的物質(zhì)為魷魚墨黑色素.

3結論

本實驗利用黑色素特有性質(zhì)提取魷魚墨黑色素，通過對單因素試驗的考察確定了NaOH濃度為1.00 mol·L-1、堿提液料比為20 ∶1(mL/g)、堿提溫度為 40 ℃、堿提時間為1 h、酸沉pH 值為2.0的單因素條件，然后選取了NaOH濃度、堿提液料比、酸沉pH值3個因素，進行3因素3水平的響應面試驗，經(jīng)過分析擬合得出可靠的數(shù)學模型二次回歸方程為：

通過對回歸方程的擬合及實際生產(chǎn)條件的優(yōu)化，得出魷魚墨黑色素提取的最適工藝參數(shù)為：NaOH濃度為1.18 mol·L-1、堿提液料比為17 ∶1、酸沉pH值為1.85.在此條件下魷魚墨黑色素的得率為16.69 %.采用紅外光譜對制備的魷魚墨黑色素進行分析，結果表明：所制備的魷魚墨黑色素含有羥基、氨基及芳香環(huán)結構等，與魷魚墨黑色素標準品的結構類似.

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Optimization of Melanin Preparation Conditions from Squid Ink by Response Surface Methodology

Liu Xianwei1,2,3， Liu Shuji1,2， Zhang Xueqin3， Xiao Meitian3，Cai Shuilin1,2， Wu Jingna1,2， Xu Min1,2， Liu Zhiyu1,2

(1.National Research and Development Center for Marine Fish Processing (Xiamen), Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province, Fisheries Research Institute of Fujian, Xiamen 361013, China;2. Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources, Xiamen 361013, China;e of Chemical Engineering, Huaqiao University, Xiamen 361021, China)

Abstract：To obtain the optimization extraction technology condition of squid ink melanin, based on the peculiar nature of melanin, the alkali-solution and acid-isolation method was used to extract melanin from squid ink. After performing the five single-factor tests, which was NaOH concentration, liquid-to-solid ratio, extraction time, extraction temperature, and pH, respectively, NaOH concentration, liquid-to-solid ratio, and pH were used as independent variable. The extraction rate of squid ink melanin was used as an index, and the mathematical regression model was established by Box-Behnken center-united design and response surface methodology (RSM). The RSM results showed that the optimal extraction processing parameters were determined as follows: NaOH concentration, 1.18 mol·L-1; liquid-to-solid ratio, 17:1(mL·g-1); pH, 1.85. Under these conditions, the extraction rate of theoretical value was 16.72 %. The average experimental value after validation was 16.69 %. The analysis result of IR spectrum indicated that there were two characteristic absorption peaks at 3400 cm-1and 1600 cm-1, respectively, which suggested that the extracted melanin contained the structure of hydroxyl, amino, and aromatic.

Keywords：squid ink melanin; extraction rate; response surface methodology

收稿日期：2015-12-07

基金項目：國家海洋公益專項(201305015)；廈門市海洋經(jīng)濟發(fā)展專項 (14CZP041HJ15)

作者簡介：劉顯威(1991-)，男，安徽淮南人，華僑大學化工學院2012級碩士研究生，E-mail:wynlxw@sina.com 通信作者： 劉智禹(1972-)，男，福建莆田人，高級工程師，研究方向：水產(chǎn)品加工與綜合利用，E-mail:13906008638@163.com

文章編號：1004-1729(2016)01-0025-08

中圖分類號：TS 254.9

文獻標志碼：ADOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2016.0005